抗体效价的Elisa测定ppt课件
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《elisa检测技术》ppt课件
优点: 1. 特异性高、准确性好； 2. 实验操作简便，用时短。
缺陷: 1. 运用范围较小，消费难度大。 ——需制备各种酶标抗原或抗体。
间接法ELISA
间接法ELISA是将酶标志在二抗上，当抗体〔一抗〕和包被 在酶标板的抗原结合构成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和 复合物结合，经过测定酶反响产物的颜色可以〔间接〕反映一抗 和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量〔见后图〕。
恒温箱
洗板机
酶标仪
ELISA的类型和方法
实验性质 实验目的
直接法 间接法 双抗夹心法 (直接夹心法) 双夹心法 (间接夹心法) BAS-ELISA 竞争法ELISA
半定量ELISA实验
定量ELISA实验
直接法ELISA
直接法ELISA是将酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上 的抗体或抗原结合构成酶标抗原-抗体复合物，参与酶反响底物， 测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量 〔见后图〕 。该方法可用于检测抗体或抗原。
ELISA的开展概略
自从Engvall和Perlman〔瑞典，1971〕初次报道建立酶联免 疫吸附实验〔ELISA〕以来，由于ELISA技术具有快速、敏感、 简便、易于规范化等优点，使其得到迅速的开展和广泛运用 。
随着生物技术的快速开展，将利用基因工程技术制备的抗原 或单克隆抗体包被酶标板后，极大地提高了ELISA检测技术的 特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的运用，使 ELISA更为简便适用和规范化，从而使其成为最广泛运用的检 测方法之一。
酶标板
ELISA常用酶类
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
缺陷: 1. 运用范围较小，消费难度大。 ——需制备各种酶标抗原或抗体。
间接法ELISA
间接法ELISA是将酶标志在二抗上，当抗体〔一抗〕和包被 在酶标板的抗原结合构成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和 复合物结合，经过测定酶反响产物的颜色可以〔间接〕反映一抗 和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量〔见后图〕。
恒温箱
洗板机
酶标仪
ELISA的类型和方法
实验性质 实验目的
直接法 间接法 双抗夹心法 (直接夹心法) 双夹心法 (间接夹心法) BAS-ELISA 竞争法ELISA
半定量ELISA实验
定量ELISA实验
直接法ELISA
直接法ELISA是将酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上 的抗体或抗原结合构成酶标抗原-抗体复合物，参与酶反响底物， 测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量 〔见后图〕 。该方法可用于检测抗体或抗原。
ELISA的开展概略
自从Engvall和Perlman〔瑞典，1971〕初次报道建立酶联免 疫吸附实验〔ELISA〕以来，由于ELISA技术具有快速、敏感、 简便、易于规范化等优点，使其得到迅速的开展和广泛运用 。
随着生物技术的快速开展，将利用基因工程技术制备的抗原 或单克隆抗体包被酶标板后，极大地提高了ELISA检测技术的 特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的运用，使 ELISA更为简便适用和规范化，从而使其成为最广泛运用的检 测方法之一。
酶标板
ELISA常用酶类
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
《elisa检测技术》ppt课件(2024)
拓展ELISA检测技术在生物医学、环境监测 、食品安全等领域的应用，推动相关产业的 发展。
2024/1/28
22
06 ELISA实验操作技巧与注 意事项
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23
实验前准备工作建议
01
仔细阅读试剂盒说明书 ，了解实验原理、操作 步骤和注意事项。
2024/1/28
02
准备好所需的试剂、耗 材和仪器，确保它们的 质量和性能符合要求。
去除异常值、缺失值等， 保证数据质量。
2024/1/28
数据转换
对数据进行对数转换、归 一化等处理，以满足后续 分析需求。
统计分析
采用t检验、方差分析等统 计方法，对实验组和对照 组数据进行比较，评估差 异显著性。
13
结果解读与报告撰写
结果解读
根据统计分析结果，结合专业知 识对实验数据进行解读，如判断 样品中目标物质的含量是否超标
《elisa检测技术》ppt课件
2024/1/28
1
目 录
2024/1/28
• ELISA检测技术概述 • ELISA实验方法与步骤 • ELISA实验数据分析与解读 • ELISA技术在生物医学领域应用 • ELISA技术挑战与发展趋势 • ELISA实验操作技巧与注意事项
2
01 ELISA检测技术概述
发展多重ELISA检测技术，实现对多个目标物的同时检测，提高检 测效率。
20
新型ELISA技术发展趋势
数字化ELISA
利用微流控、微阵列等技术，实现ELISA检测的数字化、自 动化和智能化。
免疫荧光ELISA
结合免疫荧光技术，提高ELISA检测的灵敏度和特异性。
化学发光ELISA
ELISA法检测抗体效价
ELISA间接法检测抗体效价实验原理：ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），酶联免疫吸附实验。
指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。
ELISA操作过程：（一）抗原包被（蛋白包被浓度一般是0.5 ug-10 ug）①准备ELISA酶标板，根据检测的量包被抗原。
②用包被液（NaHCO3-Na2CO3溶液）梯度稀释抗原，包被100 ul/孔，设置双复孔。
③用保鲜膜密封酶标板，盖上盖，放在装有湿棉花的饭盒中，4℃过夜（16h-24h）。
（二）洗涤①取出酶标板，弃掉保鲜膜，甩掉其中液体，吸水纸上拍干。
②加入洗涤液，300 ul/孔，震荡，室温放置3 min。
甩掉其中液体，吸水纸上拍干。
③共洗涤3次。
④用纯水再洗两次。
（三）封闭①用PBS配制好5%的FBS溶液（封闭液，现用现配）。
②洗涤后加入封闭液300 ul/孔。
③保鲜膜密封酶标板，装饭盒中，37 ℃培养箱2h。
④封闭之后无需洗涤。
（四）一抗孵育①封闭快好前的30分钟准备好一抗（单克隆抗体），用封闭液稀释，稀释梯度1：1000，1：3000，1：9000，1：27000。
同时设置空白组（空白封闭液），阴性对照组（未免疫细胞上清），阳性对照组（多抗）。
②加入一抗100 ul/孔。
③孵育：37℃，1h。
（五）洗涤（六）二抗孵育①用封闭液稀释二抗，二抗稀释度是1：3000。
②洗涤后，加入二抗，100 ul/孔。
③孵育：37℃，45 min。
（七）洗涤（洗涤五次，再用纯水洗涤两次）（八）底物显色①配制底物液（一块板用量，96孔，10 ml）：1×甲液4.86 ml +1×乙液5.14 ml + 4 mgOPD（3-4粒），迅速混匀。
待充分溶解后加入30% H2O2 50ul 即可。
注：OPD（邻苯二胺）有致癌性，操作时应戴手套。
底物液需现用现配，H2O2最后加，不然过一会儿就变黄了。
间接ELISA测定抗体的效价
间接ELISA测定抗体的效价【目的】测定样品中抗体的效价（Titer）【基本原理】将特异性抗原包被在固相载体上，加入含待测抗体的样品，使之与固相抗原结合（Ag-Ab），再加入酶标记的抗抗体（亦称二抗），与上述Ag-Ab复合物结合形成Ag-Ab-α-Ab-E复合物。
此时加入底物，复合物上的酶则催化底物而显色，以酶与底物的显色反应程度来确定待测抗体的效价。
由于每步之间均有冲洗步骤，因此若样品中不含相应的抗体，酶标抗体则将被洗掉，底物不显色而呈阴性反应。
间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
1.包被固相载体常用聚苯乙烯微孔板，因为聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。
吸附主要为物理吸附，不发生化学反应，效果与缓冲液的浓度、pH、温育时间，载体表面性质等有关。
缓冲液宜偏碱性，离子强度较低，有利于蛋白质的吸附。
2.封闭由于血清中含有高浓度的非特异性抗体，因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质(例如牛血清蛋白)再包被一次，以封闭固相上的空余间隙。
可用含1％BSA、1％明胶3－5％脱脂奶粉封闭。
酶标抗体可以用含BSA的PBS稀释，以减少非特异性吸附。
3.温育温育最好用水浴，室温也可，微孔板浮在水浴面可使温度迅速平衡。
且板上应加盖，避免蒸发。
应用酶促反应动力学原理，低温可提高结合率，高温可加速反应。
4.待测样品待测样品溶液中需不存在与标记酶相同的酶、底物、酶抵制剂和其它干扰因素，以防止干扰作用。
在检测过程中样本须先行稀释到适当浓度(1:40~1:200)，以避免过高的阴性本底影响结果的判断。
5.洗涤洗涤实验操作过程中决定实验成败的一个关键步骤。
目的是除去未结合的免疫反应物，终止抗原抗体的继续结合，除去标本中与反应无关的成分和游离的酶结合物以及反应过程中吸附在固相载体上的非特异性干扰物。
洗涤次数一般为3～4次，每次3分钟,要微微震荡，特别是最后一次，如有酶结合物的非特异吸附及残留，会使空白值升高，所以要使洗涤彻底。
《ELISA检测技术》PPT课件
洗涤
洗涤在ELISA过 程中虽不是一个 反应步骤，但却 也决定着实验的 成败。
聚苯乙烯等塑料对蛋白 质的吸附是普遍性的而 在洗涤时可清除在反应 过程中非特异性地吸附 于固相载体的干扰物质
洗涤时可清除残留在 板孔中没能与固相抗 原或抗体结合的物质
洗涤方式（浸泡式）
a.
甩干孔内反应液；
b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，
即甩去）；
c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置3分钟，间
歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；
d. 甩去液体后在吸水纸上拍干；
e.重复操作c和d，洗涤3次。
保 温
1）在ELISA中抗原抗体反应的完成需要 有一定的温度和时间，这一保温过程称
为温育。
2）温育常采用的温度有43℃、37℃、室 温和4℃（冰箱温度）等。 3）保温时为避免蒸发，板上应加盖，也 可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔。
• 抗原或抗体能物理性地吸附于固相表面， 并且保持其免疫活性； • 抗原或抗体能与酶通过共价键形成酶结 合物，同时保持各自的免疫活性和酶活 性； • 酶结合物与相应的抗原或抗体结合后， 能通过加入底物的颜色反应来确定免疫 反应的发生，颜色反应的深浅与标本中 相应抗原或抗体的量成正比。
ELISA 的分类、原理和操作
显色和比色
显色是ELISA中的最后一步温育反应，此 时酶催化无色的底物生成有色的产物。 在定量测定中，加入底物后的反应温度 和时间应按规定力求准确。定性测定的显 色时间一般不需要严格控制及时判断。 比色使用酶标比色仪在405nm波长读数。 若要终止反应，以防反应过度，常用的碱 性磷酸酶反应终止液为1M NaOH,每孔 100ul。
竞争法 原理：通过a组和b组显色的差异，来确定标 本中待测蛋白的量
ELISA的原理PPT课件
洗涤
洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验 的成败。
ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。 清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物 质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种
非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。
可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
1.定义 2.分类
用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液） 中未知抗体或抗原的方法。
➢ 间接法（Indirect ELISA）：
• 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗 • 检测液相中未知抗体
➢ 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)：
Please Criticize And Guide The Shortcomings
讲师：XXXXXX XX年XX月XX日
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体）按不同的步骤与固相载体表面的抗原（或抗体） 起反应。
④用洗涤的方法去除未结合的酶标抗原（或抗体），最 后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成 一定的比例。
⑤加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物。 ⑥产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据
颜色反应的深浅来定性或定量分析。
免疫标记
显色
HRP的底物
DH2+ H2O2 E D+ 2H2O
上式中， DH2为供氢体， H2O2为受氢体。
DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。 DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS 。
elisa免疫测定-医学免疫学ppt课件
钩状效应（hook effect）
一般情况下的双抗 体夹心法ELISA反应
抗原过量时 一步法ELISA反应会
出现钩状效应
钩状效应 强阳性----------------假阴性 方法：稀释后再测
特点：不易发现 避免：结果回顾、诊断提示、临床沟通
间接法的影响因素
正常血清中所含的高 浓度的非特异性抗体
温育时间足够。 保温的方式一般采用水浴或电热块。 温育的温度和时间应按规定力求准确。
洗板
分离游离的和结合的酶标记物 洗板的方式：自动洗板仪；手工操作有浸泡式和
流水冲洗式 倾倒液体的方式
甩干孔内液体：应注意交叉污染和个人防护 吸干孔内液体：吸干应彻底，可用水泵或真空 泵抽吸（推荐） 如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。
EDTA、酶抑制剂(如NaN3)可抑制ELISA系统中辣根过氧化 物酶活性,造成假阴性
标本凝固不全,形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳 性结果
标本中有内源性干扰物, 不同程度影响检测结果。常见 的干扰物质有：类风湿因子、补体、交叉反应物质和其 他物质等
试剂准备
试剂的准备
选择高质量的试剂是保证结果准确的关键 室温平衡 所用蒸馏水或去离子水应保证质量
ELISA的概念 酶联免疫吸附试验的反应原理及操作中注意事
项 常见问题原因分析及解决 结果的报告解释
ELISA的概念
• ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971年由荷 兰和瑞典的学者提出，操作过程简单易行并可以 定量，从而使其在免疫学检测中得到了广泛的应 用。
•ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA） 。基础:抗 原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的 底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中 受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。
免疫学：酶联免疫吸附(ELISA)法检测抗体的效价
✓ HRP标记羊抗小鼠IgG —— 二抗（按说明书稀释使用， 用PBST稀释）
✓ 包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液（NaHCO3 1.59克，NaHCO3 2.93克，加水至1L）
✓ 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS（氯化钠 8.5g,十二水磷酸氢二钠2.85克或二水磷酸氢二钠1.13克， 氯化钾0.2克，磷酸二氢钾0.27克，蒸馏水1000毫升 ）
免疫酶测定法
(Enzyme ImmunoAssay,EIA)
• 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。
– 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)
• 特点：
✓ 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 ✓ 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 ✓ 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值
酶联免疫吸附（ELISA）法检测 抗体的效价
免疫标记技术
1.定义：
将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射 性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通 过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。
2.分类：
✓ 放射免疫测定法：131I，32P ✓ 免疫荧光技术：FITC，PE ✓ 免疫酶测定法：HRP，AP
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
3. 原理（以间接性ELISA为例）：
显色
实验材料
✓ 牛血清白蛋白（BSA)—— 抗原，2%（W/V）溶液，PBS 配制
✓ 小鼠抗血清—— 待测样品，用PBST从1：1000开始倍 比稀释，连续稀释8个稀释度
• 分类：
✓ 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 ✓ 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。
✓ 包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液（NaHCO3 1.59克，NaHCO3 2.93克，加水至1L）
✓ 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS（氯化钠 8.5g,十二水磷酸氢二钠2.85克或二水磷酸氢二钠1.13克， 氯化钾0.2克，磷酸二氢钾0.27克，蒸馏水1000毫升 ）
免疫酶测定法
(Enzyme ImmunoAssay,EIA)
• 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。
– 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)
• 特点：
✓ 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 ✓ 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 ✓ 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值
酶联免疫吸附（ELISA）法检测 抗体的效价
免疫标记技术
1.定义：
将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射 性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通 过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。
2.分类：
✓ 放射免疫测定法：131I，32P ✓ 免疫荧光技术：FITC，PE ✓ 免疫酶测定法：HRP，AP
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
3. 原理（以间接性ELISA为例）：
显色
实验材料
✓ 牛血清白蛋白（BSA)—— 抗原，2%（W/V）溶液，PBS 配制
✓ 小鼠抗血清—— 待测样品，用PBST从1：1000开始倍 比稀释，连续稀释8个稀释度
• 分类：
✓ 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 ✓ 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。
_抗体效价的Elisa测定52页PPT
文 家 。汉 族 ，东 晋 浔阳 柴桑 人 （今 江西 九江 ） 。曾 做过 几 年小 官， 后辞 官 回家 ，从 此 隐居 ，田 园生 活 是陶 渊明 诗 的主 要题 材， 相 关作 品有 《饮 酒 》 、 《 归 园 田 居 》 、 《 桃花 源 记 》 、 《 五 柳先 生 传 》 、 《 归 去来 兮 辞 》 等 。
1
0
、
倚
南
窗
以
寄
傲
，
审
容
膝
之
易
安
。
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
_抗体效价的Elisa测定
6
、
露
凝
无
游
氛
，
天
高
Байду номын сангаас
风
景
澈
。
7、翩翩新 来燕，双双入我庐 ，先巢故尚在，相 将还旧居。
8
、
吁
嗟
身
后
名
，
于
我
若
浮
烟
。
9、 陶渊 明（ 约 365年 —427年 ），字 元亮， （又 一说名 潜，字 渊明 ）号五 柳先生 ，私 谥“靖 节”， 东晋 末期南 朝宋初 期诗 人、文 学家、 辞赋 家、散
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。——苏联
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南
窗
以
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傲
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41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
_抗体效价的Elisa测定
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Байду номын сангаас
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景
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7、翩翩新 来燕，双双入我庐 ，先巢故尚在，相 将还旧居。
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我
若
浮
烟
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9、 陶渊 明（ 约 365年 —427年 ），字 元亮， （又 一说名 潜，字 渊明 ）号五 柳先生 ，私 谥“靖 节”， 东晋 末期南 朝宋初 期诗 人、文 学家、 辞赋 家、散
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。——苏联
ELISA检测抗体ppt课件
抗体水平（ELISA后续步骤）
※重点实验※(写实验报告）
ppt课件.
2
成绩
◦ 课堂表现及出勤情况，占5分 ◦ 实验报告，占10分 ◦ 期末考试，占10分
ppt课件.
3
复习第一次课操作
SRBC冻融稀释（得到比例适当的抗原，非完整的红细胞）
↓
每孔加包被液（碳酸盐缓冲液，含抗原）100μl, 37℃ 1h （包被）
4 加完后统一放入37度温箱1h(大于1h)。
加入酶（HRP）标记二抗
ppt课件.
9
加入底物-酶促反应-反应终止
1 弃液 2 用PBS洗板7次，200μl/每孔，每次一分钟以上，
水平轻微晃动，切勿串孔、溢出。每次洗完用滤纸 拍板，拍干。
3 于8个ELISA孔中分别加入底物100μl/每孔。 4 加完后，室温避光反应10min。 5 反应10min后，于8个ELISA孔中分别加入终止
该法敏感性强，非特异着色浅，背景清晰，因此 把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大提 高ELISA的敏感度。
酶免疫测定技术
ppt课件.
20
是把放射性核素测定和抗原、抗体间的免疫化学 反应两种方法结合起来所形成的一种超微量物质 的测定方法。将抗原抗体反应的特异性与同位素 测定技术的敏感性相结合的一项新技术，具有特 异性强、目前为止灵敏度最高、准确性和精密度 好等优点。而且操作简便、易于标准化，其灵敏 度较高，可达10-9-10-12g水平,是其他分析方法所 无法比拟的。
ppt课件.
7
ELISA步骤 包被
↓ 封闭
↓ 加入待测样本
↓ 加入酶标二抗
↓ 加入底物
↓ 加入终止液，终止反应
ppt课件.
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N eg a tiv e C o n tro l 0 .1 5 3
A ssa y P a tien tA P a tien tB P a tien tC C o n tro l
O .0 5 5
0 .4 1 2
1 .9 9 9
0 .1 2 3
抗体效价的Elisa测定
Protein protein interaction---ELISA
抗体效价的Elisa测定
60年代初期，Averameas & Ram等 建立了免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶---人血清白 蛋白及酸性磷酸酯酶---抗体，统称为酶标记物或酶结 合物，用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定
抗体效价的Elisa测定
实验五 酶联免疫吸附测定BSA抗体效价
1.目的要求 (1)学习酶联免疫吸附测定的基本原理。 (2)掌握酶联免疫吸附测定技术，抗体的效价测定及 酶联免疫测定仪的使用。
抗体效价的Elisa测定
2.基本原理 免疫酶技术:酶标Ab/Ag,酶结合物的酶在免疫反应后， 作用于厎物后显色，根据颜色的有无和深浅，定量测定 Ab/Ag。 免疫反应：一次或数次 具Ag,Ab特异的免疫学反应 酶促反应：只进行一次 显示出生物放大作用，灵敏度ng,pg
直接在细胞、亚细胞、 应用各种液相和固相免疫
超微结构及分子水平上, 分析方法，对体液中的半
对抗原抗体反应进行定 抗原、抗原或抗体进行定
性和定位研究
性和定量测定
抗体效价的Elisa测定
酶标技术
酶------性能稳定、经济易得、底物无色、产物显色， 便于检测 常用的酶:碱性磷酸酯酶、辣根过氧化物酶(horserad peroxidase简称HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。
substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.
基板而改变颜色，当裂解酶附二抗体
抗体效价的Elisa测定
positive
negative
抗体效价的Elisa测定
P o sitiv e C o n tro l 1 .6 8 9
抗体效价的Elisa测定
戊二醛法， 过碘酸氧化法 将酶与Ab交联在一起
Ag-Ab-抗Ab-HRP
TMB+H2O2 产物（黄色，OD450)+H2O
抗体效价的Elisa测定
图一 直接型Elisa
抗体效价的Elisa测定
图二 间接型Elisa
抗体效价的Elisa测定
图三 双抗体夹心型ELISA
抗体效价的Elisa测定
抗体效价的Elisa测定
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
抗体效价的Elisa测定
免疫标记技术
抗体效价的Elisa测定
标记抗体或抗原
荧光素、放射性同位素、酶、 铁蛋白、胶体金及化学(或生物) 发光剂
镜检观察或进行自 动化测定
荧光显微镜，射线测量仪，酶标 检测仪，电子显微镜和发光免疫 及不同浓度的猎物蛋白)
抗体效价的Elisa测定
抗体效价的Elisa测定
4. 操作方法
4.1 包被特异性抗原:固体抗原(如蛋白质)用包被液稀释至10Oμg/ml， 每凹孔加100μL，加盖置4℃过夜(37 ℃ 2h)，次日倾去凹孔内液体， 用滴管取洗涤液在每孔中加3～4滴，静置3min后倾去，重复3次，将反 应板扣放在滤纸上，以除净液体。 4.2 封闭: 每孔中加入200－400μL封闭液，加盖或用封口膜封板，置 37℃恒温箱60min，倾去孔内液体，按上法洗涤3次。
Partially purified, inactivated HIV antigens
antigens pre-coated onto an ELISA plate
部分纯化，灭活病毒抗原 抗原涂到酶标板
Patient serum which contains antibodies. If the patient is HIV+, then this serum will contain antibodies to HIV, and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate.病人血清中含有抗体。如果病人是艾滋病毒+，那么这个血清含有
图四 固相抗体竞争型ELISA 未知抗原量=A（1）-A（2）
抗体效价的Elisa测定
每次反应后都要反复洗涤？ 1. 保证反应的定量反应 2. 防止重叠反应，引起非特异现象。
抗体效价的Elisa测定
抗体效价的Elisa测定
HIV (human immunodeficiency virus) detection
艾滋病毒抗体，这些抗体可以绑定到病毒抗原板
Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to human antibodies.抗人免疫球蛋白耦合酶。这是继抗体，并结合人类抗体
酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称为Elisa)-----是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技 术。本法兼有灵敏度高和特异性强两方面的优点。
抗体效价的Elisa测定
1974年 Voller等 用聚苯乙烯微量反应板作为免疫吸附剂吸附抗体(抗 原)，再与相应的酶标记物结合 操作更方便，易重复 灵敏度可高达ng（10-9g）至pg(10-12g)，
1. Direct elisa different epitope Coat with prey protein Incubate with bait protein Pimary Ab anti bait protein ----直接酶联免疫吸附试验不同表位 外套与猎物蛋白 孵化与诱饵蛋白 原发性抗体抗诱饵蛋白
抗体效价的Elisa测定
petitive elisa same epitope
Coat with bait pr Incubate with primary antibody anti bait pr and various
concentration prey protein(竞争同一表位。