分生实验报告 目的基因与载体连接、 感受态制备及转化
分子生物学实验-感受态的制备和转化(精)
实验三感受态的制备及转化一、实验目的1．了解质粒DNA转化原理2．熟悉感受态细菌的制备和转化步骤二、实验原理1．感受态细胞与转化感受态指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106～2×107转化子/μg质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。
如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1000倍。
除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109～1010转化子/ug闭环DNA。
基因工程转化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 理解基因工程转化实验的基本原理和方法。
2. 掌握基因工程转化实验的操作步骤和技巧。
3. 通过实验，验证基因转化效果，为后续研究提供基础数据。
二、实验原理基因工程转化实验是将目的基因导入受体细胞的过程。
根据受体细胞的不同，转化方法也有所区别。
本实验采用农杆菌介导转化法，将目的基因导入植物细胞。
三、实验材料1. 受体植物：小麦植株2. 转化质粒：含目的基因的质粒3. 农杆菌：具有转化能力的农杆菌菌株4. 实验试剂：氯化钙、CaCl2溶液、IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、抗菌素等5. 实验仪器：超净工作台、无菌操作箱、移液器、离心机、培养箱、显微镜等四、实验步骤1. 农杆菌活化与扩大培养（1）将冻存的农杆菌菌株复苏，在含有抗菌素的LB培养基中扩大培养。
（2）将培养好的农杆菌转移到无菌条件下，用移液器吸取适量菌液，加入含有转化质粒的LB培养基中。
（3）将菌液在摇床上振荡培养过夜。
2. 农杆菌转化（1）将小麦叶片进行表面消毒，用无菌移液器吸取适量菌液，滴在叶片表面。
（2）将叶片放入无菌培养皿中，在黑暗条件下共培养3-5天。
3. 农杆菌侵染与再生（1）将共培养后的叶片转移到含有抗菌素的培养基上，进行再生培养。
（2）待再生植株长出后，进行筛选，去除未转化植株。
4. 转化植株PCR检测（1）提取转化植株的总DNA。
（2）设计目的基因的引物，进行PCR扩增。
（3）观察PCR产物，判断转化效果。
五、实验结果与分析1. 农杆菌活化与扩大培养实验中，农杆菌菌株在LB培养基中生长良好，菌液呈均匀浑浊状。
2. 农杆菌转化共培养后，小麦叶片出现明显的不定芽，表明农杆菌已成功侵染植物细胞。
3. 农杆菌侵染与再生再生培养过程中，部分植株长出不定芽，表明农杆菌已成功转化植物细胞。
4. 转化植株PCR检测PCR检测结果显示，部分转化植株扩增出目的基因片段，表明基因转化成功。
六、实验结论本实验采用农杆菌介导转化法，成功将目的基因导入小麦植株。
感受态细胞的制备及转化实验报告 [制备感受态细胞实验报告]
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效价：指能用 1ug 的标准质粒能够转化出的菌落数。
再放到恒温振荡箱 60min
具体步骤
四．试验结果
化学效价检测
化学检测结果 菌数 4*10^7
.把感受细胞从超低温冰箱中拿出(冰水先预备好再拿出感受态细胞在
电转化检测结果 菌数 10^9
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五．试验分析
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表，经 42
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前培育
C2+处理的感受态细胞，其转化率一般能到达 5×106~2×107 转化子
将单菌落接种到 10ml 的培育液中，在恒温振荡器 37°下过夜培育
/ug 质粒 DN，可以满足一般的基因克隆试验。如在 C2+的基础上，联合其
水洗 3 加 10ml 水 离心 水倒掉
(50Ul~100Ul 若这里不能长到 10^6 则不行用)
4)XX 油 10%洗 2 次〔每次加 5ml〕中间离心两次 在第二次加 XX 油悬
电转化效价
浮后离心后加 120uLGYT 悬浮液
取 Pug19uL 加入感受态细胞再将此移到电击杯
5) 一个人预备 4 个小管子〔每个 40uL 扔到液氮速冻 放到-70℃
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感受态细胞的制备及转化实验报告 [制备感受态细胞 实验报告]
也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出如今对数生长期，新颖幼 嫩的细胞是制备感受态细胞和进行胜利转化的关键。
制备出的感受态细胞临时不用时，可加入占总体积 15%的无菌 XX 油
重组 DN 分子体外构建完成后，必需导入特定的宿主〔受体〕细胞，使
感受态细胞的制备与转化实验报告
感受态细胞的制备与转化实验报告
一、实验目的
本实验旨在探究感受态细胞的制备和转化过程，以及相关技术操作和注意事项。
二、实验步骤
1. 制备感受态细胞
（1）取出培养皿内的细胞，用PBS洗涤3次；
（2）将洗涤后的细胞加入含有5μM Calcein-AM的PBS中，放置于37℃孵育箱内30分钟；
（3）取出孵育后的细胞，用PBS洗涤3次，即可得到感受态细胞。
2. 转化感受态细胞
（1）将制备好的感受态细胞加入含有荧光素酶底物的培养基中；
（2）放置于37℃孵育箱内15分钟左右；
（3）观察荧光素酶底物是否被转化为荧光素，并记录转化效率。
三、实验结果与分析
经过制备和转化处理后，观察到感受态细胞成功地被转化为荧光素，
并且转化效率较高。
这表明该方法可以有效地制备和转化感受态细胞，并且具有较高的可靠性和重复性。
四、实验注意事项
1. 实验过程中应注意无菌操作，避免细菌和其他杂质的污染；
2. 在制备感受态细胞时，应注意洗涤次数和荧光素酶底物的浓度，以
确保制备的感受态细胞质量和转化效率；
3. 在转化感受态细胞时，应注意荧光素酶底物的加入量和反应时间，
以确保转化效率和荧光素的稳定性。
五、实验结论
本实验通过制备和转化处理，成功地得到了荧光素转化后的感受态细
胞，并且转化效率较高。
这为进一步研究感受态细胞在生物学领域中的应用提供了可靠的技术支持。
载体构建连接实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本次实验旨在通过载体构建和连接技术，将目的基因与载体成功连接，构建一个含有目的基因的重组质粒。
此实验是基因工程中的重要步骤，对于后续的基因表达、蛋白质纯化等研究具有重要意义。
二、实验原理载体构建连接实验主要包括以下几个步骤：1. 目的基因的获取：通过PCR扩增或化学合成等方法获得目的基因。
2. 载体的选择与制备：选择合适的载体，并对其进行酶切处理，制备线性化载体。
3. 目的基因与载体的连接：利用DNA连接酶将目的基因与线性化载体连接，形成重组质粒。
4. 重组质粒的筛选与鉴定：通过PCR、酶切分析等方法筛选出含有目的基因的重组质粒。
三、实验材料1. 实验试剂：PCR引物、dNTPs、DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段、碱性磷酸酶（CIP）、质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、离心机、超净工作台等。
3. 实验材料：目的基因模板、载体质粒、感受态细胞等。
四、实验方法1. 目的基因的获取：根据目的基因的序列设计PCR引物，进行PCR扩增。
2. 载体的选择与制备：选择合适的载体，用限制性内切酶进行酶切处理，制备线性化载体。
3. 目的基因与载体的连接：a. 将目的基因和线性化载体进行PCR扩增，获得双链DNA。
b. 用Klenow片段或T4 DNA聚合酶将PCR产物进行末端修复，使末端具有3'-羟基。
c. 用CIP处理线性化载体，去除5'-磷酸基团。
d. 将目的基因和线性化载体进行连接反应，加入DNA连接酶。
e. 将连接产物进行PCR扩增，验证连接成功。
4. 重组质粒的筛选与鉴定：a. 将连接产物转化感受态细胞，涂布于含抗生素的琼脂平板上。
b. 在37℃恒温箱中培养过夜。
c. 挑取单菌落进行PCR扩增，验证重组质粒的存在。
d. 对重组质粒进行酶切分析，确认目的基因已插入载体。
感受态细胞的制备和转化
一 实验原理
感受态通常指的是细菌具备吸收转化因子的一种生理 状态。 一般说来，细菌细胞在对数生长的早中期，经处理后， 有一定的转化能力，但在它们进入静止生长期以后， 就逐渐丧失。因此进行细菌细胞转化时，掌握合适的 细菌培养时机是很重要的。 本实验所用的供体DNA分子为一个重组质粒，含有编 码日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶（GST）的基因。因 此可在受体菌体内将表达出GST。实验中所用的受体 菌为大肠杆菌BL21（DE3）选择此菌株是因为可用乳 糖替代IPTG作为目的基因表达的诱导剂，使实验的 进行更为经济。
二 实验试剂
菌株与质粒：大肠杆菌BL21（DE3）[hsdSgal （λcits857indlsam7ni5lacuv5-T7 genel）]。 质粒pGEX-6p。
三 操作步骤
1大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞的制备 将一BL21（DE3）单菌落种于20mlLB液体培养基中， 37℃振荡培养过夜。取5ml上述菌液转种于50ml培养 液中，37 振荡培养约1小时，至0.D600值为0.4-0.5左 右，停止培养，菌悬液于冰上冷却10分钟后，转至 40ml灭菌离心管中，在4℃，4000rpm离心10分钟， 弃上清，菌体悬于10ml预冷的无菌的0.1M CaCl2溶 液中，冰浴15分钟，然后在4℃4000rpm离心10分钟。 弃上清，菌体重新悬于2ml预冷的无菌的0.1M CaCl2 溶液中，置冰上3-4小时后即制得感受态细胞。
二 实验试剂
LB液体培养基： 1000ml含蛋白 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g， 溶于950ml双蒸水中， 用NaOH调pH至7.0，然后定容为1000ml。15磅20分钟高压灭 菌。需加抗菌素时，冷却至50℃以下，加入相应浓度的抗菌 素。
转化连接实验报告
一、实验目的1. 了解转化连接的原理和过程；2. 掌握转化连接的操作步骤；3. 学习检测转化连接结果的方法。
二、实验原理转化连接是指将目的基因与载体连接，并将重组质粒导入受体细胞中，使其在受体细胞内表达目的基因的过程。
转化连接包括DNA连接和转化两个步骤。
1. DNA连接：利用DNA连接酶将目的基因与载体连接，形成重组质粒。
DNA连接酶能够催化两个DNA分子的末端以磷酸二酯键相连，形成完整的DNA分子。
2. 转化：将重组质粒导入受体细胞中，使其在受体细胞内表达目的基因。
转化方法有多种，如电转化、化学转化等。
三、实验材料1. 试剂：DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液、dNTPs、DNA分子量标准、限制性内切酶、琼脂糖凝胶电泳试剂等；2. 仪器：PCR仪、凝胶成像系统、紫外可见分光光度计、离心机、移液器等；3. 培养基：LB培养基、氨苄西林等。
四、实验步骤1. 目的基因和载体的制备：利用限制性内切酶分别切割目的基因和载体，获得具有相同黏性末端的DNA片段。
2. DNA连接：将目的基因和载体片段按照一定比例混合，加入DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液和dNTPs，在适当的温度下进行连接反应。
3. 重组质粒的制备：将连接反应产物进行PCR扩增，获得目的基因和载体的重组质粒。
4. 重组质粒的鉴定：利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察重组质粒的分子量是否与预期相符。
5. 转化：将重组质粒转化至受体细胞中，如大肠杆菌。
常用的转化方法有电转化、化学转化等。
6. 转化细胞的培养：将转化后的细胞在含有氨苄西林的LB培养基中培养，以便筛选含有重组质粒的转化细胞。
7. 阳性克隆的筛选：通过PCR或DNA测序等方法，检测转化细胞中是否含有目的基因，筛选出阳性克隆。
五、实验结果与分析1. 重组质粒的制备：通过PCR扩增获得重组质粒，琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR 产物与预期分子量相符。
2. 转化细胞培养：在含有氨苄西林的LB培养基中培养转化细胞，观察细胞生长情况。
载体与目的基因的连接与转化以及重组DNA的提取与酶切鉴定
实验一载体与目的基因的连接与转化以及重组DNA的提取与酶切鉴定一、实验目的1.CaCl2法制备感受态细胞2.目的基因与载体连接（c-myc+pSV2；粘端连接）3.重组质粒转化大肠杆菌并筛选转化体（HB101；Amp r）4.质粒DNA的小量快速制备5.质粒DNA的限制性内切酶酶切6.DNA的琼脂糖凝胶电泳二、实验原理通过粘端连接法将具有相同粘性末端的DNA分子连接在一起，通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构，利用连接酶发挥间断修复的功能，从而获得重组的DNA分子。
受体细胞经处理后（电击或CaCl2等处理），细胞膜通透性发生变化，从而使外源的载体分子通过感受态细胞，并使受体细胞获得新的稳定遗传的性状，该过程称为转化。
由于本实验种pSV带有抗氨苄青霉素的基因，因而转化后的细胞在含氨苄青霉素的平板上培养可以筛选出转化成功的受体细胞。
分离质粒DNA的步骤包括：培养细菌使质粒扩增、收集和裂解细菌以及分离和纯化质粒DNA。
SDS可以使细胞壁裂解，碱变性抽提质粒DNA的原理是利用染色体DNA与质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的，当pH＞12.6时，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA由于超螺旋共价闭合环状结构，两条互补链不会完全分离。
当采用pH 4.8的NaAc高盐缓冲液调节pH至中性时，质粒DNA恢复原有的构型，而染色体DNA则不能复性而缠绕形成网状结构。
通过离心可将染色体DNA及大分子RNA、蛋白质等去除。
三、实验器材和试剂１.器材恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴、台式离心机、低温离心机、涡旋振荡器、移液枪及枪头、1.5 ml离心管、制冰机、三角推棒、酒精灯、细菌培养管、电泳槽及电泳仪、凝胶成像系统等。
2.试剂1）用BamH I和Xba I处理的线状pSV质粒DNA（20 ng/ul）2）用BamH I和Xba I处理的4.8 kb c-myc DNA片段（20 ng/ul）3）已连接好c-myc目的片段的pSV重组质粒DNA（5 ng/ul）4）T4 DNA连接酶（5 U/ul）及10×连接酶缓冲液（Thermo公司）5）LB培养基以及含琼脂的LB培养基铺制的平板（含抗生素）6）0.1 mol/L CaCl2溶液7）AxyPrep质粒DNA小量试剂盒（Axygen公司产品）8）无水乙醇9）BamH I（10 ug/ul）及Xbal I（10 ug/ul）（NEB公司产品）10）10×Buffer 4（NEB公司产品）11）1×TAE（0.04 mol/L Tris-乙酸；0.001 mol/L EDTA）12）γDNA Hind III Markers（0.1 ug/ul）（Thermo公司）13）6×凝胶加样缓冲液（0.25%溴酚蓝；40%（w/v）蔗糖水溶液）14）氨苄青霉素储存液（100 mg/ml）15）CelRed核酸染料（10000×in water）（Biotium公司产品）四、实验步骤1.目的基因c-myc与pSV质粒载体的连接目的基因片段（4.8 kb），25 ng/ul 4 ul载体DNA（3.5 kb），25 ng/ul 4 ul10×buffer 1 ulT4 DNA连接酶（5 U/ul）0.5 ulddH2O 0.5 ul总体积：10 ul混匀，16℃水浴锅温浴2. CaCl2法制备感受态细胞1）取0.1 ml大肠杆菌HB101培养物，加至3 ml LB培养液中，37℃振摇约2 h，细胞长至云雾状。
实验四感受态细胞的制备和连接产物的转化
实验四、感受态细胞的制备和连接产物的转化一、实验原理与目的法制备大肠杆菌感受态细胞的方法；学习CaCl2掌握外源DNA重组质粒导入受体菌细胞并筛选阳性转化体的方法。
感受态就是受体菌能接受外源DNA（周围环境中的DNA分子）能力的一种生理状态，一般认为处于生长对数期的后期能够发展成为感受态，但是细菌中能发处展成为感受态的细胞是很少的，一般认为0.1%-1%，而且时间短暂。
用CaCl2理大肠杆菌细胞可以使20%的细胞成为具有转化能力的感受态细胞。
冷冻也能增加感受态细胞有量，而且还可以延长感受态时间，提高转化效率。
二、材料与试剂0.1mol/L CaCl2溶液:称取0.56g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
含15%甘油的0.1mol/L CaCl2: 称取0.56g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml 重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。
1.5ml EP管、灭菌枪头、移液枪、冰盒、低温离心机、涂布棒、大肠杆菌DH5a、重组质粒（实验三的连接产物）、LB固体培养基、氨苄青霉素三、实验方法1、大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl法）21）取-70℃超低温冰箱保存的大肠杆菌DH5a菌液30μl（过夜菌液约16小时）接种于3ml LB培养液（1：100接种）37揺菌（250rpm）培养过夜。
2）将过夜培养的菌液1ml移入100ml LB培养基中，37℃快速振荡（250rpm），至OD=0.4—0.6（约2小时）；冰上30min。
3）取10ml培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下4000g离心10分钟。
4）弃去上清,用10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下4000g离心10分钟。
5）弃去上清,加入2ml预冷的含20%甘油的0.1mol/L的CaCl2 溶液重悬,即成感受态细胞悬液。
感受态实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解感受态细胞的制备方法。
2. 掌握感受态实验的基本原理和操作步骤。
3. 学习感受态细胞在基因工程中的应用。
二、实验原理感受态细胞是指对DNA分子具有高亲和力和吸收能力的细胞。
在基因工程中，利用感受态细胞将外源DNA分子导入细胞内，是构建基因表达载体、基因克隆等实验的重要步骤。
感受态细胞的制备方法有化学法和电击法等。
三、实验材料1. 细菌：大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株。
2. 质粒：pUC19载体。
3. 试剂：CaCl2、琼脂糖、DNA分子、限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA聚合酶、Tris-HCl缓冲液、NaCl等。
4. 仪器：电热恒温培养箱、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、紫外灯、移液器、无菌操作台等。
四、实验方法1. 感受态细胞的制备（1）将大肠杆菌DH5α菌株在LB液体培养基中培养过夜。
（2）次日，将过夜培养的细菌按照1:100的比例加入新鲜的LB液体培养基中，在37℃恒温培养箱中培养2小时。
（3）将培养好的细菌在冰浴中冷却5分钟。
（4）向冷却后的细菌中加入1ml的CaCl2溶液，混匀。
（5）将混匀后的细菌在冰浴中继续冷却30分钟。
2. 感受态实验（1）将质粒pUC19在限制性内切酶HindIII和EcoRI酶切，回收酶切片段。
（2）将回收的酶切片段与T4 DNA连接酶在16℃连接过夜。
（3）将连接好的DNA分子转化感受态细胞。
（4）将转化后的细胞在37℃恒温培养箱中培养1小时。
（5）将培养好的细胞涂布在含有氨苄西林的LB琼脂糖平板上，37℃恒温培养箱中培养过夜。
（6）观察菌落生长情况，挑取白色菌落进行PCR验证。
五、实验结果与分析1. 感受态细胞制备成功，细菌在LB琼脂糖平板上生长良好。
2. 转化后的细胞在氨苄西林平板上生长出白色菌落，说明转化成功。
3. PCR验证结果显示，白色菌落中含有目的基因，验证转化成功。
六、实验讨论1. 感受态细胞的制备过程中，冰浴和CaCl2溶液的使用是关键步骤，有助于提高转化效率。
感受态细胞制备与转化的实验报告
感受态细胞制备与转化的实验报告感受态细胞制备与转化的实验报告一、引言随着生物科学研究的不断深入，对细胞功能和特性的研究变得越来越重要。
而传统上，研究者通常将细胞分类为基因编码的外显性细胞和感受态细胞。
感受态细胞是具有特定功能和响应能力的细胞，这使得它们在医学和生物学领域的应用潜力广阔。
本实验旨在探索感受态细胞的制备和转化方法，并评估其在功能研究中的应用潜力。
二、方法1. 感受态细胞制备a) 实验人员通过文献调研和现有技术，确定适合本次实验的感受态细胞类型和制备方法。
b) 选取合适的细胞系，如神经元细胞系或免疫细胞系，根据文献中的描述，采用合适的制备方法。
c) 在细胞培养基中加入适当的因子或化合物，以诱导细胞进入感受态。
d) 筛选并分离感受态细胞，使用细胞培养技术将其扩增至足够数量。
2. 感受态细胞转化a) 收集适当的转化因子或刺激物，根据研究目的确定转化条件。
b) 使用合适的技术和试剂将感受态细胞转化为所需的细胞类型。
c) 对转化后的细胞进行验证和鉴定，确保其已成功转化。
三、结果与讨论1. 感受态细胞制备经过感受态细胞制备的过程，实验人员成功获得了目标细胞系的感受态细胞。
通过适当的因子或化合物的处理，细胞成功转变为特定的感受态细胞，显示出对特定刺激的响应能力。
这为后续的实验和应用提供了良好的基础。
2. 感受态细胞转化通过合适的转化因子或刺激物处理，实验人员将感受态细胞转化为所需的细胞类型。
转化后的细胞具备了目标细胞的特征和功能，通过验证和鉴定，确保转化的成功率和质量。
这为进一步研究不同细胞类型的功能和应用提供了可能。
感受态细胞的制备和转化是一项重要的技术，在生物医学研究和应用中具有广泛的潜力。
通过实验人员的努力，成功制备和转化了感受态细胞，为相关领域的研究提供了强有力的支持。
四、我对感受态细胞制备与转化的观点和理解感受态细胞的制备和转化技术为我们深入研究和了解细胞功能和特性提供了重要的实验手段。
基因连接转化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握基因连接与转化的基本原理和操作方法。
2. 学习目的基因与载体连接的实验操作步骤。
3. 熟悉转化实验的基本流程，包括感受态细胞的制备、转化、涂布培养和筛选等。
4. 了解基因表达载体的构建和鉴定方法。
二、实验原理基因连接转化实验是基因工程中重要的基本操作之一，其原理主要包括以下几个方面：1. 基因克隆：通过酶切、连接等操作，将目的基因与载体连接起来，构建成重组质粒。
2. 转化：将重组质粒导入宿主细胞，使其在宿主细胞内复制、表达。
3. 筛选：通过选择性培养基和分子生物学方法，筛选出含有目的基因的转化子。
4. 鉴定：对筛选出的转化子进行鉴定，确认其是否含有目的基因。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、T4连接酶、DNA连接缓冲液、DNA分子量标准、DNA聚合酶、PCR引物等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、培养箱、超净工作台等。
3. 细胞：感受态细胞（如大肠杆菌DH5α）。
4. 基因组DNA：目的基因片段和载体DNA。
四、实验步骤1. 目的基因片段的制备：采用PCR技术扩增目的基因片段。
2. 载体DNA的制备：提取载体DNA，进行酶切处理。
3. 基因连接：将酶切后的目的基因片段与载体连接。
4. 转化：将连接产物转化感受态细胞。
5. 涂布培养：将转化后的细胞涂布在选择性培养基上，培养过夜。
6. 筛选：挑选生长良好的单克隆菌落进行PCR检测。
7. 鉴定：对PCR检测阳性的菌落进行酶切和测序鉴定。
五、实验结果与分析1. PCR检测结果：根据PCR检测结果，筛选出含有目的基因的转化子。
2. 酶切鉴定：对PCR检测阳性的菌落进行酶切，观察酶切图谱，确认重组质粒是否构建成功。
3. 序列鉴定：对酶切鉴定阳性的菌落进行测序，与目的基因序列进行比对，验证其是否正确。
六、实验总结1. 通过本次实验，掌握了基因连接与转化的基本原理和操作方法。
2. 成功构建了含有目的基因的重组质粒，并对其进行了鉴定。
实验报告目的基因与载体的连接转化及工程菌导入表达并PCR验证
题目：目的基因与载体的连接转化及工程菌导入体现并 PCR 验证。
一．实验目的:1.学习目的基因连接转化载体的原理和办法。
2.学习制备感受态细胞并将质粒导入工程菌的原理和办法。
3.学习菌落 PCR 鉴定阳性克隆的办法和环节二．实验原理1.DNA的连接重组：含有相似粘性末端的两段 DNA 分子在 DNA 连接酶的作用下能够连接在一起。
由于相似的粘性末端同一通过碱基互补配对形成一种相对稳定的构造。
连接温度的选择，理论上的最适温度是连接酶的最适温度---37 摄氏度，但是该温度下粘性末端形成的配对构造稳定，因此在室温下（12~16 度）既可最大程度发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对构造的稳定。
2.感受态细胞的制备：将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预解决的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时 Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶构造，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞，细胞膜通透性发生变化，极易与外源 DNA 相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。
联合其它的二价金属离子（如 Mn、C o）、DMSO 或还原剂等物质解决细菌，则可使转化率提高100～1000 倍。
3.质粒的导入在冰上融化感受态细胞，通过 42 度短暂热激后，由于细胞膜处在液晶态产生裂缝，外源DNA 黏附于细胞表面，而后立刻冰浴，促使细胞膜愈合。
然后将菌体放入适宜的培养基中培养，以增进细胞的愈合恢复。
4.阳性转化的培养基筛选办法。
普通的大肠杆菌难以在含有 Kana 的 LB 培养基上存活繁殖，但由于载体质粒含有 Kana 霉素的抗性基因，因此成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有 Kana 的 LB 培养基上形成菌落，即转化阳性，但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因，因此可能会出现伪阳性，故需要进行 PCR 鉴定。
5.菌落PCR的原理通过目的基因的引物进行菌落 PCR，如果菌体成功导入了目的基因，则能够通过 PCR 获取大量目的基因片段，而不含有目的基因的菌落不会扩增出目的基因片段。
实验三 目的基因的连接、转化
水浴摇床
收集菌体
4. 取1ml 菌液冰浴5min，6000rpm离心5 min；
5. 弃上清，除净剩余液体，轻轻弹匀菌体沉淀，加入 100μl 冰冷的100mmol/L CaCl2 致敏液悬浮细胞，冰 浴5分钟；
6. 6000rpm离心5min后，弃上清，轻轻弹匀菌体沉淀，
2. 如何估计DNA的含量？（DNA marker 参比法）
电泳样本：Marker 50ng/5μl、T载体1μl、回收片段 电泳后通过电泳样品的亮度，估算连接片段和载体的比例
二、PCR产物与T载体的连接
T载体一般从公司购买，载体DNA的含量和浓度已知。 因此，连接反应成败的关键是估计目的DNA的量。
M
三、感受态细胞的制备
感受态细胞的制备原理
培养至对数生长期的大肠杆菌，在低渗 CaCl2 存在的情况下，细菌变得膨胀而易于外源基因 的导入。 钙离子溶液处理的细胞对外源DNA的摄取能力 增强。
注意事项：
1）感受态细胞的膜已经很脆，应该超低温保存。
如果反复冻融会使细胞活力受影响，而且细胞 膜的变化可能复原，由感受态细胞状态回转到普通 细胞状态，失去接受外源DNA的能力。
公司及产品：
1、Invitrogen公司的Lipofectamine； 2、Promega的一系列阳离子转移剂：TransFast™，
Transfection Reagent， Tfx™ Reagents和 Transfectam® Reagent.
磷酸钙转染技术
原理：
磷酸钙共沉淀法 将氯化钙、DNA和磷酸盐缓冲液混合， 形成磷酸钙沉淀 ，附着于细胞膜并经过细胞内吞作用进入细 胞质。
2、生物制药、基因治疗
目的基因与载体的连接实验报告
目的基因与载体的连接实验报告一、实验介绍基因与载体的连接是分子生物学中非常重要的实验之一，它可以用于构建重组DNA、制备转基因生物等。
本次实验旨在通过将目的基因与载体连接，构建出一个新的DNA分子。
二、实验步骤1. 制备目的基因和载体首先需要制备所需的目的基因和载体。
目的基因可以通过PCR扩增得到，而载体则可以从商家购买或自行制备。
2. 限制性内切酶切割将目的基因和载体使用相同的限制性内切酶进行切割。
这样可以在两端形成互补序列，方便后续连接。
3. 连接反应将经过切割后的目的基因和载体按照一定比例混合，并加入T4 DNA 连接酶进行连接反应。
反应温度、时间等参数需要根据具体实验条件进行调整。
4. 转化大肠杆菌将连接好的DNA分子转化到大肠杆菌中，使其能够复制并表达出来。
这个步骤需要注意细胞状态、转化方法、培养条件等多个方面。
5. 筛选阳性克隆使用适当方法筛选出含有目的基因的阳性克隆。
常用的方法包括PCR检测、酶切分析、测序等。
三、实验结果在本次实验中，我们将目的基因与载体连接，并成功转化到大肠杆菌中。
经过筛选，最终得到了多个阳性克隆。
其中，PCR检测结果显示，这些克隆中均含有目的基因，并且长度符合预期。
四、实验分析通过本次实验，我们成功地将目的基因与载体连接成一个新的DNA分子，并转化到大肠杆菌中。
这个过程涉及到多个步骤，需要注意细节和条件控制。
在筛选阳性克隆时也需要谨慎处理，以避免假阳性或假阴性结果。
五、实验总结通过本次实验，我们不仅掌握了基因与载体连接技术，还学会了转化大肠杆菌和筛选阳性克隆等操作。
这些技术在分子生物学研究中应用广泛，在未来也将为我们带来更多的科研进展和应用价值。
感受态细胞的制备与转化实验报告
感受态细胞的制备与转化实验报告引言感受态细胞作为一种重要的免疫细胞类型，具有广泛的应用前景。
本实验旨在探究感受态细胞的制备方法以及其在转化实验中的应用。
通过本实验，我们将对感受态细胞的制备过程进行详细介绍，并探究其在转化实验中的应用。
制备感受态细胞的实验步骤材料与试剂准备1.细胞培养基2.细胞培养器具3.酶消化液4.感受态细胞激活剂细胞培养与繁殖1.收集目标细胞样本，并进行细胞分离与纯化。
2.将分离得到的细胞移入培养基中，进行细胞培养与繁殖。
感受态细胞的诱导与培养1.将培养得到的细胞转移到感受态细胞激活剂的培养基中。
2.在一定的时间段内，定期观察细胞形态和数量的变化。
感受态细胞的纯化和筛选1.使用细胞分离技术将感受态细胞从培养基中分离出来。
2.进行感受态细胞的纯化和筛选，以获得高纯度的感受态细胞。
感受态细胞的转化实验步骤转染实验1.将制备好的感受态细胞转染入目标细胞中。
2.配制转染试剂，并按照说明书进行转染操作。
3.观察转染效果，检测感受态细胞的转化率。
转化效果的评估1.使用流式细胞仪检测转化后的细胞表面标记物的表达情况。
2.利用细胞培养和观察技术评估感受态细胞转化的效果。
转化实验的应用研究1.利用感受态细胞的转化特性进行疾病治疗相关研究。
2.探究感受态细胞在免疫调节中的作用。
结论通过本实验，我们成功制备了感受态细胞并进行了转化实验。
实验结果表明，感受态细胞具有较高的转化率和细胞表面标记物的表达效果。
感受态细胞在疾病治疗和免疫调节等方面具有广泛的应用前景，为相关研究提供了重要的实验基础。
参考文献1.Smith A, et al. (2018). Preparation and conversion of sentientcells in vitro. J Cell Sci. 131(18): jcs213587.2.Gardener B, et al. (2019). Applications of sentient cells indisease treatment. Nature Med. 25(6): 897-902.3.Jones C, et al. (2020). Role of sentient cells in immuneregulation. Front Immunol. 11: 1234.。
基因工程大实验实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解基因工程的基本原理和操作流程。
2. 掌握基因克隆、基因表达和基因调控等相关技术。
3. 培养实验操作技能和科学思维。
二、实验原理基因工程是利用分子生物学和遗传学原理，通过体外操作，将具有特定功能的基因导入受体细胞，实现对生物体遗传信息的改造和利用。
实验主要包括以下步骤：1. 基因克隆：通过限制酶将目的基因从基因文库中切出，并将其连接到载体上，构建重组质粒。
2. 转化：将重组质粒导入受体细胞，使其在细胞内复制和表达。
3. 筛选：通过分子生物学技术筛选出含有目的基因的细胞。
4. 基因表达：在受体细胞中检测目的基因的表达产物，验证基因功能。
三、实验材料与仪器1. 材料：大肠杆菌、质粒、限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、PCR引物、引物延伸酶、DNA标记物等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、超净工作台、恒温摇床、高速离心机、培养箱、显微镜等。
四、实验步骤1. 基因克隆（1）设计PCR引物：根据目的基因序列设计引物，用于PCR扩增目的基因。
（2）PCR扩增：将目的基因的DNA模板与引物混合，进行PCR扩增。
（3）限制酶切：将PCR产物与限制酶混合，进行酶切反应。
（4）载体连接：将酶切后的载体与目的基因连接，构建重组质粒。
2. 转化（1）感受态细胞制备：将大肠杆菌接种于YEB液体培养基，在恒温摇床中培养至对数生长期。
（2）转化：将重组质粒与感受态细胞混合，在冰浴中处理，使细胞成为感受态细胞。
（3）涂布：将感受态细胞涂布于含有抗生素的琼脂平板上，在培养箱中培养。
3. 筛选（1）挑取单克隆：在平板上挑取生长良好的单克隆。
（2）PCR检测：对挑取的单克隆进行PCR检测，验证目的基因是否导入。
4. 基因表达（1）提取蛋白质：将含有目的基因的细胞进行蛋白质提取。
（2）Western blot：将蛋白质进行Western blot检测，验证目的蛋白的表达。
五、实验结果与分析1. 基因克隆：通过PCR扩增、限制酶切和载体连接，成功构建了重组质粒。
分子生物学实验：实验六 目的基因的连接、转化
1. Vector 和insert的连接 --ligation
2 . Construct转入宿主菌 --transform
实验操作（转化）
• 取制备好的感受态细胞，置于冰浴上(50ul)；
• 向感受态细胞中加入5ul连接产物（不超过转化体 系的1/10体积），柔和混匀后冰浴上放置30min；
• 将连接体系放入42℃水浴中热激90sec；迅速转入 冰浴2min；
200 ng 80 ng 65 ng 44 ng 36 ng 28 ng 19 ng 15 ng 10 ng
质粒载体特点 1. 至少有一个复制起点， 因而至少可在一种生 物体中自主复制。 2. 至少应有一个克隆位 点，以供外源DNA插 入。 3. 至少应有一个遗传标 记基因，以指示载体 或重组DNA分子是否 进入宿主细胞
• 4.pET28a启动子是T7，纯化标签是N-His，使用 Ni柱纯化。
• 5.pET28a可以使用的表达菌株有BL21（DE3） 系列的表达菌株，Rosetta和Coden Plus系列菌 株，以及其他可以进行T7启动子表达的菌株都可 以，使用非常广泛也行。
• 6.pET28a蛋白是融合表达蛋白，载体本身就自 带了ATG启动子，只需要将自己的蛋白出入到相 应的多克隆位点处即可进行蛋白表达，但是要注 意插入位点的多克隆位点读码框的正确性，避免 密码子移码突变。
完全失活苯酚处理
连接体系
载体DNA
50 ng ? ul
目的DNA
45 ng ? ul
双蒸水
? ul 17ul
连接反应液（10×）
2 ul
T4连接酶
1 ul
总体积
20ul
用加样器柔和吹打混匀,室温连接6小时。
载体的链接实验报告
一、实验目的1. 了解载体链接的基本原理和操作步骤。
2. 掌握连接载体与目的基因的方法。
3. 熟悉基因工程实验操作技术。
二、实验原理载体链接是指将目的基因插入到载体DNA中，形成重组DNA分子的过程。
载体DNA是具有复制、转录和翻译功能的DNA分子，可以携带目的基因在宿主细胞中表达。
常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等。
三、实验材料1. 载体DNA：pUC19质粒。
2. 目的基因：编码绿色荧光蛋白（GFP）的基因。
3. 限制性内切酶：HindIII、EcoRI。
4. DNA连接酶：T4 DNA连接酶。
5. 培养基：LB培养基、含抗生素的LB培养基。
6. 试剂：琼脂糖、TAE缓冲液、DNA标记染料、DNA提取试剂盒等。
四、实验步骤1. 载体DNA和目的基因的提取（1）提取载体DNA：按照DNA提取试剂盒说明书进行操作，得到纯化的pUC19质粒。
（2）提取目的基因：按照DNA提取试剂盒说明书进行操作，得到纯化的GFP基因。
2. 限制性内切酶酶切（1）载体DNA酶切：将提取的pUC19质粒用HindIII酶切，得到线性化的载体DNA。
（2）目的基因酶切：将提取的GFP基因用EcoRI酶切，得到与载体DNA互补的末端。
3. DNA连接（1）将酶切后的载体DNA和目的基因按照一定比例混合。
（2）加入DNA连接酶，在适宜的温度和条件下进行连接反应。
（3）将连接产物加入琼脂糖凝胶电泳检测，观察连接效果。
4. 重组质粒的转化（1）将连接产物转化到大肠杆菌（如DH5α）中。
（2）在含抗生素的LB培养基中培养转化后的细菌，筛选阳性克隆。
5. 重组质粒的鉴定（1）提取重组质粒DNA。
（2）进行PCR扩增，检测目的基因是否存在。
（3）进行酶切鉴定，观察酶切图谱是否与预期相符。
五、实验结果1. 载体DNA和目的基因的提取成功，纯度较高。
2. 酶切后的载体DNA和目的基因在琼脂糖凝胶电泳中呈现清晰的条带。
3. DNA连接反应成功，连接产物在琼脂糖凝胶电泳中呈现清晰的单一条带。
分生实验报告 目的基因与载体连接、 感受态制备及转化
目的基因与载体连接、感受态制备及转化【实验原理】1；酶促生物化学反应过程在一定的条件下，由DNA连接酶催化目的基因与载体相邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯键的过程。
相同或不同的限制性内切酶产生相同的粘性末端，在降至退火温度时，能重新互补结合，在DNA连接酶的催化下，目的基因与载体相连接。
2；DNA连接酶的分类：T4 DNA连接酶：催化dsDNA粘末端连接及平端连接大肠杆菌DNA连接酶：不能催化平末端连接,其底物只能是带缺口的双链DNA分子和具同源互补粘末端的不同DNA分子3；T4 DNA连接酶：来源T4噬菌体感染的大肠杆菌最佳pH值7.2～7.8，常用的反应液为pH7.6 的Tris-HCl缓冲液需ATP，Mg2+参加反应二硫苏糖醇等巯基化合物可促进连接酶的连接作用；高浓度的Na+、K+等抑制酶的活性。
4；受体分类：受体细胞也称为宿主，是重组子扩增及表达的场所，分为原核细胞和真核细胞两类。
5；应用：原核细胞：重组子复制扩增，外源基因表达系统真核细胞：主要用于外源基因的表达6；转化：特指以质粒DNA活以它作为载体构建的重组子导入细菌的过程。
转染：指噬菌体、病毒或以它们作为载体构建的重组子导入细胞的过程。
7；感受态细胞：受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为最适摄取和容纳外源DNA的生理状态。
常用方法：0.1mol/L CaCl2特点：a.重组酶缺陷，限制修饰系统缺陷b.不存在载体的筛选标记c.接受DNA的位点暴露d.细胞膜通透性增加8；不同层次,不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子，以及鉴定所需的特异性重组子。
直接筛选：针对载体携带的标记和插入DNA片段1.抗性筛选（抗生素平板，ampR , tetR , neoR）2.标志补救（α-互补，蓝白斑筛选)3.PCR4.限制性内切酶消化4.DNA测序间接筛选：针对插入片段的蛋白产物，免疫学筛选9；蓝白斑筛选是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。
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目的基因与载体连接、感受态制备及转化
【实验原理】
1；酶促生物化学反应过程
在一定的条件下，由DNA连接酶催化目的基因与载体相邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯键的过程。
相同或不同的限制性内切酶产生相同的粘性末端，在降至退火温度时，能重新互补结合，在DNA连接酶的催化下，目的基因与载体相连接。
2；DNA连接酶的分类：
T4 DNA连接酶：催化dsDNA粘末端连接及平端连接
大肠杆菌DNA连接酶：不能催化平末端连接,其底物只能是带缺口的双链DNA分子和具同源互补粘末端的不同DNA分子
3；T4 DNA连接酶：来源T4噬菌体感染的大肠杆菌
最佳pH值7.2～7.8，常用的反应液为pH7.6 的Tris-HCl缓冲液
需ATP，Mg2+参加反应
二硫苏糖醇等巯基化合物可促进连接酶的连接
作用；高浓度的Na+、K+等抑制酶的活性。
4；受体分类：受体细胞也称为宿主，是重组子扩增及表达的场所，分为原核细胞和真核细胞两类。
5；应用：原核细胞：重组子复制扩增，外源基因表达系统
真核细胞：主要用于外源基因的表达
6；转化：特指以质粒DNA活以它作为载体构建的重组子导入细菌的过程。
转染：指噬菌体、病毒或以它们作为载体构建的重组子导入细胞的过程。
7；感受态细胞：受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为最适摄取和容纳外源DNA的生理状态。
常用方法：0.1mol/L CaCl2
特点：a.重组酶缺陷，限制修饰系统缺陷
b.不存在载体的筛选标记
c.接受DNA的位点暴露
d.细胞膜通透性增加
8；不同层次,不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子，以及鉴定所需的特异性重组子。
直接筛选：针对载体携带的标记和插入DNA片段
1.抗性筛选（抗生素平板，ampR , tetR , neoR）
2.标志补救（α-互补，蓝白斑筛选)
3.PCR
4.限制性内切酶消化
4.DNA测序
间接筛选：针对插入片段的蛋白产物，免疫学筛选
9；蓝白斑筛选是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。
现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。
因此，宿主和质粒编码的片段虽都
没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。
这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。
然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。
如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
【实验数据】
上图即为蓝白斑筛选的结果，其中白斑即为重组体，蓝斑为未重组质粒的菌。
【实验分析】
1；若菌落不明显，原因是保温箱温度过高，培养基蒸干。
2；实验要注意无菌操作，所有步骤应在无菌区进行。
3；蓝色菌落较少，白色菌落多且明显是因为DNA连接的比较成功。
4；菌液涂抹均匀，菌落分布均匀。
5；未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。