抗血清制备及抗体效价测定
抗血清制备原理、步骤及应用
抗血清制备原理、步骤及应用抗血清是一种含有高效价特异性抗体的血清，一般为动物被人工注射某类抗原后制备的动物血清。
通过注射抗血清可以传递被动免疫治疗许多疾病。
一、抗血清制备原理：将抗原注射于动物体，将引起免疫应答。
可刺激动物的淋巴细胞转化为浆细胞并产生特异性抗体，待血清中积累大量抗体时，采集动物血液并分离析出血清，此即含抗体的免疫血清（抗血清）。
抗血清包括抗细菌、抗毒素、抗病毒血清。
二、抗血清制备步骤：1、选择免疫动物➢免疫动物一般选择青壮年期、健壮雌性个体。
➢抗原与免疫动物的种属差异越远越好。
➢针对不同性质的免疫原选择相应的动物。
➢制备H血清用马，制备R血清用兔，制备补体用豚鼠血清。
２、抗原制备➢抗原剂量：用灭菌生理盐水将抗原稀释为2mg/mL，与佐剂混合制成乳剂后用于动物免疫。
➢免疫原的注射剂量应考虑其抗原性的强弱、分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。
通常小鼠首次抗原剂量为50～100μg/次，大鼠为100～200μg/次，兔为100～1mg/次，合成免疫原为2mg（半抗原约为20～200μg），一般需要与等量的福氏完全佐剂混合。
加强免疫原与福氏不完全佐剂混合或不用免疫佐剂，剂量为首次计量的1/2。
➢抗原乳剂的配制：将等量的佐剂与抗原溶液倒入钵内，经过反复碾磨，形成油包水乳剂。
制成的油包水乳剂直接影响免疫效果，因此使用前需进行质量检查。
检查方法是将制成的乳剂滴一滴在自来水表面，质量合格的乳剂滴入水面保持滴珠完整不分散，不合格的乳剂立即扩散，水面油亦逐渐扩大。
若检查不合格，则须继续操作至质量合格为止。
３、确定免疫方案➢根据免疫目的的要求、抗原性质、佐剂种类来制定免疫方案。
可采用全量免疫法、微量免疫法或混合免疫法。
免疫接种途径通常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、淋巴结等接种途径，对抗原的吸收速度为静脉=腹腔=淋巴结＞肌肉＞皮下＞皮内。
若抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法；半抗原宜皮内多点注射。
免疫接种剂量应根据分子量大小、免疫原性强弱、动物个体状态和免疫时间决定。
抗体效价检测步骤
抗体效价检测步骤抗体效价检测是一种用于确定特定抗体在溶液中的浓度的测试方法。
制定抗体检测方案的目的是为了发现一些疾病或病菌感染后体内的抗体水平，以便给这些人提供更好的诊断和治疗方案。
抗体检测可以帮助诊断多种疾病和监测免疫应答。
抗体效价检测的步骤：1. 确定抗原：首先，需要选择与所检测试物一致的合适抗原。
可以是病原体中的某个蛋白质、脂多糖、多糖等化合物。
2. 制备样品：接下来，需要制备出一定浓度的抗原，然后制备一定浓度的粗抗血清作为实验对象，这里抗血清就是被免疫动物或人的血清。
3. 设置不同浓度的样品和抗体：设置一系列不同浓度的测定样品和一定浓度的抗体，一般会先制作含有较多抗体的肯定样品和不含抗体的阴性对照样品。
4. 混合样品和抗体：添加不同浓度的抗体到不同浓度的抗原溶液中或在不同浓度的抗原中加入相同浓度的抗血清，稀释一定倍数（常用2倍）后，把稀释完后的溶液混合均匀。
5. 反应：将混合物加入试剂板中，以促使抗体与抗原结合并发生反应，在一定的条件下，让其反应一定的时间（常用30分钟到数小时）。
6. 洗涤：去掉未结合的物质，洗刷试管或板，这是为了减少误差，使试验结果更加可信。
7. 加入检测酶标记二抗：在试管或板中加入检测酶标记的二抗，这通常是一种抗体，其可与被检测抗体特异性结合。
8. 再次洗涤：去掉未结合的物质，称为第二次洗涤。
9. 加入底物：加入相应的酶底物，以促使反应物下一步的曝光和输送。
10. 停止反应：反应一定时间（通常为10–30分钟），使颜色发生变化，这里会加入用于停止反应的酸或酵素抑制剂。
11. 测定结果：测定反应颜色的浓度，以反映所检知物的含量，从而确定抗体效价，也就是可以得到测量结果，用来确定抗体的水平。
抗体效价检测是一种非常重要的诊断方法，它可以帮助医生和研究人员快速探讨细菌和疾病的数量变化，进而制作出更有效的治疗和疫苗。
生化免疫技术----免疫血清的制备及效价测定
免疫血清的制备及效价测定制备免疫血清的传统方法是将抗原注入动物体内，由动物体内 B 细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。
由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原受体的 B 细胞系产生该决定簇的抗体，因此用抗原免疫机体获得的免疫血清一般均为多克隆抗体。
制备的免疫血清的质量（特异性、亲和力及效价高低）受多种因素的影响，主要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免疫方案（加强免疫次数，间隔时间，佐剂的使用等）等。
因此要获得高质量的免疫血清需先通过预实验摸索确定最佳免疫方法。
测定免疫血清中抗体效价的方法很多，如凝集实验，沉淀实验、溶血实验， ELISA 等均可用于对抗体效价的测定。
第一部分、免疫血清的制备我们要制备的是多克隆抗体----抗IgG抗体的制备。
Ig是免疫球蛋白，对异种动物而言，是良好的抗原物质。
可以刺激异种动物产生抗Ig血清，经适当提取后，产生抗Ig抗体，又叫第二抗体或抗抗体。
在多数的间接标记反应中，均需制备抗Ig抗体。
【实验材料】1．动物IgG（兔源的，购买）2．弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂3．青霉素和链霉素4．实验动物： BALB/c小鼠5．无菌 1ml 注射器6. 生理盐水，酒精棉等【实验步骤】1. 免疫程序：40 ug+弗氏佐剂+青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml+生理盐水混悬液背部皮下多点注射，隔10天加强免疫2次，腹腔注射20ug+不完全弗氏佐剂，一周后收血清。
一般在末次免疫结束后的第7 天,自鼠尾取少量血,分离血清,采用间接法ELISA 分析血清中抗体的效价，达到效价即可收取。
2. 获得免疫血清：小鼠摘眼球取血,收入小试管中,3000转/分离心5分钟,上清即为免疫血清。
第二部分、免疫血清质量评价一、 效价测定抗体效价测定方法很多，本实验采用琼脂扩散法，ELISA法—）、琼脂扩散法1.操作步骤（具体见附注）⑴ 做琼脂板，打梅花孔。
血清抗体效价的测定
实验报告
10.选择波长630nm，将酶标板置于载板台上，开始扫描，测定OD值。
结果如下所示：
思考题：
1.查阅资料，了解共有哪些类型的ELISA实验，以及本实验中所用ELISA属于哪一类？答：本实验中所用ELISA属于间接法ELISA。
①直接ELISA
原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加酶标抗体进行孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
加底物反应。
直接法主要用于测定抗原。
②间接法ELISA
原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，加酶标二抗。
固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。
洗涤后，加底物显色。
③双抗夹心法ELISA
原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。
将特异。
综合性实验三、抗“O”和抗“H”血清的制备及效价测定
西安医学院教案（专业课程）课程名称临床免疫学与检验班级检本1008 专业，层次检验，本科教师武永红专业技术职务讲师授课方式（大，小班，实习）实验学时9学时授课题目（章，节）抗“O”和抗“H”血清的制备及效价测定基本教材或主要参考书王兰兰，许化溪主编.临床免疫学检验.第5版：人民卫生出版社，2012 刘辉．临床免疫学与检验实验指导第3版：人民卫生出版社，2009 曹励民．免疫学检验实验指导．自编教材，2011教学目的：1.掌握：细菌接种培养的操作能力，加强细菌性抗原免疫动物的实验操作能力，肥达氏反应的模拟操作及间接血凝实验测定细菌性抗体的效价，2.熟悉：临床用于诊断细菌或病毒感染的凝集反应测定效价试验的原理。
教学内容：1.细菌培养与免疫原的制备2.“O”和抗“H”血清的制备3.试管凝集试验测抗“O”和“H”血清效价4.间接血凝试验测抗“O”和“H”血清效价教学方法：启发式教学；讲授重点内容。
教具：板书示教教学重点、难点：1. 间接血凝试验测抗“O”和“H”血清效价教研室审阅意见（教研室主任签名）年月日教学内容教学手段时间分配抗“O”和抗“H”血清的制备及效价测定（一）细菌培养与免疫原的制备（二）“O”和抗“H”血清的制备（三）试管凝集试验测抗“O”和“H”血清效价（四）间接血凝试验测抗“O”和“H”血清效价（一）细菌培养与免疫原的制备伤寒沙门菌标准菌株干粉→生理盐水溶解→接种肉汤培养基→接种普通平板→生理盐水菌液（100℃水浴制备O抗原，甲醛处理制备H抗原）（二）“O”和抗“H”血清的制备Ag伤寒沙门菌O和H抗原→分别免疫两组家兔→抗O血清和抗H血清O/H抗原的免疫程序：日序（天）免疫剂量（ml）免疫途径1 1 皮内五点注射8 1.5 耳静脉注射15 1.5 耳静脉注射22 1.5 耳静脉注射放血方法：颈动脉采血试血方法：试管凝集试验（三）试管凝集试验测抗“O”和“H”血清效价试管凝集试验的原理：在试管内，用已知颗粒性抗原作为诊断试剂，与一系列倍比稀释的待检血清混合反应，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集现象。
抗血清制备
抗血清制备抗血清是一种广泛应用于医学、生物学、农业等领域的重要抗体。
它可以通过对动物实验的刺激来制备，具有较高的特异性和灵敏性。
本文将介绍抗血清的制备过程和应用领域。
一、抗血清的制备抗血清的制备需要对动物实验进行免疫刺激，让其产生免疫反应，生成相应的抗体。
制备抗体的方法有多种，包括:1. 多次免疫法：将抗原与适当的佐剂混合后注射给动物，每次注射间隔时间大于1个星期。
免疫周期主要根据抗原型以及免疫状态来确定。
一般情况下，需要多次免疫才能达到所需的浓度。
2. 单次免疫法：在抗原一侧布局NMDA表达杂交的细胞，给兔子单偏免疫或初免疫后再进行免疫，以提高抗体效价。
3. 聚集物制备法：将抗原加入雄鹰蛋白中，然后注射到家兔或小猪体内，以选育出抗体。
以上三种方法都有它们的优缺点，适用于不同的条件下。
二、抗血清的应用抗体在医学、生物学、农业等领域都有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1. 诊断：通过抗血清与疾病相关物质的特异性结合可以进行诊断，如HIV、狂犬病、乙肝等病毒感染的检测。
2. 治疗：抗体被广泛应用于治疗各种疾病，如肿瘤、自身免疫性疾病、传染病等。
3. 细胞学：抗体可用于细胞学实验，用于检测细胞内、细胞表面或细胞核内的成分，如检测肿瘤细胞、细胞分离、特定蛋白识别等。
4. 农业：抗血清可用于畜牧业和农业生产，如检测动物或植物病毒感染、食品中添加的污染物等。
三、注意事项在制备抗血清时，需要注意以下几点：1. 选择优质的抗原，并进行适当的保护、存储。
2. 用药量应适当，尽量不要过多。
3. 对免疫动物的饲养和体温要求高。
4. 在注射时要注意卫生和安全问题，防止交叉感染。
5. 制备后需要进行充分的检测和鉴定，以确定抗体的特异性和效价。
抗血清的制备是一项重要的实验技术，应用领域广泛，但同时也需要谨慎和责任心。
只有严格遵守操作规定和注意事项，才能制备出优质的抗血清，促进科学的发展。
抗血清的制备
抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
免疫学实验论文——抗血清的制备及效价测定
免疫学实验抗血清的制备及其效价测定班级：生物技术1401小组：11姓名：2016年11月抗血清的制备及免疫小鼠效价检测摘要：本试验以牛血清白蛋白为抗原，对小鼠和家兔进行免疫，以制备高效价抗血清。
采用多次中程免疫使产生免疫应答小鼠的血清中抗体达到实验所需的要求，然后采集小鼠血液，从中分离出血清，从而获得抗血清。
利用间接ELISA 方法测得抗血清效价。
关键词：抗血清；间接法ELISA ；抗体效价前言：用具有抗原性的物质（牛血清白蛋白BSA ）注入到健康小鼠的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。
抗体主要存在于血清中，经三次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集小鼠血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。
酶联免疫吸附实验（ELISA ）是一种新型的免疫测定技术，利用间接ELISA 法，将抗原BSA 包被在酶标板上，加入待测的抗体，再加相应的二抗，生成复合物后再加入底物显色，借助仪器测得的光吸收值计算抗体效价。
材料与方法：实验主线：实验材料：包被缓冲液（0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液）、10ug/ml 抗原（牛血清白蛋白）、0.01M PBS 溶液、5%（w/v ）脱脂奶粉、PBST 洗涤液（含0.05%Tween 20的0.01M 的PBS ）、2M H2SO4、待测抗体、HRP 标记的羊抗小鼠IgG （二抗）、底物溶液TMB 、健康小鼠酶标板、酶标仪、保鲜膜、排枪、离心管、玻璃棒、烧杯、离心机、恒温箱动物免疫抗血清的采集与分离中程免疫3次间隔一周间接法ELISA 测定抗血清的效多克隆抗体实验内容与方法：一．动物的免疫：1.1实验动物的选择选择实验动物应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。
选择与抗原亲缘关系远的动物，尤其在制备抗免疫球蛋白（Ig）抗体时；根据抗体的需要量选择动物，制备一抗常用动物为小鼠和家兔，制备二抗常用动物为羊和马；常用青壮年期的雄性动物。
生化实验五酶联免疫吸附法测定抗血清效价
三、操作步骤
1. 包被：96孔板包被适量BSA（100 ul），4℃过夜。 2. 洗涤：漂洗3次，每次300 ul，每次3 min。 3. 一抗孵Байду номын сангаас：加入稀释的一抗（100 ul），37℃孵育1 hr。 4. 洗涤：漂洗3次，每次300 ul，每次3 min。 5. 二抗孵育：加入稀释的酶标二抗（100 ul），37℃孵育30
min。 6.洗涤：漂洗3次，每次300 ul，每次3 min。 7.显色反应：加入显色液200 ul，避光显色15 min。 8.终止：加入2 N (N:当量浓度)H2SO4 50 ul，终止反应。 9.测定：酶标仪读数（OD490读数）。
四、实验报告要求
1. 原理 （铅笔绘图） 2. 操作 3. 结果 4. 结果说明（判断本实验中抗体的效价？）
加入底物，在酶的催化下产生有色物质， 通过比色测定光密度值，即可算出抗血 清中抗体的存在量。
底物 酶标二抗
一抗 抗原 间接法
抗血清效价
制备的免疫血清，必需进行效价的测定。 抗血清的效价：它与一定量抗原作用时出现肉眼
可见颜色反应的最大稀释度。 分光光度计测定法：应用一系列连续稀释的抗血
清，与固定的抗原反应，分析计算出现颜色的最 大稀释度（吸光度差值需大于0.05）。
抗体浓度 对照（0） 1:500
一抗
洗涤液
①
二抗
二抗
二抗
OD490
1:1000 ②
二抗
1:2000 ③
二抗
1:4000 ④
二抗
1:8000 ⑤
二抗
实验五 酶联免疫吸附法测定
抗血清效价
一、目的
学习和掌握ELISA的基本原理
重点掌握
免疫学实验抗血清制备及抗体效价检测 华中农业大学免疫学基础及免疫学技术
v 10月14日 2.0ml 耳静脉
v 10月25日 2.5mL 耳静脉
一、采血
（一）心脏抽血
v 家兔固定（仰卧）---准确找到心脏部位---剪毛（心 脏部位）---消毒---进针（50ml注射器接带硅胶管的 12号针头）抽血，抽至50ml，从硅胶管接头处取下注 射器，拔针头，将血液注入100ml无菌空三角瓶，再 重复上述操作继续抽血，直至抽完。
v 将双扩实验结果用铅笔绘图并分析判断： （1）待测Ag中至少有几种组分？ （2）待测Ag各组分相对应的Ab的效价？
如：待测抗原组分一相对应的抗体的效价为1：X。
v 注意沉淀线的数量、部位、走向、粗细、 清晰度等。
★结果分析
v 1、本实验采用的是什么Ag、Ab？
v 2、 Ag、Ab为什么要设置一系列的 浓度 (方阵排列) ？ “效价”是指Ag的、 还是Ab的？与Ag、Ab的浓度有何关 系？
本次实验目的
1、分析待测抗原的组分数量； 2、测定各组分相应抗血清的效价。
以出现沉淀线抗体的最高稀释倍数为该抗 体效价。
1、融化凝胶、倒胶制备凝胶板（每人1板）。 2、Ag、Ab稀释（见图、4人1套）。 3、打孔、点样（加Ag、Ab，每孔8ul）。 4、37℃保温保湿扩散1d，结果观察。
记号：学号
四、免疫途径
五、免疫时间间隔
v 羊、马、鸡、猴、豚鼠、兔都是常用的免疫动物， 在实验中，选择动物时应考虑抗原与动物的种属 关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、 免疫血清的要求以及动物个体等因素。
v 免疫用动物应选适龄、健壮．最好为雄性。
v 最常用的实验动物是家兔，一般选择选择年龄在 6个月以上当年繁殖的♂性，体重2 ～3公斤，健 康家兔三只，免疫前用金属编号牌固定兔耳，或 用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。
免疫学实验报告
免疫学实验报告 Modified by JACK on the afternoon of December 26, 2020免疫实验—抗血清制备及抗体效价检测摘要：用具有抗原性的物质牛血清白蛋白（BSA)注入到健康动物例如鼠、兔的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。
抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。
抗血清，是指含有免疫蛋白的血清。
抗体效价指抗体的物理状态及其在体内滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。
此次实验主要是进行小鼠的牛血清白蛋白（BSA)抗血清的制备过程，并通过酶免疫吸附试验（ELISA）对其进行抗体效价检测。
关键字：牛血清白蛋白（BSA) 抗血清抗体效价免疫实验过程：本次实验一共分为三个分实验：实验一：免疫实验二：抽血、放血，分离抗血清实验三：ELISA测定抗体效价实验一：免疫一、抗血清制备的原理用具有抗原性的物质注入到健康动物的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。
抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。
二、目的制备高效价的抗血清三、实验仪器、材料和试剂实验仪器：1mL 注射器，酒精棉球，剪刀材料：家兔，小鼠试剂：3％～5％苦味酸溶液或80％～90％苦味酸，牛血清白蛋白（BSA)三、方法和步骤1、动物编号左前腿上部为1，左腰部为2，左后腿为3，头部为4，背部为5，尾基部为6，右侧从前至后依次为7、8、9。
红色表示十位数,用黄色表示个位数。
免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。
2、动物抓取及注射按如下图所示抓取目标动物家兔为300～600 μg/次（400），每次不超过2mL；小鼠为10～100 μg /次（10-20，20~40 μg / ml），每次不超过。
实验一抗血清制备
磷酸盐缓冲液用于调节溶液的酸碱度，维持实验环境的稳定。
04
实验步骤
免疫原制备与注射
免疫原制备
根据实验需求，选择适当的抗原，进行适当的处理和纯化，确保抗原的纯度和浓度符合实验要求。
详细描述
本实验采用了ELISA方法，将抗血清与抗原进行反应，通过酶标仪检测反应后的吸光度值，计算出抗血清的效价。 实验结果表明，制备的抗血清具有较高的效价，能够与抗原特异性结合。
抗血清的纯度分析
总结词
通过电泳、色谱等技术分析抗血清中杂 蛋白的含量，评估抗血清的纯度。
VS
详细描述
本实验采用了SDS-PAGE电泳和离子交换 色谱技术，对抗血清进行纯度分析。实验 结果表明，制备的抗血清中杂蛋白含量较 低，纯度较高，符合实验要求。
免疫注射
将制备好的免疫原注射到实验动物体内，通常采用皮下注射或肌肉注射的方式，注射后观察动物反应 ，确保免疫原安全有效。
免疫血清的分离与收集
血清分离
在免疫注射一定时间后，无菌采集动物血液，分离出血清，去除红细胞和杂质。
血清收集
根据实验需求，收集不同时间点的血清样本，记录采集时间和量，确保血清的质 量和可追溯性。
免疫原是指能够刺激机体免疫系统产 生特异性免疫应答的物质，通常为微 生物或其代谢产物、人工合成的多肽 等。
在抗血清制备实验中，免疫原需要经 过适当的处理和修饰，以提高其免疫 原性。常见的处理方法包括加热、化 学偶联、放射性标记等。
实验试剂：生理盐水、佐剂、磷酸盐缓冲液等
生理盐水是常用的稀释液，用于将免疫原和佐剂稀释到适当的浓度。
抗血清的制备
抗血清的制备原理：抗血清为含有某一类具有特异免疫功能的抗体分子的血清，一般为动物被人工注射某类抗原后制备的动物血清。
高效价的抗血清用于研究工作以及疾病的诊断和治疗。
一般完全抗原免疫动物需加用佐剂，使用佐剂后可增加抗原的免疫原性和延长抗原在机体内存留的时间，从而改变了抗原原有的免疫原性。
材料：1、苦味酸染料；2、1毫升注射器；3、EP管、刀片；4、福氏完全佐剂（Freund ’s complete adjuvant）；福氏不完全佐剂（Freund’s discomplete adjuvant）5、抗原（本课题组所用抗原为重组蛋白Eg-TPX(his)/rGST(his)/EPC1(his)）；6、无菌PBS，消毒用酒精、无菌棉球；7、实验动物（昆明白小鼠）。
步骤1、动物的选择课题组选用18g-20g昆明白小鼠进行免疫。
2、抗原制备1）抗原剂量:首次抗原剂量为20～25μg/次，与等量的福氏完全佐剂混合，抗原乳剂200ul。
加强免疫抗原与不完全福氏佐剂混合，剂量为首次计量的1/2。
2）抗原乳剂的配制将等量的佐剂和抗原溶液倒入容积内，经过蛋白搅拌器反复碾磨，可形成油包水乳剂。
制成的乳剂是否形成油包水乳剂直接影响免疫效果，检查方法是将制成的乳剂滴一滴在自来水表面，质量合格的乳剂滴入水面保持滴珠完整基本不分散，不合格的则立即扩散，水面油亦逐渐扩大，须继续操作至质量合格为止。
检查合格后，离心，2500r,5min.3、免疫途径，剂量和免疫周期免疫方案为抗原皮下多点注射进行基础免疫；再以免疫原作多次加强免疫，一般间隔2周，皮下或腹腔注射加强免疫。
具体时间如下表所示：免疫时间免疫次数免疫途径抗原免疫剂量第一周第一次背部皮下多点注射重组蛋白+福氏完全佐剂20~25ug 第三周第二次腹部皮下多点注射重组蛋白+福氏不完全佐剂10~12.5ug 第五周第三次腹腔注射重组蛋白+福氏不完全佐剂10~12.5ug 第七周第四次腹腔注射重组蛋白+福氏不完全佐剂10~12.5ug 第九周第五次腹腔注射重组蛋白+福氏不完全佐剂10~12.5ug ……腹腔注射重组蛋白+福氏不完全佐剂10~12.5ug 第N周第N次腹腔注射重组蛋白+福氏不完全佐剂10~12.5ug4、试血测定抗体效价一般在第三次免疫后3天即可小鼠尾尖取少量血，分离血清后通过间接法测定抗体效价。
抗体实验方法
抗体实验方法一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg 卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
免疫血清制备及效价测定
实验内容
1、免疫动物
初次免疫小鼠为腹腔注射40%绵羊红细胞 （SRBC）0.2ml，以后分别于第4天、第7天和第10 天时间，以相同免疫剂量、相同免疫途径加强免疫。
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免疫血清制备及效价测定
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实验目的和要求
1、学习抗血清的制备方法； 2、掌握抗血清的收集和保存方法； 3、掌握免疫血清效价的测定方法。
实验原理
制备免疫血清的基本方法是将抗原注入动物体内，由动物体内特异的B淋 巴细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决 定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原决定簇受体的B淋巴细胞系产生 针对该决定簇的抗体，因此用抗原免疫动物获得的免疫血清一般为多克隆抗体 （polyclonal antibody）。
本次实验将采用溶血实验测定所获免疫血清的效价。
• 抗的两种特性：免疫原性与抗原性
• 免疫原性的本质——异物性
• 与机体亲缘关系越远，组织结构的差异越 大，异物性越强。
实验材料
1. 40% SRBC 2. 18-22g的BALB/C系小白鼠 3. 无菌1ml 注射器 4. 抗凝剂（枸橼酸钠或肝素） 5. 新鲜豚鼠血清（作为补体用） 6. 小试管等
制备的免疫血清的质量（特异性、亲和力及效价高低）受多种因素的影响， 主要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免疫方案 （免疫次数、间隔时间以及免疫佐剂的使用等等）。因此要获得高质量的免疫血 清需先通过预实验摸索确定最佳免疫方案。
实验一抗体的制备及效价检测[技巧]
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实验一抗体的制备及效价检测一、实验目的本实验是单克隆抗体技术的免疫阶段的过程，为单克隆抗体技术提供免疫淋巴细胞。
了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术，掌握双向免疫扩散法测定抗体的效价。
二、实验原理机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫和细胞免疫的过程。
一种抗原能否引发抗体反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的化学结构---抗原决定簇，另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。
当上述两个条件具备时，抗原进入机体经过一定的潜伏期，抗体效价逐步上升，达到高峰后，能维持一短暂的时期，以后又逐渐下降，但当第二次接触相同的抗原时，抗体的上升较前次为快，高峰时的效价也比前次为高。
抗体持续的时间也较长，此也称为再次反应。
完全福氏佐剂的使用能够延长抗原在体内的存留时间，增加可溶性抗原的免疫性。
通常制备抗体时常用完全福氏佐剂加强免疫。
抗原、抗体在合适的浓度和比例条件下，抗原和其相应的抗体在有固相支持的液相环境中各自发生扩散。
分子双向扩散接触时形成肉眼可见的沉淀线反应。
抗体的效价即时指与固定浓度的抗原发生沉淀反应时所需的最小抗体浓度。
三、实验步骤1．动物的选择：选择2-3个月以上的小鼠。
免疫作好标号。
分笼饲养。
2．抗原的选择：将抗原（纤维素酶）稀释为4 mg/ml，即可与佐剂混合制成乳剂用于动物免疫。
3．佐剂和抗原乳剂的制备佐剂完全福氏佐剂：轻矿物油（石腊油）8.5 ml；羊毛脂1.5 ml；灭活结核杆菌10 mg。
抗原乳剂制备（1）油剂：矿物油和羊毛脂按比例混合，高压8磅20分钟灭菌后作为油剂，使用前微火融化。
（2）水剂：灭活结核杆菌1 mg/ml + 抗原4 mg/ml （均为终浓度）。
（3）油剂和水剂1：1混合。
混合方式：研磨或者注射器混合。
4．免疫方法：小鼠背部皮下多点注射，每点0.1ml。
第一次免疫：实验组小鼠加佐剂的抗原。
A组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。
抗血清制备及抗体效价检测
短期免疫抗血清制备及抗体效价检测黄健，应技1201,2012304200315摘要通过一定程序注射颗粒性抗原或可溶性抗原免疫小鼠和家兔，是实验室制备多克隆抗血清的常用方法。
虽然依据常规免疫方案可以制备出效价高、亲和力强的抗血清，但整个常规方案耗时近１个多月，也容易受到免疫动物健康状况的影响和饲养成本的限制。
本试验以牛血清白蛋白为抗原缩短免疫注射周期，对小鼠和家兔进行短程快速免疫。
并进行效价检测，以探讨短程快速免疫方案的实效性。
关键词免疫，抗血清，抗原，ELISA主线实验分为三个小实验分别为：实验一：免疫小鼠（每组一只），家兔（每班一只）。
实验二：对免疫后的小鼠和家兔进行抽血、放血，其中老鼠采用断尾取血家兔采用颈动脉放血，分离抗血清。
实验三：ELISA测定抗体效价。
另有一个穿插实验：血型鉴定。
1 实验一：免疫用具有抗原性的物质注入到健康动物的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。
抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。
为了制备高效价的抗血清，我们需要考虑下列五个因素。
实验动物的免疫反应性，抗原的免疫原性，抗原的剂量，免疫途径，免疫时间间隔。
1.1实验动物的选择常用的免疫动物有家兔、羊、马、大鼠、小鼠、豚鼠等。
免疫用动物应选适龄、健壮，最好为雄性。
家兔一般选择选择年龄在6个月以上当年繁殖的♂性，体重2～3公斤，健康家兔三只，免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。
同时应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。
我们此次选用小白鼠（每组一只），家兔（每班一只）。
1.2实验步骤1).编号标记3％～5％苦味酸溶液或80％～90％苦味酸酒精饱和液分别标记左前腿上部为1，左腰部为2，左后腿为3，头部为4，背部为5，尾基部为6，右侧从前至后依次为7、8、9。
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摘要............................................................................. .. (4)【实验过程】 (5)PartⅠ. NDV 抗血清制备 (5)一、实验原理 (5)二、实验仪器、材料和试剂 (7)1. 仪器 (7)2. 材料 (7)3. 试剂 (7)三、方法和步骤 (7)（一）NDV 兔抗血清制备 (7)1. 家兔捉拿方法 (7)2. 家兔固定方法 (8)3. 初次免疫 (9)4. 二次免疫 (10)5. 终末免疫 (10)6. 试血 (10)7. 颈动脉放血 (10)8. 血清分离 (12)9. 抗血清保存 (12)（二）NDV 鼠抗血清制备 (12)1. 小白鼠的捉拿和固定 (12)2. 初次免疫 (13)3. 二次免疫 (15)4. 终末免疫 (15)5. 试血 (16)6．放血 (18)7．血清分离 (19)8．抗血清保存 (19)Part Ⅱ. 琼脂双扩散实验检测抗体效价 (19)一、基本原理 (19)二、实验仪器、材料和试剂 (20)1. 仪器 (20)2. 材料 (20)3. 试剂 (20)三、方法和步骤 (20)1. 灭活鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原提取 . 202. 1%琼脂糖配制 (20)3. 倒平板 (21)4. 打孔 (21)5. 稀释抗血清 (22)6. 加样 (22)7. 孵育 (23)8. 结果观察 (23)Part Ⅲ. 酶联免疫吸附试验测定 NDV 抗血清效价 (23)一、基本原理 (23)二、实验仪器、材料和试剂 (24)1. 仪器 (24)2. 材料 (24)3. 试剂 (24)三、方法和步骤 (25)1. 鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活抗原提取 . 252、抗原包被 (25)3. 封闭 (25)4. 洗板 (25)5. 稀释抗血清 (25)6. 加抗血清 (26)7. 洗板 (26)8. 加酶标二抗 (26)9. 洗板 (27)10. 显色 (27)11. 终止 (27)12. 读数 (27)13. 结果判定 (27)Part Ⅳ. 免疫印迹实验鉴定抗体的特异性 (27)一、基本原理 (27)二、实验仪器、材料和试剂 (28)1. 仪器 (28)2. 材料 (28)3. 试剂 (28)（1）SDS-PAGE 相关试剂： (28)（2）Western blotting 相关试剂： (29)三、方法和步骤 (30)1. SDS-PAGE (30)2. 转膜 (31)3. 免疫检测 (33)（1）膜的封闭 (33)（2）洗膜 (33)（3）加入一抗 (33)（4）洗膜 (33)（5）与二级抗体作用： (33)（6）洗膜 (33)（7）Odessey 近红外成像仪扫描成像 (34)【实验结果及分析】 (34)NDV 抗血清制备及抗体效价测定摘要：抗血清，新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。
在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒属（Paramyxovirus）中的一个种。
该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。
以新城疫病毒灭活疫苗（Ulster 2C 株）灭活油剂苗多种途径免疫兔和小白鼠，制备新城疫病毒抗血清。
也叫免疫血清，是指含有免疫蛋白的血清。
抗体效价指抗体的物理状态及其在体内滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。
此次实验主要是进行家兔与小鼠的新城疫病毒抗血清的制备过程，并通过酶免疫吸附试验、兔疫印迹实验对其进行抗体效价检测。
关键字：NDV 抗血清抗体效价免疫【实验过程】本次实验一共分为四个大步骤：PartⅠ. NDV 抗血清制备一、实验原理将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应 B 细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。
待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗体）。
由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体（Polyclonal antibody，PcAb）。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。
对于免疫原性较弱的可溶性抗原(如蛋白质类抗原)要加入佐剂，以增强免疫性。
本实验介绍新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）抗血清的制备过程。
新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。
在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒属（Paramyxovirus）中的一个种。
该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。
以新城疫病毒灭活疫苗（Ulster 2C 株）灭活油剂苗多种途径免疫兔和小白鼠，制备新城疫病毒抗血清。
二、实验仪器、材料和试剂1. 仪器5mL 无菌冻存管，2.5mL 和 1mL 注射器，塑料静脉插管，碘酒，75％酒精棉球，剪刀，止血钳，250mL 无菌三角瓶，50mL 无菌尖底离心管，家兔固定槽，家兔解剖台，棉线，5mL吸头和移液器，温箱，离心机。
2. 材料家兔：1-2kg 清洁级雄性或未孕雌免；小鼠：SPF 级 6-8 周龄昆明鼠。
3. 试剂鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司），0.01M PBS（ pH7.2）（8 g NaCl，0.2 g KCl，2.9 g Na2HPO4.12H2O，0.2 g KH2PO4，以NaOH 调节 pH 至 7.2，加双蒸水至 1000 mL），麻醉剂：普鲁卡因溶液，硫柳汞。
三、方法和步骤（一）NDV 兔抗血清制备1. 家兔捉拿方法动物的捉拿和固定是进行动物实验的基本操作之一，正确的抓取固定动物是为了不损害动物健康，不影响观察指标，并防止被动物咬伤，保证实验顺利进行。
家兔习性温顺，除脚爪锐利应避免被其抓伤外，较易捕捉。
拿时切忌以手提抓兔耳、拖拉四肢或提拿腰背部。
正确的方法是用右手抓住其颈背部皮毛，轻提动物，再以左手托住其臀部，使兔的体重主要落在左手掌心（如图 1）。
图 1. 家兔的捉拿方法2. 家兔固定方法家兔的固定，依不同的实验需要，常用兔固定箱或兔手术台固定。
兔固定箱通常由木头、铁皮或者树脂材料制成，便于拆卸清洗消毒，一般用于固定兔子狐狸貉子等。
使用时时可将家兔置于兔固定箱内，在不需要帮手的情况下单人即可对兔子等动物打耳号，灌药、耳缘静脉注射、取血、或观察耳部血管的变化等，常用于生理、药理和免疫等作动物整体实验时限制实验物的活动。
（如图2）图 2. 家兔固定箱固定方法在需要观察血压、呼吸和进行颈、胸、腹部手术时，应将家兔以仰卧位固定于兔手术台上。
固定方法是：先以四条 1cm 宽的布带作成活的圈套，分别套在家兔的四肢腕或踝关节上方，抽紧布带的长头，将兔仰卧位放在兔手术台上，再将头部用兔头固定器固定，然后将两前肢放平直，把两前肢的系带从背部交叉穿过，使对侧的布带压住本侧的前肢，将四肢分别系在兔手术台的木柱上。
（如图3）图 3. 家兔手术台固定方法3. 初次免疫在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等部位，选择 6~10 处免疫接种点，采用皮下、皮内或肌肉注射，每点注射上述鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗 0.1～0.2mL。
如果使用没有加佐剂的灭活新城疫病毒 Ulster 2C 株，也可以采用耳缘静脉注射的方法进行免疫。
（如图4）图 4. 家兔耳缘静脉注射方法4. 二次免疫第一次免疫后间隔2周再以鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗采用与初次免疫相同的方法在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等部位，选择 6~10 处免疫接种点，采用皮下、皮内或肌肉注射加强免疫。
5. 终末免疫第二次免疫后间隔 2 周再按上述二次免疫方法进行第三次免疫。
6. 试血终末免疫免疫 7 天后经兔耳缘静脉采血 2mL，分离血清，用琼脂双向扩散实验测定抗体效价达 1:16 以上（稀释抗体）以上时，即可放血，如效价不高，则加强免疫 l 次后，再行检测。
7. 颈动脉放血将免疫家兔仰面固定于家兔手术台上，头部放低，暴露颈部。
沿气管钝性分离皮下组织，暴露气管前的胸锁乳突肌；分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，在肌束下面靠近气管两侧，可见淡红色搏动的颈动脉。
（如图5）图 5. 兔颈部血管神经分布图将双侧动脉仔细分离，于每侧动脉分别套入两根棉线，一根在远心端，一根在近心端，（图 6）。
图 6. 兔颈部动脉血管先将一侧动脉远心端丝线结扎紧，然后在近心端用止血钳夹住（止血钳头部用细塑料管包裹，避免损伤动脉）。
用小的尖头眼科剪在两侧丝线中间的动脉壁上剪开一个小口，以便插入塑料静脉插管（或大号钢针头），再用近心端棉线固定静脉插管，避免其从动脉内滑出；轻轻松开止血钳，血液很快沿导管流入三角瓶，直至血流缓慢点滴而出时，以同法在对侧动脉内插管放血，并将动物固定架后端抬高，增加放血量，一般一只家兔可放血80-100mL。
8. 血清分离将血液置室温中凝固约 1hr，然后置 4℃过夜，使血块收缩；用5mL 无菌移液管吸取上层血清，转移至 50 mL 无菌尖底离心管中。
然后将血块自容器壁分离，将血清全部倾入另一 50 mL 无菌尖底离心管，在 4℃下 2,500g 离心 10 分钟，取上清液即血清部分与前述血清混合，将混合血清 4℃1,500g 离心 10 分钟，弃沉淀收集血清。
9. 抗血清保存（1）4℃保存：将抗血清除菌后，加入 0.0l％硫柳汞或 0.1％叠氮钠，液体状态保存于普通冰箱，可以存放 3 个月到半年，效价高时，一年之内不会影响使用。
（2）低温保存：将抗血清除菌后，加入等量甘油，放在-20℃或-40℃，一般保存 5 年抗体效价不会有明显下降。
抗体切忌反复冻融，反复冻融会使抗体效价显著降低。
（二）NDV 鼠抗血清制备1. 小白鼠的捉拿和固定小白鼠较大白鼠温和，虽也要提防被其咬伤手指，但毋需戴手套捕捉。
可先用右手抓住鼠尾提起，置于鼠笼或实验台上，用左手的拇指和食指抓住小鼠两耳后颈背部皮肤，将鼠体置于左手心中，拉直后肢，以无名指及小指按住鼠尾部即可。
有经验者可直接用左手小指钩起鼠尾，迅速以拇指利食指、中指捏住其耳后项背部皮肤亦可。