miRNAs及其在医学领域的研究进展

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早期的研究一直局限于肿瘤组织和正常组织的比对， 认为miRNA是基于组织的肿瘤标志物，在循环血液 中不稳定，一直没有关于在循环血液中进行miRNA 检测的报道，也影响了其应用的广泛性。直到2008 年美国弗雷德哈钦森癌症研究中心的一篇报道，他们 发现在血清和血浆中存在miRNA分子，这种分子独 立于细胞之外，不被血液中降解其他RNA分子的酶 降解。而且这类分子比以蛋白质为基础的早期癌症检 测系统有明显的优势，更易于用现有检测技术建立 miRNA为基础的早期监测系统。实验证明，血浆中 miRNA分子是稳定的，室温24h或反复冻融8次，检 测结果无明显变化。现在其他体液中也发现miRNA 分子。
1.在肿瘤性疾病的研究
在肿瘤学领域，miRNA的研究普遍集中在检测肿瘤 的发生发展和靶向肿瘤治疗。随着近来肿瘤个体化药 物治疗的研究，有许多文献报道了关于miRNA与某 些抗肿瘤药物疗效密切相关。通过对各种肿瘤组织和 正常组织的miRNA表达谱分析表明，miRNA广泛参 与了肿瘤的发生过程。miRNA可能是通过癌基因表 达增强或抑癌基因表达降低的方式参与肿瘤的发生发 展过程。如果miRNA以肿瘤抑制基因或癌基因为靶 向，miRNA失常就能影响肿瘤的形成，有很多关于 miRNA过度表达和沉默或敲除的研究报道。
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miRNA与siRNA的主要异同点
miRNA与siRNA之间有许多相同之处：1.二者的长度都约在22nt左右。2. 二者都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点。 3.二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在。4.二者都是RISC组分，所以其 功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠。5.miRNA和 siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的。 miRNA与siRNA的不同点：1.根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固 有因素；而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的 中间产物。2.结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。3.Dicer 酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切premiRNA的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源于双链RNA的前 体的两侧臂。4.在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3′-UTR区，而 siRNA可作用于mRNA的任何部位。5.在作用方式上，miRNA可抑制靶标 基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用 ，而siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。6.miRNA主 要在发育过程中起作用，调节内源基因表达，而siRNA不参与生物生长，是 RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。
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一. miRNAs简介
microRNA(miRNA，微小RNA，微小核糖核酸） 是一类广泛存在于真核生物中、大小约22（19-25 ）个核苷酸（nt）的内源性非编码小分子单链RNA 。在生物进化过程中高度保守，在细胞中具有时空 特异性表达模式。miRNA不编码蛋白质，而是通 过与靶基因分子mRNA的3′非编码区(UTR）特异性 的碱基配对引起靶mRNA的降解或翻译抑制，从而 在转录后水平上对基因表达进行负调控。miRNA 虽然仅占真核细胞基因组的1-2%，但却调节编码 蛋白基因的30%。作为21世纪生命科学的重大发现 ，越来越多的研究显示，其参与的细胞转录后调控 ，在胚胎发育、细胞增殖、分化、凋亡等多种生物 学过程中起重要作用。
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二.miRNAs在医学领域的研究进展
1998年美国科学家Adrew Fire和Craig C Mello发现 dsRNA能诱导基因沉默，并以此荣获2006年诺贝尔 医学奖。2001年美国著名杂志“Science”报道了研 究者从线虫、果蝇和人体内克隆的几十个类似于lin-4 和let-7的小分子RNA，称为miRNA。并于次年被评 为十大科技突破的第一位。人们逐渐认识到， miRNA与人类生长、发育、各种疾病的发生、发展 和转归的密切关系，利用其能够在转录后水平调控蛋 白合成这一特性，有望成为发现和诊断各种疾病的标 志物，治疗药物的药靶和新药的研发手段。
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自1993年发现至今（2011年4月底）发现和确定的 miRNA已超万种，英国Sanger中心专门成立 miRNA数据库miRase（http//) ，负责对发现的miRNA进行统一归类和编号，版本 已更新到14.0，共收录16772条、涵盖115个物种 ，人类的已超过1000余种。最近研究表明， miRNA参与各种各样的调节途径，包括生物的发育 、器官形成、造血过程、细胞的增殖、分化、凋亡 、病毒防御、脂类代谢等方面。医学领域的研究涉 及到各种肿瘤性疾病、传染性疾病、免疫性疾病、 心脑血管疾病、不孕不育等的诊断、治疗和预后判 断，有望成为疾病诊断的新的生物标志和药靶，或 是模拟这一分子进行新药研发，给人类疾病的治疗 提供新的手段。
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miRNA的生物合成和生物学功能
编码miRNA的基因位于基因间隔区，在RNA聚合酶 Ⅱ的作用下生成数百甚至上千个nt组成的具有帽子和 尾巴结构的初级miRNA(primary miRNA,primiRNA),然后在核糖核酸酶Ⅲ（Drosha和其辅助因 子DGCR8）识别和作用下脱去帽子和尾巴结构形成 60-75个nt的miRNA前体（pre-miRNA），再由核 内转运蛋白exportin-5将其转运出核进入细胞质。再 由核酸内切酶Ⅲ（Dicer和TRBP）将其切割成双链 RNA（dsRNA)，解旋酶作用下生成两条由19-25个 nt组成的单链miRNA，其中一条成熟的进入沉默复 合体(RISC)形成miRNA核蛋白体（miRNP)发挥作用 ，另一条则被降解。
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miRNA是通过与靶mRNA互补配对而在转录后水平 对基因的表达进行负调控，导致mRNA的翻译抑制或 降解。与靶mRNA不完全互补的miRNA在蛋白质翻 译水平上抑制其表达（哺乳动物中较普遍），也有研 究表明，这些miRNA也可能影响mRNA的稳定性。 使用这种机制的miRNA结合位点通常在mRNA的3′端 UTR；如miRNA与靶位点完全或几乎完全互补，那么 这些miRNA的结合往往引起靶mRNA的降解（植物 中多见），通过这种机制作用的miRNA的结合位点通 常在mRNA的编码区或开放的阅读框架中。一个 miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调 节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个 miRNA调控多个基因表达，也可以通过多个miRNA 的组合精细调控某一个基因的表达。随着研究的深入 ，我们将会了解高等真核生物基因组的复杂性和复杂 的基因表达调控网络。 9
于是，德国生物标志物探索中心的Andreas Keller联合其他研 究人员，试图阐明并比较不同疾病中863个miRNA的血液表达 谱，以检测疾病特异的改变。他们收集了454个血液样本，分 别来自患有肺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胃 癌、肾母细胞癌、胰腺肿瘤、多发性硬化症、慢性阻塞性肺疾 病、结节病、牙周炎、胰腺炎或急性心肌梗塞的个体，以及未 患病的对照个体。研究人员使用了高度特异的引物延伸型芯片 ，这种芯片表现出非常低的交叉杂交，可区分let-7家族的成员 。平均说来，他们在每种疾病中找到103个下调的miRNA。与 对照相比，总共62个miRNA在至少6种疾病中下调，而24个 miRNA在一半以上疾病中下调。一个miRNA（hsa-miR-320d ）在11种疾病中下调，而三个miRNA在9种疾病中下调。大部 分miNRA在多数疾病中一致下调。为了研究显著下调的 miRNA是否在物理位置上接近已知的易感变异体，他们提取了 3495个发表的SNP（单核苷酸多态性），并在这些SNP周围的 15
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德国多个研究机构的研究人员绘制了来自病人血液的miRNA表 达谱，其中包括自体免疫疾病、癌症、心血管疾病以及慢性炎 症患者。该研究成果发表在9月4日的《自然—方法学》（ Nature Methods）在线版上。在一项多中心研究中，研究人 员对患病个体的454个血液样本进行芯片分析，确定了863个 microRNA的表达谱，并利用实时定量PCR验证了此miRNA组 （miRNome）。他们检测了所有疾病的一致下调图谱，而通 路分析证实了各个miRNA的疾病相关性。他们还发现，疾病相 关遗传变异的基因组位置与下调的miRNA存在显著相关性（P = 0.004）。miRNA不仅影响或者调控了细胞增殖、分化过程 中的mRNA和关键蛋白质，还可能同时具有肿瘤抑制因子和原 癌基因的功能，在癌症的诊断和治疗中发挥重要的作用。尽管 大部分报道的miRNA表达谱都是从实体组织中产生的，但越来 越多的证据表明，miRNA表达谱也可以从体液中轻松获取，比 如血液。 14
3.miRNA的特点
成熟的miRNA和miRNA前体都有一个发夹形的茎环 结构。成熟的miRNA在3′端可以有1-2个nt的变化， 5′端有一磷酸基团，3′端为羟基。这一特点使它与大 多数寡核苷酸和功能RNA的降解片段相区别，使之 不被某些酶降解。5′端有被称为种子序列的7个nt序 列与靶mRNA3′非编码区调控原件相互作用，识别靶 mRNA，通过其诱导的基因沉默复合物发挥作用， 最终在转录后水平负调控特定把基因的表达。多数 miRNA具有高度保守性、时序性和组织特异性。如 lin-4与lin-14和lin-28的mRNA3′端互补结合，短暂 下调lin-14蛋白表达，使线虫由L1向L2期转化；let7在L1和L2期不存在，L3期出现、L4和成虫期高表达 ，促进线虫向成虫的转化。
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为防止混乱，英国Sanger中心数据库进行了收集、统 一归类编号。除最初发现的lin-4和let-7外，所有 miRNA以“miR”为前缀，其后加上按顺序给出的唯 一标识性识别码，如miR-21；不同生物体同样的 miRNA有相同的识别码，非常近似的同源物也可以有 相同的识别码，如果蝇与线虫和人类体内的miR-1； 同一物种中相同或非常近似的miRNA序列可以有相同 识别码用数字或字母后缀区别，如果蝇的miR-13a和 miR-13b是指序列有轻微差异的转录本，miR-6-1和 miR-6-2则为相同转录本。根据生物体惯用的不同， 有的字母用大写，如拟南芥MIR156，有的用连字符 ，如果蝇和人类miR-1。