第六章I 目的基因与载体的连接
目的基因和载体的连接方法
目的基因和载体的连接方法嘿，大家知道吗，目的基因和载体的连接可是生物技术中超级重要的一环啊！那它们到底是怎么连接的呢？这就来详细说说。
首先呢，一般常用的连接方法有粘性末端连接法和平末端连接法。
粘性末端连接法就是利用限制性内切酶切割后产生的粘性末端，让目的基因和载体的粘性末端通过碱基互补配对结合在一起。
在这个过程中，可得注意酶切反应要彻底呀，不然会有未被切开的载体或目的基因，那可就麻烦啦！而且连接反应的条件也要控制好，温度、时间等都不能马虎。
平末端连接法呢，就是把目的基因和载体的平末端通过一些酶的作用连接起来，这也需要精心操作，保证连接的效率和准确性。
然后说说这过程中的安全性和稳定性。
哎呀呀，这可是不能忽视的呀！在操作过程中，要确保所用的试剂和材料都是高质量的，不然出了问题可不得了。
而且整个操作环境也得严格控制，不能有任何污染，不然会影响连接的效果和后续的实验结果呢。
只有保证了安全性和稳定性，才能让我们的实验顺利进行呀！再来讲讲它的应用场景和优势。
这可多了去啦！比如在基因治疗中，就可以通过这种方法把治疗基因连接到载体上，然后导入到患者体内，发挥治疗作用。
还有在转基因技术中，也是通过这种方法把目的基因转到受体生物中。
它的优势就在于能够高效、准确地把目的基因和载体连接起来，为后续的研究和应用打下坚实的基础呀！就拿基因治疗血友病来说吧，通过把正常的凝血因子基因和合适的载体连接起来，再导入到患者体内，就有可能治愈血友病呢！这效果多让人惊叹呀！总之呀，目的基因和载体的连接方法真的是超级重要，超级有用的呀！它为我们探索生命的奥秘，解决各种医学和生物学问题提供了强大的工具和手段。
让我们好好利用它，为人类的健康和科学的进步做出更大的贡献吧！。
分子生物学与基因工程智慧树知到课后章节答案2023年下鲁东大学
分子生物学与基因工程智慧树知到课后章节答案2023年下鲁东大学鲁东大学第一章测试1.分子生物学是研究生物体内分子结构及其相互作用规律的科学答案:错2.分子生物学的准备酝酿阶段人们只针对蛋白质进行了研究答案:错3.分子生物学所研究的生物大分子主要是指答案:核酸和蛋白质4.证明基因就是DNA的Avery是美国的答案:微生物学家5.在DNA分子结构研究中，下列哪位科学家被称为“第三人”答案:威尔金斯6.生物化学家是通过（）来破译遗传密码的答案:三联体-核糖体结合实验7.关于DNA复制机理的认识上，Meselson及Stahl用同位素标记和密度梯度离心技术证实了答案:DNA的半保留复制8.1961年Hall和Spiege-lman用RNA-DNA杂交证明mRNA与DNA序列互补这一研究说明了答案:转录与DNA有关9.中心法则中逆转录的完善是通过哪些科学家的贡献而实现的答案:Howard Temin;David Baltimore10.因遗传工程的奠基性工作而获得诺贝尔奖的是答案:Paul Berg第二章测试1.核酸分为两类,分别为DNA和RNA答案:对2.组成核酸的核糖和脱氧核糖的差别是前者2C位上连接的是一个羟基，后者只连一个H答案:对3.通过Ｔ和Ｕ的存在就可判断是ＤＮＡ还是RNA，组成DNA的碱基--是A、T、U、G，组成RNA的碱基是A、T、C、G 。
答案:错4.核酸是由多个核苷酸聚合而成的多聚核苷酸分子，相邻二个核苷酸之间的连接键是3'，5'-磷酸二酯键答案:对5.在高温下，双链DNA核酸变性，破坏的键是（）答案:氢键6.DNA分子少数是以单链形式存在，绝大多数是双链分子由碱基配对形成的氢键维持，碱基互补配对原则A/T,C/G。
答案:对7.Watson-Crick右手双螺旋结构是（）？答案:Ｂ构型8.DNA碱基对间的氢键也会断裂，双螺旋解开，空间结构破坏，这叫DNA的变异。
答案:错9.变性后的DNA都还具有复性功能，只要消除变性条件，二条互补链就会重新结合，恢复成原来的双螺旋结构。
I目的基因与载体的连接课件
为了将目的基因重组于载体分子之中，需要将载 体DNA和目的基因分别进行适当处理，使其可以互 相连接，形成新的重组分子。 1.对载体的要求： 一般采用限制性内切酶法将载体DNA分子切割成可 与外源基因连接的线性分子.载体DNA通常有着许 多酶切位点．但是并不是所有的酶切位点都可用于 重组切割，理想的酶切位点应该符合下列几个条件: 1） 位于载体上特定的酶切位点要尽可能少,最好是 单一酶切位点,这样才能保证目的基因和载体DNA 以最高的几率正确组合.
(2) 对某一基因的上游序列进行调控机能分析， 则需考虑选择适当的报告基因，并将可能
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一 是 作 为 领 导干部 一定要 树立正 确的权 力观和 科学的 发展观 ，权力 必须为 职工群 众谋利 益，绝 不能为 个人或 少数人 谋取私 利
具有调控机能的目的基因置于报告基因 的上游适当位置。 ➢ 若调控基因可能有增强子（其特点一 是位置变化大、二是其作用无明显方 向性）作用，还应在报告基因下游适 当部位设计一个插入位点，以插入一 个功能基因，由此反映增强子的作用。
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一 是 作 为 领 导干部 一定要 树立正 确的权 力观和 科学的 发展观 ，权力 必须为 职工群 众谋利 益，绝 不能为 个人或 少数人 谋取私 利
2、连接前的准备：
依不同的研究目的而定，认真设计最终构 建的重组体分子。需要考虑下列2个方面。 如果研究目的是：
(1) 表达有价值的蛋白质，要考虑选用适当的启 动子、增强子等调节序列和终止序列，要将目 的基因置于启动子的转录起始点的下游，并审 视“阅读框”是否正确，这些对表达融合蛋白 至关重要。
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一 是 作 为 领 导干部 一定要 树立正 确的权 力观和 科学的 发展观 ，权力 必须为 职工群 众谋利 益，绝 不能为 个人或 少数人 谋取私 利
目的基因与载体的连接原理
目的基因与载体的连接原理基因工程技术是一门新兴的生物学技术领域，它可以实现对DNA 的重组和改造，以达到人为控制生物体遗传特征的目的。
而目的基因与载体的连接是基因工程技术的关键步骤之一，本文将介绍目的基因与载体的连接原理，并探讨其在基因工程研究和应用中的重要性。
一、目的基因与载体的定义1.目的基因：目的基因是指在基因工程中需要进行重组或改造的特定基因，可以是来自不同生物体的DNA片段，也可以是人工合成的基因序列。
目的基因在基因工程中扮演着重要的角色，它可以被用来改变生物体的遗传特征，实现特定的功能。
2.载体：载体是用来携带目的基因和将其导入宿主细胞的工具，通常是一种质粒或病毒。
载体具有自我复制和传递目的基因的能力，可以通过转化或转染等方式将目的基因导入宿主细胞中，从而实现基因工程的目的。
二、目的基因与载体的连接原理目的基因与载体的连接是基因工程技术中至关重要的一环，它需要遵循一定的原理和方法才能有效实现。
1.选择适当的限制酶：限制酶是一类具有特异性切割DNA序列的酶，可以识别特定的核酸序列并在其附近切割DNA链。
在目的基因与载体的连接中，首先要选择适当的限制酶来切割目的基因和载体的DNA，以产生黏端或平端。
2.生成互补的黏端：在目的基因和载体的DNA被限制酶切割之后，通常会在切口的末端产生黏端或平端。
对于产生黏端的DNA，可以利用DNA连接酶将其与互补的黏端DNA连接起来，从而实现目的基因与载体的连接。
3.确定连接是否成功：连接酶可以将目的基因与载体的DNA连接起来，但如何确定连接是否成功也是至关重要的。
通常可以通过PCR扩增、酶切鉴定、测序等方法来验证目的基因与载体的连接是否成功。
三、目的基因与载体连接在基因工程中的应用目的基因与载体的连接技术在基因工程研究和应用中具有广泛的应用价值，其中涉及到重组蛋白表达、基因敲除、基因转移等多个领域。
1.重组蛋白表达：在基因工程中，可以利用目的基因与载体的连接技术将感兴趣的基因导入受体细胞中，从而实现重组蛋白的大规模表达。
第六章 目的基因与载体DNA的连接th
3,不规则粘性末端 , 用机械切割法制备的DNA片段,或化学合成 片段, 用机械切割法制备的 片段 片段, 的DNA片段,所产生的粘性末端,不互补. 片段 所产生的粘性末端,不互补. 一般转化为平末端进行连接. 转化为平末端进行连接 一般转化为平末端进行连接. 采用常规的直接连接. 采用常规的直接连接. 步骤: 步骤: 核酸酶处理 (1)S1核酸酶处理,使之变成平末端,或 ) 核酸酶处理,使之变成平末端, 用聚合酶补平成平末端; 用聚合酶补平成平末端; 连接酶连接平末端. (2)T4DNA连接酶连接平末端. ) 连接酶连接平末端
一,粘性末端DNA的连接 粘性末端 的连接
1,单酶切粘性末端 , 2,双酶切粘性末端 , 3,不规则粘性末端 ,
1,单酶切粘性末端 , 仅有一种限制性核酸内切酶酶切产生的粘性 末端, 末端,如EcoR Ⅰ
限制性内切酶
限制 酶 EcoR Ⅰ
同种内切酶生产的粘性末端的连接
5' GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 5'
T4-DNA ligase
5' 5' TGATCC ACTAGG TGATCC ACTAGG GGATCA CCTAGT GGATCA CCTAGT
5' 5'
非同尾酶产生的粘性末端的连接
5' CTGCAG GACGTC GGATCC CCTAGG 5' 5' CTGCAG GACGTC GGATCC CCTAGG 5'
连接方式(基因与载体 的结构特点) 连接方式(基因与载体DNA的结构特点) 的结构特点
粘性末端DNA的连接 一,粘性末端 的连接 1,单酶切粘性末端 , 2,双酶切粘性末端 , 3,不规则粘性末端 , 平末端DNA的连接 二,平末端 的连接 1,直接连接法 , 2,同聚物加尾法 , 3,衔接物连接法 , 4,DNA接头连接法 , 接头连接法 5,PCR法引入酶切位点的连接 , 法引入酶切位点的连接
I目的基因与载体的连接
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总结：
同聚物加尾法就是利用末端转移酶 的可催化dNTP加到单链或双链DNA 的３′-OH的能力，在目的DNA和质 粒载体上加入互补同聚物，两者再通 过互补同聚物间的氢键，形成重组子。
h
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优点：通过DNA加尾，既可以使两个 具平末端的DNA片段进行连接，也可 以使具平末端的DNA片段与粘性末端 的DNA片段进行连接。
多酶切位点．但是并不是所有的酶切位点都可用于
重组切割，理想的酶切位点应该符合下列几个条件:
1） 位于载体上特定的酶切位点要尽可能少,最好是
单一酶切位点,这样才能保证目的基因和载体DNA
以最高的几率正确组合.
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h
7
h
8
① 3‘凹端补平：使用大肠杆菌DNA聚
合酶I Klenow片段部分补平3’凹端，将
不匹配的3‘凹端转换为粘端；或者完全
补平，产生平端DNA分子，可与任何其
他平端DNA相连接。
5‘
3‘
3‘
5'
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② 3‘突端切除：T4噬菌体DNA聚合酶具 有强烈的3’-5’外切核酸酶活性，可将 3‘突端切除。
③ 平端加上人工合成接头：合成接头是 自相互补的两个化学合成的寡核苷酸的 等摩尔混合物，而两个寡聚体可形成带 一个或多个限制性酶切位点的平端双链 体。因此在平端DNA加接头可为其亚克 隆操作增加一个或多个限制性酶切位点。
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4
转录
起始 点
插入功能基因
的位点
启动子 操纵子
表达
目的
基因
目的基因片段与载体连接
目的基因片段与载体连接全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：目的基因片段与载体连接是分子生物学领域中常见的实验操作，它是为了将感兴趣的基因片段插入载体中，以便在细胞或生物体内进行研究和表达。
这一过程是基因工程、基因克隆和表达的基础步骤之一，对于揭示基因功能、疾病研究以及生物技术应用具有重要意义。
为了实现目的基因片段与载体的连接，研究人员通常采用多种方法和技术。
其中最常用的方法是利用酶切和连接技术。
酶切是指使用特定的限制性内切酶切割DNA，将基因片段和载体进行切割，以便于它们能够形成互补的粘性末端。
连接过程中需要使用DNA连接酶将目的基因片段与载体连接在一起，形成一个完整的重组DNA分子。
连接过程分为以下几个步骤：1. 酶切：首先需要使用适当的限制性内切酶对目的基因片段和载体进行酶切，生成具有粘性末端的DNA片段。
2. 处理：将酶切后的目的基因片段和载体经过处理，以去除杂质和保持DNA稳定性。
3. 连接：在连接反应中，目的基因片段和载体通过DNA连接酶的作用，将它们连接在一起。
这种连接通常是在适当的实验条件下进行，以确保连接的可靠性和效率。
4. 转化：将连接好的重组DNA分子引入宿主细胞中，通常通过转化的方式实现。
转化是指利用细胞膜通透性增加的方法，将DNA分子引入细胞内，使其在细胞内表达。
除了酶切和连接技术外，还有其他方法可以实现目的基因片段与载体连接，如PCR扩增、梯度离心、化学连接等。
这些方法各有特点，研究人员根据实验需要和经验选择最适合的连接方法。
目的基因片段与载体连接的成功与否直接影响到后续的实验结果和研究进展。
在连接过程中，需要严格控制实验条件、操作技术和试剂质量，避免出现非特异性连接或连接失败的情况。
合理设计连接实验方案、选择合适的酶切位点和优化连接条件也是确保连接成功的关键。
目的基因片段与载体连接是基因工程和分子生物学研究中至关重要的步骤，它为科学家提供了有效的手段，揭示基因功能、探索生命奥秘。
目的基因与载体的连接原理
目的基因与载体的连接原理
(1)黏性未端连接:将靶基因片段和载体DNA经相同的限制酶分别切割,使它们两端产生相同的黏性未端。
然后经黏性未端碱基配对,再经DNA连接酶作用,共价连接成新的重组DNA分子;(2)平头末端连接:将平末端的DNA分子在T4DNA连接酶催化下,使DNA 分子的3'OH和5"P进行共价结合;(3)人工接头法: 是指利用人工接头加在平端DNA片段的两端,然后用相应限制酶切割人工接头以产生黏性末端,再与带相同黏性未端的载体相连;(4)同源多聚尾连接法:在末端脱氧核苷酸转移酶催化下,在线型载体分子的两端加上单一核苷酸如dG组成的多聚尾;而在目的DNA分子的两端加上dC尾,两者混合退火,然后经DNA聚合酶I或Klenow填补裂口处缺失的核苷酸,再通过DNA连接酶修复成环状的双链DNA。
载体与目的基因的连接与转化以及重组DNA的提取与酶切鉴定
实验一载体与目的基因的连接与转化以及重组DNA的提取与酶切鉴定一、实验目的1.CaCl2法制备感受态细胞2.目的基因与载体连接（c-myc+pSV2；粘端连接）3.重组质粒转化大肠杆菌并筛选转化体（HB101；Amp r）4.质粒DNA的小量快速制备5.质粒DNA的限制性内切酶酶切6.DNA的琼脂糖凝胶电泳二、实验原理通过粘端连接法将具有相同粘性末端的DNA分子连接在一起，通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构，利用连接酶发挥间断修复的功能，从而获得重组的DNA分子。
受体细胞经处理后（电击或CaCl2等处理），细胞膜通透性发生变化，从而使外源的载体分子通过感受态细胞，并使受体细胞获得新的稳定遗传的性状，该过程称为转化。
由于本实验种pSV带有抗氨苄青霉素的基因，因而转化后的细胞在含氨苄青霉素的平板上培养可以筛选出转化成功的受体细胞。
分离质粒DNA的步骤包括：培养细菌使质粒扩增、收集和裂解细菌以及分离和纯化质粒DNA。
SDS可以使细胞壁裂解，碱变性抽提质粒DNA的原理是利用染色体DNA与质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的，当pH＞12.6时，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA由于超螺旋共价闭合环状结构，两条互补链不会完全分离。
当采用pH 4.8的NaAc高盐缓冲液调节pH至中性时，质粒DNA恢复原有的构型，而染色体DNA则不能复性而缠绕形成网状结构。
通过离心可将染色体DNA及大分子RNA、蛋白质等去除。
三、实验器材和试剂１.器材恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴、台式离心机、低温离心机、涡旋振荡器、移液枪及枪头、1.5 ml离心管、制冰机、三角推棒、酒精灯、细菌培养管、电泳槽及电泳仪、凝胶成像系统等。
2.试剂1）用BamH I和Xba I处理的线状pSV质粒DNA（20 ng/ul）2）用BamH I和Xba I处理的4.8 kb c-myc DNA片段（20 ng/ul）3）已连接好c-myc目的片段的pSV重组质粒DNA（5 ng/ul）4）T4 DNA连接酶（5 U/ul）及10×连接酶缓冲液（Thermo公司）5）LB培养基以及含琼脂的LB培养基铺制的平板（含抗生素）6）0.1 mol/L CaCl2溶液7）AxyPrep质粒DNA小量试剂盒（Axygen公司产品）8）无水乙醇9）BamH I（10 ug/ul）及Xbal I（10 ug/ul）（NEB公司产品）10）10×Buffer 4（NEB公司产品）11）1×TAE（0.04 mol/L Tris-乙酸；0.001 mol/L EDTA）12）γDNA Hind III Markers（0.1 ug/ul）（Thermo公司）13）6×凝胶加样缓冲液（0.25%溴酚蓝；40%（w/v）蔗糖水溶液）14）氨苄青霉素储存液（100 mg/ml）15）CelRed核酸染料（10000×in water）（Biotium公司产品）四、实验步骤1.目的基因c-myc与pSV质粒载体的连接目的基因片段（4.8 kb），25 ng/ul 4 ul载体DNA（3.5 kb），25 ng/ul 4 ul10×buffer 1 ulT4 DNA连接酶（5 U/ul）0.5 ulddH2O 0.5 ul总体积：10 ul混匀，16℃水浴锅温浴2. CaCl2法制备感受态细胞1）取0.1 ml大肠杆菌HB101培养物，加至3 ml LB培养液中，37℃振摇约2 h，细胞长至云雾状。
(二)目的基因与载体的连接
P
5`
3`
3`
OH
5`
连接酶
5`
3`
3`
5`
3、逆转录酶
（一）概述 逆转录酶也称反转录酶或RNA依赖的DNA聚合酶 （ RNA dependent DNA polymerase,RDDP ） 。 是 由 Baltimove从鼠白血病病毒（murine leukemia virus,MLV）和 Mizutan从 劳氏 肉瘤 病 毒 (Rous sarcoma virus,RSV) 中， 于 1970 年 分 别 各 自 发 现 的 ， 这 两 个 小 组 论 文 同 时 在 同 一 期 Nature上，可见其意义。该酶在逆转录病毒（retro virus）生 产循环中起主宰作用。
教学内容
1．工具酶 ①限制性核酸内切酶；②修饰酶（DNA聚合酶、逆转录酶、 T4DNA聚合酶、末端脱氧核苷酸转移酶。） 2．载体 ①常用的克隆载体（质粒、噬菌体、病毒）；②表达载体 3．重组DNA技术的基本过程 ①目的基因的制备 ②载体的选择和制备 ③DNA的体外连接 ④将外源DNA导入宿生细胞 ⑤目的基因的筛选和鉴定 4．克隆基因的表达 ①克隆基因在大肠杆菌中的表达 ②克隆基因在哺乳动物细胞中的表达基Βιβλιοθήκη 基因工程因 有 关 的
分子杂交 聚合酶链反应 DNA序列测定
操
转基因动物
作
克隆动物
技
基因剔除技术
术
基因诊断和基因治疗
第一节 基因工程
重组DNA技术的发展史
1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工
第六章重组体的筛选与鉴定
一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应
1.以 1.以pBR322质粒为例 质粒为例
（1）pBR322质粒的一般特性 质粒的一般特性 在pBR322质粒上有两个抗生素基因，Ampr基因内有 pBR322质粒上有两个抗生素基因， 质粒上有两个抗生素基因 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点， PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 BamHⅠ 两种限制性核酸内切酶单一 位点。 位点。
如下图所示
一、根据载体表特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法
Ampr pBR322 Tetr AmprTetr
菌落原位影印
pBR322
+
pBR322
AmprTets
Amp琼脂平板 琼脂平板
Tet琼脂平板 琼脂平板
图 应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法 1.乳糖操纵子的结构 1.乳糖操纵子的结构
二、根据插入基因遗传性状的筛选 (一)原理 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后, DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后,如果 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 达,而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 互补 (二)举例 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时,将该基因 亮氨酸的基因 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用 能利用表达产物亮 少亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用表达产物亮 氨酸的细菌才能生长 因此,获得的转化子都是重组子 生长, 转化子都是重组子. 氨酸的细菌才能生长,因此,获得的转化子都是重组子.
DNA重组的操作PPT课件
不足：
目的基因的正反向插入 载体或目的基因片段会自身环化 载体与多个目的基因片段之间重组
.
5
（二）不同种酶产生的黏性末端的连接
.
6
二、平末端（blunt end）的连接
（一） 直接连接
T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低， 只有粘性末端的1~10%。
5’ P3’ HO-
-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-
平末端连接存在一些缺陷：
（1）连接效率低； （2）破坏限制性内切酶原有的识别位点； （3） 插入没有方向性； （4） 高底物浓度下会产生多拷贝外源片段插 入载体。
（二） 人工加尾形成 “粘性末端”
（1）同聚物加尾法
① 原理： DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA 的3’-OH端加上脱氧核苷酸。
3-’ 互补序列 复性
GCTAGCCGG -5’ BamH I 位点
5’
模板
3’- 互补序列 GCTAGCCGG -5’
延伸
5’
模板
3’-
PCR产物 互补序列
.
GCTAGCCGG -5’ 20
带酶切位点的PCR产物
5’- GCAGAATTC PCR产物 GGATCCGCG -3’
3’- CGTCTTAAG PCR产物 CCTAGGCGC -5’
T4 ligase
nick缺口
5’HO-GATCCCGGGGCC
CCGG -GGCCCTAG-OH5’
nick缺口
虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接
T4多核苷酸激酶处理使5’磷酸化
三、PCR产物的连接
1.在引物的5’端设计酶切位点
（1）设计原则 符合载体的多克隆位点；
6基因与载体连接
PCR产物
载体
dNTP A
Taq DNA聚合酶 dTTP
A
T
T
TA TA
二）DNA体外连接应注意的事项
1. 插入片断与载体的酶切位点互补 相同的粘性末端才能有效地连接 尽量避免平端连接 决不能进行非粘性末端连接
（1）用相同的酶切
（2）用同尾酶切 BamH I、Bcl I、Bgl II 、Sau3A I、XhoII
EcoRI
ATGG AATTC 载体
EcoRI
ATGCGG AATTC T 插入片断
ATGG AATTC T 重组 但移码突变！
4. 防止载体自身环化连接
（1）提高插入片断的用量
连接反应体系中，插入片断比载体多 10 倍以上。
（2）用碱性磷酸酶处理载体
载体切口的5' 磷酸被除去，不能自我连 接。但可以与插入片断以单链连接。
③优点：
能把任何 片段连接 起来
④缺点：
不能把 插入片 段再切 下来。
非酶切位点
5‘突出的末端 外源片段先用Klenow补平；然后用TdT补加polyC；
载体片段也用Klenow补平，加polyG，退火不经连接即
可转化。目的是：不使酶切位点遭受破坏。
外源基因 5‘
3‘ TdT ployC
5‘ CCCCC
③优点： 连上后就能用。
④缺点：
接头与接头会彼此以粘性末端接在一起， 影响与DNA片段的连接。
⑤防止自我连接 先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP ）处理接头， 水解掉其5'端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）
P-CCGG-OH HO-GGCC CTAG -P5'
目的基因与载体连接PPT课件
病毒载体大都含有较强的启动子，能保证插入的 外源基因有效转录和表达，且转染的效率要高于转化， 因而也长作为目的基因的表达载体。
第9页/共29页
第三节 连接前的处理
第23页/共29页
第六节 人工接头连接
人工接头（衔接物或适配子）：指人工合成的具 有一个或是个特定限制性内切酶识别和切割序列的双 股平端DNA短序列。其分子长度约为8-12bp，具有一定 碱基序列，在其序列内具有一个或多个限制性内切酶 识别位点。利用人工合成的接头可以很方便地将具有 平端的DNA片段结合到可怜载体上。
一般用连接酶将人工接头连接到外源片段的两端， 利用内切酶切割成黏性末端，最后利用连接酶连接。 此方法适用于没有所需限制酶切位点的外源片段。
第24页/共29页
1、人工接头连接平端的DNA片段（图） 2、人工接头连接黏端的DNA片段
注意：人工接头的选择要以外源片段上的限制酶 识别位点为主，要避免二者具有相同的酶切位点，都 在会给后续其它操作带来麻烦。
酸（添加同聚物造成延伸部分）。 如果把所需要的DNA片段加上低聚腺嘌呤核苷酸
（dA），而把载体分子接上低聚胸腺嘧啶核苷酸 （dT），那么由于二者之间能形成氢键互补，同样可
（3）、克服载体自身的环化：连接过程中，载体自 身除了环化外，还能形成串联寡聚物。
用高浓度的DNA（目的基因：载体为3：1）和牛 小肠碱性磷酸酶（CIP）处理载体，去除5’－P使之 不能自身环化，缺口在宿主内可得到修复。图
第18页/共29页
三、双酶切片段的定向克隆 以两种不同的限制性内切酶切割目的基因，使之
第六章 目的基因获取和DNA重组
DNA片段的组装连接方法有2种：
第一种方法：粘末端连接法
第 二 种 方 法二、 基因法获取目的基因即直接从基因中生物基因组所程
第一节 目的基因的获得
获得目的基因的方法：主要有4种 1
一、基因合成技术
基因合成，指利用4种单体脱氧核糖核苷酸 (Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ），通过化学反应，合成出一 条与已知基因序列完全相同的DNA链。
对不参加反应的集团加保护基
◆合成过程使用的保护基团，有些可以通过酸处理 移去，有的可通过碱处理移去。所以不论是5′端 的保护基团、还是3′端的保护基团，都可以通过 酸或碱的脱保护，消除掉保护集团。这样的一个 带有5′端保护的合成的二核苷酸分子，又可以同 下一个带3′端保护的单核苷酸或二核苷酸进行第 二次缩合反应，形成一个三核苷酸或四核苷酸分 子，这种从缩合反应开始，到保护基团消除，进 而再进行新的缩合反应的循环周期库是一项十分繁重的工作，一般的 基因工程实验室都难以完成此亿碱基对，即3×106kb. (2)常用的克隆载体质粒、λ噬菌体和COS质粒克隆外 源DNA的能力分别为15kb、25kb和45kb. （3）选取克隆能力最大的COS质粒载体，则需要构建 至少6.8万个克隆才可能包含整个人的基因组DNA
（2）mRNA的纯化和完整性鉴定
在典型的哺乳动物细胞中含有10000～30000种不同的 mRNA序列，但并不是任一基因的mRNA在每一细胞中都有同样 的转录数量，在特定的mRNA分子集群中，有些基因的mRNA数 量很高，而另一些基因的mRNA数量却很低，例如编码像珠蛋 白、免疫球蛋白质和卵清蛋白的mRNA，占特定类型的分化细 胞总mRNA的50%～90%，属高丰度mRNA，而相当数量的其它基 因mRNA的含量在细胞总mRNA中少于0.5%，属低丰度mRNA或稀 有mRNA。 对高丰度mRNA来讲，其所对应的A之前不需要进一步纯化和富集。但对低丰度mRNA的分离 则需要采用特殊是脱氧核糖核苷三磷酸为合成原材料。
目的基因与载体的连接实验注意事项
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第六章I_目的基因与载体的连接
（一）粘性末端DNA片段的连接
1. 同一限制酶切位点连接: 由同一限制性核酸内切酶 切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要①酶 切割产生单链突出的粘性末端②酶切位点附近的DNA 序列不影响连接 .在连接酶的作用下即可形成重组 DNA分子. 1) 上述方法的缺点：由限制酶产生的具有粘性末端 的载体DNA分子，在连接反应中常发生自我环化作 用，并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合 环状结构。 2) 解决方法：用细菌的碱性磷酸酶预先处理线性的载 体DNA分子，去除其5‘末端的磷酸基。
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第五章 复习题
一、填空题 1、若表达有价值的蛋白质，应考虑选用适当 的启动子、增强子等调节序列和终止序列， 要将目的基因置于启动子的转录起始点 的 位置，并审视“阅读框”是否正 确。 2、若对某一基因的上游序列进行调控机能分 析， 则需考虑选择适当的报告基因，并将可
③ 平端加上人工合成接头：合成接头是 自相互补的两个化学合成的寡核苷酸的 等摩尔混合物，而两个寡聚体可形成带 一个或多个限制性酶切位点的平端双链 体。因此在平端DNA加接头可为其亚克 隆操作增加一个或多个限制性酶切位点。
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三．基因与载体的连接(5种方法)
载体DNA和目的基因DNA的连接,按 DNA片段末端性质不同，可有下述不同的 连接方法： ① 粘性末端连接法 ② 平端连接法 ③ 同聚物加尾连接法 ④ 人工接头连接法 ⑤ 加衔接物连接法
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（五）加DNA衔接物连接法
DNA衔接物也是人工合成的一小段双链寡 核苷酸，与人工接头不同的是一头为平整 末端（与双链目的DNA平端连接），另一 头带有某种限制酶的粘性末端（与载体的 相应粘端连接）。它在与双链目的DNA连 接后无需限制酶消化，便可与去磷酸化载 体DNA进行连接反应，如图所示。
(二)目的基因与载体的连接
（3）5′→3′外切酶活性 从游离的5’端降解 dsDNA成单核苷酸或寡核苷酸，也降解DNA:RNA 杂交体RNA成分（具有RnaseH活性）
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段－Klenow片段酶
双链DNA
试管内合成cDNA
cDNA complementary DNA 以mRNA为模板，经逆转
录合成的与mRNA碱基序列互 补的DNA链。
分子生物学研究可应用逆 转录酶，作为获取基因工程目 的基因的重要方法之一，此法 称为cDNA法。
AAAA
逆转录酶
A AA A TTTT
碱水解
TTTT
DNA聚合酶Ⅰ
基 因工程 很多 情况下 ， E.coli DNA polⅠ 可用 它的1个大片 段 Klenow片段酶代替。该酶是枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解E.coli DNA polⅠ所得到的。 1.Klenow大片段是一条多肽链，MW76KD，保留了E.coli pol Ⅰ 的5′→3′DNA聚合酶，3′→5′外切酶活性。 2. Klenow在基因工程用于：
基
基因工程
因 有 关 的
分子杂交 聚合酶链反应 DNA序列测定
操
转基因动物
作
克隆动物
技
基因剔除技术
术
基因诊断和基因治疗
第一节 基因工程
重组DNA技术的发展史
1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工
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2、连接前的处理：末端的转换
当载体和外源DNA用同样的限制性内切 酶，或是用能够产生相同的粘性末端的同 裂酶等切割时，所形成的DNA末端就能够 彼此退火（相匹配、相配伍），可以被T4 连接酶共价地连接起来，形成重组体分子。
但是,当靶片段的末端与载体不匹配时，必 须转换其中一个或两个片段的末端形式以 便使之连接。这种末端的转换通常用以下 三种方式转换：
① 粘性末端连接法 ② 平端连接法 ③ 同聚物加尾连接法 ④ 人工接头连接法 ⑤ 加衔接物连接法
（一）粘性末端DNA片段的连接
1. 同一限制酶切位点连接: 由同一限制性核酸内切酶 切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要①酶 切割产生单链突出的粘性末端②酶切位点附近的DNA 序列不影响连接 .在连接酶的作用下即可形成重组 DNA分子.
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2、连接前的准备：
依不同的研究目的而定，认真设计最终构 建的重组体分子。需要考虑下列2个方面。 如果研究目的是：
(1) 表达有价值的蛋白质，要考虑选用适当的启 动子、增强子等调节序列和终止序列，要将目 的基因置于启动子的转录起始点的下游，并审 视“阅读框”是否正确，这些对表达融合蛋白 至关重要。
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（三）同聚物加尾法
末端脱氧核苷酸转移酶的作用底物可以是具 3′-OH末端的单链片段，也可以是具3'OH突出末端的双链片段。
此酶在不需要模板链的情况下，就能将脱氧 核苷酸加到单链的3‘-OH基团上，并按 5’→3’方向聚合。
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① 3‘凹端补平：使用大肠杆菌DNA聚
合酶I Klenow片段部分补平3’凹端，将
不匹配的3‘凹端转换为粘端；或者完全
补平，产生平端DNA分子，可与任何其
他平端DNA相连接。
5‘
3‘3‘5'屈艾制作9② 3‘突端切除：T4噬菌体DNA聚合酶具 有强烈的3’-5’外切核酸酶活性，可将 3‘突端切除。
4
转录
起始 点
插入功能基因
的位点
启动子 操纵子
表达
目的
基因
5’
调控
报告基因
机能
基因
3’
5
二、连接前的处理
为了将目的基因重组于载体分子之中，需要将载 体DNA和目的基因分别进行适当处理，使其可以互 相连接，形成新的重组分子。 1.对载体的要求： 一般采用限制性内切酶法将载体DNA分子切割成可 与外源基因连接的线性分子.载体DNA通常有着许 多酶切位点．但是并不是所有的酶切位点都可用于 重组切割，理想的酶切位点应该符合下列几个条件: 1） 位于载体上特定的酶切位点要尽可能少,最好是 单一酶切位点,这样才能保证目的基因和载体DNA 以最高的几率正确组合.
1) 上述方法的缺点：由限制酶产生的具有粘性末端 的载体DNA分子，在连接反应中常发生自我环化作 用，并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合 环状结构。
2) 解决方法：用细菌的碱性磷酸酶预先处理线性的载 体DNA分子，去除其5‘末端的磷酸基。
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故在平端DNA片段连接工作中，常增加 DNA的浓度，同时用数倍于粘性末端连接 的连接酶处理，以期获得比较满意的连接 结果。
有时载体DNA片段是平末端，而目的基因 却是粘性末端，那就需要处理，使载体 DNA和目的基因的末端一致，通常是将目 的基因的粘性末端修饰成平末端，即添补 法和消除法。
第6章I 目的基因与载体 的连接（重组）
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一.基因重组—基因工程的核心
1、 外源DNA片段同载体分子连接的方法，即 DNA分子体外重组技术，主要是依赖于限制 性核酸内切酶和DNA连接酶的作用.
基因重组: 就是利用 限制性内切酶及其他一 些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基 因．将两者连接起来，将目的基因插入于可 以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以 期这种外源性的目的基因在受体细胞内得到 扩增或正确表达。
（二）平端连接
一些内切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割产生 DNA的片段没有粘性末端，而是平末端。
具有平末端的酶切载体只能与平末端的目 的基因连接。
T4DNA连接酶可催化相同或不相同的限制 性内切酶切割的平端间的连接。
平端连接比粘性末端连接要困难的多，其 连接效率很低，约有粘性末端连接的1%。
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2.不同限制酶切位点连接:
由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段、 具有相同类型的粘性末端，彼此称为配伍(互补)末 端也可以采用粘性末端连接.
如，同尾酶切割可以产生完全配伍的粘性末端， 便于两个DNA片段的连接.用同属于GATC族的 Mbo1(vGATC)和BamHI(GvGATCC)；TCGA族的 Xho1(CvTCGAG)和Sal1(GvTCGAC)等等，共七族、 30多个限制性核酸内酶，切割DNA后，均可与相应 的配伍末端相互连接。
(2) 对某一基因的上游序列进行调控机能分析， 则需考虑选择适当的报告基因，并将可能
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具有调控机能的目的基因置于报告基因 的上游适当位置。 ➢ 若调控基因可能有增强子（其特点一 是位置变化大、二是其作用无明显方 向性）作用，还应在报告基因下游适 当部位设计一个插入位点，以插入一 个功能基因，由此反映增强子的作用。
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2) 在酶切位点之前要有一个较强的启动子， 使插入的目的基因可在该启动子的指导下高 效表达。比如：高效表达质粒 pMH62l的 Bgl2位点前有一个OMP多肽基因启动子 OMPF，外源基因插入后可以表达出外源基 因与OMP多肽融合的蛋白。其突出优点是因 OMP多肽是细菌外膜蛋白(outer membrane protein, OMP)的主要成分，从 而可使外源基因能在细菌外膜上表达, 十分 有利于目的基因产物的收获和提取.
③ 平端加上人工合成接头：合成接头是 自相互补的两个化学合成的寡核苷酸的 等摩尔混合物，而两个寡聚体可形成带 一个或多个限制性酶切位点的平端双链 体。因此在平端DNA加接头可为其亚克 隆操作增加一个或多个限制性酶切位点。
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三．基因与载体的连接(5种方法)
载体DNA和目的基因DNA的连接,按 DNA片段末端性质不同，可有下述不同的 连接方法：