抗体效价测定操作规程
Q_HBY QF0001-2016抗体检验标准操作规程
Q/HBY抗体检验标准操作规程杭州博茵生物技术有限公司发布前 言本规范由杭州博茵生物技术有限公司提出。
本规范起草单位:杭州博茵生物技术有限公司。
本规范主要起草人：李因来、徐东鑫、陈浙、潘剑用。
本规范于2016年7月27日首次发布编制人陈浙日期2016.07.26部门抗体研发部审核人徐东鑫日期2016.07.27部门质量部批准人潘剑用日期2016.07.27部门抗体研发部发放编号Q/HBY QF0001‐2016生效日期2016.07.27抗体检验标准操作规程1.目的对单克隆抗体成品的检验操作做出规定，以保证成品质检结果的准确性。
2.范围适用于下述第6条“合格标准”表格中所列抗体成品的效价测定。
3.职责操作人员依据本规程进行抗体检验。
4.材料与设备、试剂与溶液见下述相关文件。
5.检验方法5.1外观包装完好，无漏液现象，标签准确。
5.2物理性能自然光下目测，观察产品溶液是否澄清、是否有沉淀或悬浮物。
5.3浓度按QC-0004《抗体浓度测定（A280）标准操作规程》测定样品的浓度。
5.4纯度将样品稀释到1mg/ml，按QC-0003《蛋白SDS-PAGE检测标准操作规程》进行检测并作记录。
其中，样品缓冲液含DTT或β-巯基乙醇，样品应加热处理，浓缩胶浓度为3%，分离胶浓度为12%，染色方法为考染。
5.5效价按QC-0002《效价检测标准操作规程》进行。
6.合格标准项目产品M010101M010102外观包装完好，无漏液现象，标签准确包装完好，无漏液现象，标签准确物理性能无色澄清液体、无沉淀、无悬浮物无色澄清液体、无沉淀、无悬浮物浓度≥3mg/ml，且偏差±5%≥3mg/ml，且偏差±5%纯度≥95%≥95%效价 1.28ng/ml 1.28ng/ml 7.相关文件QC-0002《抗体效价检测标准操作规程》QC-0003《蛋白SDS-PAGE检测标准操作规程》QC-0004《抗体浓度测定（A280）标准操作规程》8.相关记录QF-0001-RE-01《抗体检验报告》QF-0002-RE-01《抗体效价检测记录》QC-0003-RE-01《蛋白SDS-PAGE检测记录》QC-0004-RE-01《抗体浓度测定（A280）记录》。
母体IgG抗体效价检测卡操作规程
孕妇血清IgG抗体效价检测操作规程[样本要求]：血样标本最好采用EDTA抗凝（也可以用枸橼酸钠等抗凝），用血清代替血浆进行检测时，用前离心，2000g×10min，防止纤维蛋白干扰反应结果。
[样品准备]：试剂配制：用985ulPH7.4的PBS(或者生理盐水)溶解15ul二巯基乙醇（2-Me）,即为0.2M(2-Me)应用液,密封，避光，置2---6℃保存.红细胞标本的制备：用生理盐水配置红细胞悬液，红细胞最终浓度为1%左右.血清标本的制备：将被检者静脉血采入含兔脑粉或其它促凝剂的试管中,10分钟后离心取上清;或者将被检者静脉血采入无抗凝剂试管中,4℃放置12小时,或37℃放置2小时后离心,2000Rpm,10分钟,取上清.该上清不得有絮状物或沉淀；[配套试剂]：孕妇IgG抗体效价卡，标准A、B、O红细胞（取决于父亲血型），0.2M(2-Me)应用液[实验步骤]1、试剂卡室温平衡，离心一次，标记编号；2、配制中和血浆：先取待检者血浆200微升与生理盐水600微升做4倍稀释，然后取稀释后的标本和0.2M巯基乙醇(2-Me)应用液各200ul，混匀，37℃孵育30---60分钟，（充分破坏标本中IgM类抗体）既得到孕妇的中和血浆。
34、在所有孔中加入50ul健康人O型1%红细胞悬液(测定孕妇ABO血型系统以外IgG血型抗体)或所有孔中加入50ul健康人A型或B型1%红细胞悬液(测定孕妇ABO血型系统IgG血型抗体)，然后加入上述表格中稀释的中和血浆各50ul5、把加有血浆和红细胞的微柱卡置37 ℃专用孵育器孵育15分钟；6、用专用离心机离心5分钟（900r/min2分钟1500r/min3分钟）。
判定结果。
[结果判定]效价值：产生3+凝集的最高稀释度，其倒数即为效价。
[参考值]1、RH系统抗体效价16有临床意义2、ABO系统抗体效价64有临床意义[注意事项]1.据文献报道微柱凝胶法检测出的母体效价值比常规聚凝胺和抗人球蛋白试管法高出1-2个滴度（根据P.L.Mollison所著教材《临床医学中的输血（Blood Transfusion in Clinical Medicine）》）2. 红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应。
疫苗效价测定方法
疫苗效价测定方法疫苗效价测定是评估疫苗质量和有效性的重要指标之一。
通过准确测定疫苗中的有效成分，可以确定疫苗的效力。
本文将详细介绍疫苗效价测定的方法及其步骤，旨在帮助读者了解和应用这一重要的测定方法。
一、疫苗效价测定方法的基本原理疫苗效价测定是通过实验方法测定疫苗中有效免疫物质的含量，进而评估疫苗的免疫力。
一般来说，疫苗效价的测定主要分为两种方法：生物学方法和化学物理方法。
生物学方法是通过动物实验来评估疫苗效力，如活病毒疫苗的TCID50法、灭活疫苗的保护性实验法等。
化学物理方法则是通过测定特定成分的含量来评估疫苗效力，如疫苗抗原含量的酶标法、蛋白质含量的比色法等。
1. 建立实验流程：首先，需要确定实验目的和所需测定的疫苗成分，然后制定实验方案和操作流程，确保实验的可重复性和准确性。
2. 样品制备：样品制备是疫苗效价测定的关键步骤之一。
根据实验方案，选择适当的方法提取和纯化疫苗中的有效成分。
具体方法可以根据疫苗类型和测定对象的不同而有所区别。
3. 样品检测：将制备好的样品进行检测，可以选择合适的化学物理方法或生物学方法进行测定。
比如通过酶标法检测疫苗中的抗原含量，或通过保护性实验评估疫苗的免疫力。
4. 数据处理和分析：根据实验结果，进行数据处理和统计分析，计算出疫苗中有效成分的含量，并评估疫苗的效力。
在此过程中，需要根据实验设计和原理进行相应的计算和判断。
三、疫苗效价测定方法的举例说明以灭活疫苗的抗体测定为例，介绍疫苗效价测定的具体步骤：1. 实验目的：评估灭活疫苗中免疫抗体的含量，以确定疫苗的效力。
2. 实验方案：按照标准操作要求，严格控制所有实验条件，包括实验设备、试剂和动物模型的选取。
3. 样品制备：将灭活疫苗经过特定处理提取出相关免疫抗体。
方法可以采用比色法、酶标法等。
4. 样品检测：选取合适的生物学方法，如酶联免疫吸附试验(ELISA)，进行免疫抗体的定量测定。
5. 数据处理和分析：根据测定结果，计算出免疫抗体的含量，并进行统计分析。
血清抗体效价的检测方法
血清抗体效价的检测方法
血清抗体效价的检测方法主要包括免疫双向扩散法和酶联免疫吸附法（ELISA）。
免疫双向扩散法是一种简便的方法，其基本原理是抗原和抗体在同一凝胶内扩散，相遇后形成特异性的沉淀线。
具体操作步骤是将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。
然而，该方法敏感性较低，易出现假阴性结果。
另一种常用的方法是酶联免疫吸附法（ELISA）。
该方法具有较高的灵敏度，将抗原置于反应板上，然后加入处理过的血清、组织液等检测样品液。
如果测试样本中有抗体，会与抗原结合。
然后加入酶标记的抗体，与样品中的抗体结合。
添加显色剂，显色后，通过吸光度测定抗体含量。
请注意，具体采用哪种检测方法可能需要根据具体情况进行选择，建议您咨询专业医师。
血清抗体效价的测定
实验报告
10.选择波长630nm，将酶标板置于载板台上，开始扫描，测定OD值。
结果如下所示：
思考题：
1.查阅资料，了解共有哪些类型的ELISA实验，以及本实验中所用ELISA属于哪一类？答：本实验中所用ELISA属于间接法ELISA。
①直接ELISA
原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加酶标抗体进行孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
加底物反应。
直接法主要用于测定抗原。
②间接法ELISA
原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，加酶标二抗。
固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。
洗涤后，加底物显色。
③双抗夹心法ELISA
原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。
将特异。
孕妇血清中红细胞血型抗体效价测定标准操作规程
孕妇血清中红细胞血型抗体效价测定标准操作规程1、目的为规范输血科红细胞血型抗体效价测定的技术操作，确保检测结果准确，依据《输血实验室管理程序》4.1.9条款的要求制定本规程。
2、适用范围本文件适用于本院输血科测定IgG抗-A(B)抗体效价，用以评估胎母血型不合妊娠时发生胎儿及新生儿免疫溶血性疾病（HDN）的风险程度及其他临床需要。
3、职责：输血科技术人员负责本实验的技术操作。
4、原理将受检血清（如检测IgG类红细胞血型抗体，先用2-巯基乙醇处理）经连续倍稀释后与表达检测目标抗体对应抗原的试剂红细胞反应，以受检血清凝集试剂红细胞的最高稀释倍数的倒数作为受检血清中检测目标抗体的效价。
5、试剂：生理盐水，0.2mol/L的2-巯基乙醇（2-Me）应用液，博迅的微柱凝胶抗人球蛋白卡，0.8%的A和B型标准试剂红细胞。
6、仪器：XTL-4.7细胞洗涤离心机，博研微术凝胶卡专用孵育器及离心机，电热恒温水浴箱。
7、操作步骤与方法：7.1准备试剂：观察微柱凝胶卡的外观，如有干胶、杂质、气泡不可使用，之后将卡放置室温（18－25℃）平衡，再用专用离心机离心5分钟。
吸取2-Me15μl,加生理盐水至1ml为0.2M 2-Me 应用液。
7.2血清/血浆标本的制备：取血清50ul和150ul的生理盐水作1：4的稀释后再加入0.2M 2-Me应用液200ul混匀，密封试管口，37℃水浴60分钟。
灭活母体血清中IgM时，必须将试管口密封，并经常摇晃试管，以保证灭活效果。
同时用单克隆抗A或抗B作为对照，用来确认2-Me是否有效灭活IgM抗体。
7.3取7只干净试管，做好标记；在第1管中加入处理后的血清200ul和200ul生理盐水，混匀（为1:16稀释）；第2-7管中依次加200ul的生理盐水和前一管中的血清/血浆200ul，做倍比稀释。
7.4将抗人球蛋白卡标记好，从第7管开始到第2管依次将倍比稀释后的相应50ul血清分别加入标记孔中。
ELISA方法确定制备抗体效价的标准操作规程
ELISA方法确定制备抗体效价的标准操作规程（编号：033）1、目的及适用范围该SOP用于规范利用ELISA方法检测制备抗体的标价的操作。
2、主要仪器及试剂离心机、冰箱、37℃恒温箱、酶标仪、洗板机、包被缓冲液、洗涤缓冲液、封闭液、0.2M Na2HPO4、0.1 M 柠檬酸、0.1 M EDTA、A、B底物反应液、终止液、HRP标记二抗（ELISA效价1:10000-100000）3、操作步骤3.1 目的蛋白的纯化；3.2 免疫兔子或小鼠；3.3 采集免疫动物的血清；3.4 抗原包被，每孔包被抗原50-200ng，4℃包被过夜或37℃包被5h；3.5 用封闭液37℃封闭3h或4℃封闭过夜，然后用PBST洗涤3次，每次2min；3.6 将抗体（免疫血清）和阴性血清分别按1:1000，1:2000，1:5000，1:10000和1:50000稀释后，每孔加入50μL，37℃温育45min，用PBST洗涤5次；3.7 加入相应的HRP标记二抗，37℃温育30min，用PBST洗涤5次；3.8 每孔分别加入50μL A液和B液，然后每孔加入50μL终止液；3.9 测定其A450nm，如果样品孔与阴性对照孔A450nm比值大于2.1最高稀释倍数为抗体效价。
3.10 抗体效价评定：一般来说，用重组蛋白作为抗原免疫动物所得到的免疫血清，其ELISA效价应不低于1:5,000。
为了能更充分验证制备抗体的效价及特异性，最好是联合Western-blot及IFA 等方法一起来检测制备抗体的效价及特异性。
4、注意事项4.1免疫抗原选择要点4.1.1尽量选择标签比较小的载体来纯化目的蛋白，而且在克隆目的基因时尽量去除载体序列。
如可以选择PET-30a载体(His标签)作为表达载体时，尽量选择Nde I/Xho I这两个酶切位点来克隆目的基因。
4.1.2重组蛋白纯度应不低于90％。
一般来说，纯度在90％以上的蛋白，取10μg电泳，在SDS-PAGE 胶上应基本看不到杂带。
抗体效价滴定操作规程
抗体效价滴定操作规程抗体效价是衡量抗体活性和浓度的重要指标，在医药研究和临床应用中有着广泛的应用。
抗体效价滴定操作规程是对进行抗体效价测定的步骤和方法进行规范和描述的文件，下面是一个关于抗体效价滴定操作规程的示例，包括前期准备、试验步骤和结果判定等内容。
一、前期准备1.阅读相关文献和实验说明书，了解抗体效价滴定的原理和方法。
2.了解实验所需物品清单，准备好所需的试剂、试管、移液器等实验器材。
3.检查实验设备，确认设备处于正常工作状态。
4.准备好质控抗体和待测抗体溶液，并按实验要求进行稀释。
二、试验步骤1.根据实验要求，将待测抗体和质控抗体分别加入试管中。
2.通过稀释系列将质控抗体稀释为一系列不同浓度的溶液。
3.充分混匀待测抗体和质控抗体溶液，保证溶液均匀。
4.将待测抗体和质控抗体溶液放置于室温，使其达到相同的温度。
5.取一组试管，依次加入相同体积的质控抗体溶液和待测抗体溶液，混匀后，在每个试管中加入适量的相同抗原。
6.将试管放置于恒温箱或洗涤器中，进行适当的培养时间，使抗原和抗体充分反应。
7.取出试管，加入适量的二抗或底物，并根据实验要求，进行适当的显色反应。
8.根据显色反应的颜色深浅和强度，判断抗体效价的高低。
9.计算抗体效价的对数，确定抗体效价。
三、结果判定1.根据检测结果，得出相应的抗体效价，记录在实验记录表中。
2.将实验结果进行统计和分析，确定最终的抗体效价。
3.根据实验结果，进行抗体效价滴定的质控和质量保证。
四、实验安全1.在操作过程中，注意安全操作，避免溶液的直接接触和飞溅。
2.使用刀片或针头等锐利物品时，要特别注意安全，防止划伤和刺伤。
3.遵守实验室的安全规定，佩戴实验室服装和防护设备，保证实验操作的安全性。
五、实验记录和数据处理1.记录实验过程中的各个步骤和操作细节，包括使用的抗体和试剂名称、溶液浓度和体积等。
2.记录显色反应的颜色深浅和强度，以及操作过程中的问题和异常情况。
3.对实验结果进行统计和分析，计算抗体效价的平均值和标准偏差，并进行结果的合理解释和讨论。
血清效价检测
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血清效价检测
一、技术说明
抗体效价测定是指测定抗体的物理状态及其在体内的滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。
本实验是采用间接ELISA检测血清效价。
二、技术原理
利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体。
三、技术流程：
（一）实验准备
（1）实验材料：免疫抗原
（2）试剂和耗材：1x PBS（pH7.2)：8gNaCl,0.2g KCl,3.62gNa2HPO4.12H2O, 0.24g KH2PO4定容至1L；BSA、PBST、HRP标记羊抗鼠二抗、TMB、1M HCl、酶标板。
（3）仪器和设备：恒温培养箱、酶标仪
（二）实验步骤
（1）抗原包被：抗原(PBS稀释，终浓度2μg/mL，100μL/孔)，4℃包被过夜。
（2）封闭：2%BSA(150Μl/孔)，37℃封闭2h。
（3）一抗孵育：血清首孔稀释1000倍后逐级稀释3倍梯度（PBS稀释，100μL/孔），37℃孵育1h，PBST洗5次，每次150μL。
（4）二抗孵育：加入对应二抗（Goat-anti-mouse-IgG-HRP，1%BSA稀释，100μL/孔）37℃孵育1h，PBST洗5次，每次150μL。
（5）显色：加入TMB100μL,室温避光显色10min。
（6）终止读数：加入100μl/孔1M HCl，终止反应，OD450读数。
孕妇母体IgG抗体效价检测操作规程
孕妇母体IgG抗体效价检测操作规程
【原理】新生儿溶血病HDN发生的主要原因在于母子血型不合,血型系统最主要的类型为ABO血型系统本实验采用微柱凝胶检测孕妇血清中的抗A、BIgG抗体效价。
【试剂】 6%牛血清白蛋白生理盐水凝胶卡
【标本采集】孕妇静脉血3毫升、孕妇爱人静脉血3毫升EDTA-NA抗凝。
将孕妇标本制作成血清标本孕妇爱人标本制成0.5%红细胞标本用生理盐水洗涤后配制【操作步骤】
1.取孕妇血清标本50微升加入等体积的牛血清白蛋白，37度水浴温育60分钟
2.将血清倍比稀释成9管依次为1 4、8、16、32、64、128、512、1024、2048管
3.将卡作好标记在所有孔中加入经处理好的孕妇血清标本50ul
4. 然后在所有孔中加入50ul的孕妇爱人0.5%红细胞标本
5. 37度孵育15分钟专用孵育箱
6.专用离心机离心5分钟 900rpm2分钟 1500rpm3分钟
7. 取出判定结果
【结果判定】
阳性结果红细胞凝集块位于凝胶表面或凝胶中
阴性结果红细胞完全沉降到胶底部在凝胶管底部形成红细胞扣。
【结果报告】产生1+阳性凝集的最高稀释度其倒数即为效价。
【注意事项】 1.红细胞标本一定不能被细菌污染否则出现假阳性反应尽可能应用当日采集的新鲜血做本实验。
如不得不用过夜血或陈旧血则必须首先用该标本做阴性对照试验以确定该标本是否可以做本试验。
2.血清标本血清标本必须充分去除纤维蛋白否则标本中纤维蛋白在微柱凝胶中析出阻碍红细胞沉淀呈假阳性反应。
3.如在微柱凝胶中出现溶血现象强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应也不排除其他原因所臻溶血故对此标本一定认真分析并向上级主管技术人员报告并讨论。
红细胞血型抗体效价测定标准操作规程
红细胞⾎型抗体效价测定标准操作规程红细胞⾎型抗体效价测定标准操作规程⼈⾎清中抗-A、抗-B主要为IgM型，⼩部分为IgG型。
IgM型分⼦由5个辐射状排列的单体组成，单体间通过µ链倒数第⼆位的⼆硫键与J链互相连接，单体间的⼆硫键⽐单体内的链间及链内⼆硫键容易被巯基试剂破坏。
IgM型分⼦经巯基试剂处理后，裂解为6~7s亚单位，仍保持与抗原结合的能⼒，但已失去其与红细胞凝集的作⽤。
IgG抗体分⼦则不被巯基试剂灭活，保持与相应红细胞致敏的⾎清学特性。
1.⽬的为规范红细胞⾎型抗体效价测定的技术操作，依据《输⾎实验室管理程序》的要求制定本章程。
2.适⽤范围适⽤于医疗机构输⾎科（⾎库）测定IgG抗-A、IgG抗-B及IgG或IgM类红细胞不规则抗体效价，⽤以评估母婴⾎型不合的新⽣⼉溶⾎病的风险程度及产前检查等其他临床需要。
3.职责医疗机构输⾎科(⾎库)技术⼈员负责红细胞⾎型抗体效价测定。
4.原理检测IgM类红细胞⾎型抗体，将受检⾎清经连续倍⽐稀释后与表达检测⽬标抗体对应抗原的试剂红细胞反应，以受检⾎清凝集试剂红细胞的最⾼稀释倍数的倒数作为受检⾎清中检测⽬标抗体的效价，并根据“红细胞凝集强度与评分标准”评分，完成对IgM类红细胞抗体效价的测定。
若检测IgG类红细胞⾎型抗体，则先⽤巯基试剂2-Me 裂解其中的IgM型抗体，经巯基试剂2-Me处理后再测定IgG类红细胞⾎型抗体。
5.所需材料和设备5.1.材料3%～5%的A、B型反定型试剂红细胞、0.2 mol/L⼆巯基⼄醇(2-Me)应⽤液、抗球蛋⽩试剂、待检者⾎标本、微柱凝胶抗球蛋⽩卡。
5.2.设备普通离⼼机、普通显微镜、电热恒温⽔浴箱、⾎型⾎清学专⽤离⼼机、微柱凝胶卡专⽤孵育器及离⼼机。
6.检测环境室温应控制在18-27℃，湿度应控制在30%-70%。
7.步骤与⽅法7.1.盐⽔介质法测定IgM类红细胞⾎型抗体效价：7.1.1.排试管12⽀，编号，第2⾄第12管每管加⽣理盐⽔0.1ml，在第1管及第2管加受检者⾎清各0.1ml，将第2管混匀后吸出0.1ml，移⾄第3管内，以此类推，连续倍⽐稀释⾄第12管（2048倍）。
抗体效价测定操作规程
抗体效价测定操作规程 Hessen was revised in January 2021抗体效价测定操作规程操作步骤：一．IgG类1.IgG类抗体效价滴定，须取适量血清200μL加等体积2—Me溶液混合，封口，置37℃水浴箱作用60分钟，先稀释血清：200L病人血清600L生理盐水备用，排列6支试管按顺序编号。
第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L，在第一管和第二管中各加入稀释血清200L，第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。
这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256。
2.加红细胞悬液（自配红细胞悬液同反定型试剂）每管各加2％相应红细胞悬液200L，混匀。
（如待检血清抗体为抗A，则加入A型标准红细胞悬液；如待检血清抗体为抗B，则加入B型标准红细胞悬液；如待检血清中既有抗A又有抗B，则倍量稀释两份血清，一份加入A型标准红细胞悬液，另一份加入B型标准红细胞悬液；）3.先直接观察离心结果，之后在每管分别加入凝聚胺试剂盒中的R1液3d，混合30S均匀后，在各加R2液2滴，操作方法同凝聚胺交叉配血法，然后判读结果。
通常以肉眼观察到的第一个“±”的凝集管作为判断的终点，终点血清稀释度的倒数为效价（Titer），或称滴度。
二．IgM1.血清连续倍量稀释法先稀释血清：100L病人血清+700L生理盐水备用，排列6支试管按顺序编号。
第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L，第一管和第二管中各加入稀释血清200L，第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。
这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256。
抗体效价的Elisa测定实验步骤
60年代初期，Averameas & Ram等 建立了免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶---人血清白 蛋白及酸性磷酸酯酶---抗体，统称为酶标记物或酶结 合物，用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定
抗体效价的Elisa测定实验步骤
petitive elisa same epitope Coat with bait pr Incubate with primary antibody anti bait pr and various
concentration prey protein
抗体效价的Elisa测定实验步骤
抗体效价的Elisa测定实验步骤
免疫标记技术
抗体效价的Elisa测定实验步骤
标记抗体或抗原
荧光素、放射性同位素、酶、 铁蛋白、胶体金及化学(或生物) 发光剂
镜检观察或进行自 动化测定
荧光显微镜，射线测量仪，酶标 检测仪，电子显微镜和发光免疫 测定仪等
直接在细胞、亚细胞、 应用各种液相和固相免疫
超微结构及分子水平上, 分析方法，对体液中的半
按“METHOD”键选择测试的波长类型（Single或Dual）、波 长大小(340、405、450、490或630nm)、微孔板类型(96孔、 48孔或24孔)。
按 “ MAP” 键 选 择 阅 读 方 式 ( Auto 或 Manual) 、 阅 读 方 向 （Down或Across）、重复方向（Down或Across）、阅读起 始 位 置 （ 输 入 编 号 ） 、 空 白 Map （ Air 、 Full 、 Const 、 Column、P-Down、P-Across）。
抗体效价操作步骤
抗体效价操作步骤
嘿，朋友们！今天咱来聊聊抗体效价操作步骤那些事儿。
你说这抗体效价啊，就好比是一场奇妙的冒险！咱得一步一步来，可不能马虎。
先说说样本采集吧，这就像是去果园摘果子，得挑那些成熟又好的果子呀，不然怎么能酿出美味的果汁呢？采集样本可得小心翼翼，别把好东西给弄砸了。
然后呢，就是准备试剂啦，这试剂就像是冒险途中的魔法药水，得准备得妥妥当当的。
可别拿错了或者少了啥，不然这冒险可就进行不下去咯。
接下来就是关键的一步啦，反应！这就好像是一场精彩的比赛，抗体和抗原在里面你争我夺，咱可得好好看着，别错过任何精彩瞬间。
孵育的过程呢，就如同让种子在温暖的土壤里慢慢发芽，得给它足够的时间和适宜的条件呀。
洗板的时候呀，就像是给我们的冒险场地打扫卫生，把那些不需要的东西都清理掉，让场地干干净净的。
加酶标试剂，嘿，这就像是给冒险加了一把火，让一切变得更热闹起来。
再经过孵育和洗板，就快到关键时刻啦！显色，哇，这就像烟花绽放的那一刻，让人充满期待呀。
最后一步，测吸光度，这就像是给我们的冒险成果打分，看看我们做得好不好。
你想想，要是在哪个步骤出了岔子，那不就像冒险中摔了一跤，可能就达不到目的地啦！所以呀，每个步骤都得认真对待，就像对待宝贝一样。
在这个过程中，咱可得保持耐心，别着急，一步一步稳稳地走。
就像盖房子，一砖一瓦都得垒好，不然房子可就不结实咯。
反正啊，抗体效价操作步骤可真是个有趣又重要的事儿，咱可得好好琢磨，好好实践。
这样才能在这场奇妙的科学冒险中取得好成绩呀！。
ELISA法测定单克隆抗体的效价的操作步骤
ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。
该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。
一、实验目的1、深入了解ELISA法测定抗体效价的原理。
2、掌握ELISA法测定单克隆抗体效价的方法。
间接ELISA效价图二、实验原理探生网（）提醒ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
免疫酶技术是将酶标记在抗体 /抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。
该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。
ELISA法是免疫酶技术的一种，其特点是利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原/抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应都在其中进行。
在每次反应后都要反复洗涤，这既保证了反应的定量关系，也避免了末反应的游离抗体/抗原的分离步骤。
在ELISA法中。
酶促反应只进行一次，而抗原、抗体的免疫反应可进行一次或数次，即可用二抗(抗抗体)、三抗再次进行免疫反应。
目前常用的几种ELISA方法有：测定抗体的间接法，测定抗原的双抗体夹心法和测定抗原的竞争法等。
本实验采用间接法测定单克隆抗体效价。
其主要过程为：首先将已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反应板的凹孔内，加待测抗体，保温后洗涤以除去未结合的杂蛋白质，加酶标抗抗体，保温后洗涤，加底物保温30分钟后，加酸或碱终止酶促反应，用目测或光电比色测定抗体含量。
三、仪器、原料和试剂仪器聚苯乙烯96孔酶标板、微量移液管、酶联免疫阅读仪、水浴锅。
原料单克隆抗体试剂1、抗原及酶标记抗体①抗原：兔抗人IgG(RabbitAanti-humanIgG，CodeNo.A0423);②酶标抗抗体：兔抗鼠IgG-HRP(RabbitAnti-mouseIgG-HRP，CodeNo.P0260);均为DAKO公司产品，使用时按照说明书要求稀释。
效价的测定
二、免疫血清（浆）的效价测定—溶血法实验原理该方法的基本原理是根据补体的经典激活途径，即当抗原抗体复合物存在时，补体系统被激活，最后形成的攻复合体可使细胞性抗原溶解。
当实验中抗原和补体的量固定不变，且对于抗体相对过量时，则随着抗体量的不同，被溶解的细胞性抗原的量也不同，两者成正比关系，因此根据溶解的抗原的多少就可以判断出抗体的量。
实验材料1. 待测免疫血清（浆）2. 20%SRBC3. 补体4. 生理盐水5. 试管实验方法1. 将前面获得的小鼠抗 SRBC 免疫血浆首先稀释 10 倍，成为 1:10 免疫血浆。
2. 取3个试管,分别编号为A、B、C,用于对1:10免疫血浆的3倍、4倍和5倍稀释，即A号管内为1:30的免疫血浆;B号管为1:40 的免疫血浆；C号管为1:50的免疫血浆。
3. 取 15 支试管，分为A、B、C三列，每列5只，先给每管中加入生理盐水0.5ml,再从A、B、C号管中分别吸取0.5ml血浆加入相应各列的第一个管中,然后各列再进行倍比稀释,血清稀释度如下表：管号 1 2 3 4 5A 列1:60 1:120 1:240 1:480 1:960B 列1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280C 列1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600注意每列的最后一管应该弃去0.5ml液体。
4. 向每个试管中分别加入SRBC0.25ml和补体0.25ml 。
5. 混均各管中的液体,置37°C水浴30~40分钟。
结果判定以发生完全溶血的最高血清稀释度管为效价判定管，其血清稀释度即为免疫血清的效价。
注意事项1. 动物免疫时注意确保SRBC被注射到了腹腔中,要避免注入其他脏器（如肠、膀胱）内。
2. 稀释血清时尽量做到精确，注意用于不同列的吸管不要混用。
思考题1. 影响免疫血清质量的因素有那些？2. 各种检测抗体效价的方法相比有什么优缺点？返回。
抗体效价实验
加蒸馏水至1000mL，调节pH值。滤膜（0.45um）过滤，4℃保存。
2、洗涤缓冲液（PBS-T）
PBS缓冲液：1000mL
Tween-20：0.5mL
调节pH值至7.39。滤膜（0.45um）过滤，室温保存或4℃保存。
3、封闭剂（1.0%BSA/PBS-T）
洗涤缓冲液：1000mL
BSA：10
现配现用
4、抗体稀释液：（pH7.4PBS）：0.0067M PO4+
5、洗涤用PBS（pH 7.4）：0.15M PO4+
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
氯化钠：8.0g
十二水磷酸氢二钠：2.9g
磷酸二氢钾：0.2g
氯化钾：0.2g
加蒸馏水至1000mL，调节pH值至7.39。滤膜（0.45um）过滤，室温或4℃保存。
6、二抗稀释液：同5。
7、终止液：2M H2SO4
水：90ml
浓硫酸：10.64mL
浓硫酸逐滴加入水中，不断搅拌，防止局部过热。4℃保存。
实实验验步步骤骤 1、包被抗原： 用5ug/ml的抗原蛋白包被，每孔100uL。37℃包被1小时。 2、洗板： 取出包被好的96孔板，用PBS-T洗液300uL/孔洗板5次，每次轻轻振荡，拍干。 3、封闭： 每孔加入封闭液 300 uL/孔。封膜， 37℃放置 1 h。 4、洗板： 用PBS-T洗液300uL/孔洗板5次，每次轻轻振荡，拍干。 5、加一抗：抗体浓度：1ug/mL 96孔板上抗体稀释倍数为：1：10；1：20；1：40；1：80；1：160；1：320；1：640；1：1280，共8个稀释梯 度，具体操作如下：
底物显色液TMB直接使用，注意避光放置。100uL/孔，37℃避光放置，约10-20分钟。 10、终止反应： 终止液2M H2SO4，100uL/孔。 11、测OD值： 5分钟内在酶标仪上震荡后读数，检测波长450nm。
ELISA法测定单克隆抗体的效价的操作步骤
ELISA法测定单克隆抗体的效价的操作步骤摘要：ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。
该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。
找产品，上生物帮>> >>一、实验目的1、深入了解ELISA法测定抗体效价的原理。
2、掌握ELISA法测定单克隆抗体效价的方法。
间接ELISA效价图二、实验原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。
该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。
ELISA法是免疫酶技术的一种，其特点是利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原/抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应都在其中进行。
在每次反应后都要反复洗涤，这既保证了反应的定量关系，也避免了末反应的游离抗体/抗原的分离步骤。
在ELISA法中。
酶促反应只进行一次，而抗原、抗体的免疫反应可进行一次或数次，即可用二抗(抗抗体)、三抗再次进行免疫反应。
目前常用的几种ELISA方法有：测定抗体的间接法，测定抗原的双抗体夹心法和测定抗原的竞争法等。
本实验采用间接法测定单克隆抗体效价。
其主要过程为：首先将已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反应板的凹孔内，加待测抗体，保温后洗涤以除去未结合的杂蛋白质，加酶标抗抗体，保温后洗涤，加底物保温30分钟后，加酸或碱终止酶促反应，用目测或光电比色测定抗体含量。
三、仪器、原料和试剂仪器聚苯乙烯96孔酶标板、微量移液管、酶联免疫阅读仪、水浴锅。
原料单克隆抗体试剂1、抗原及酶标记抗体①抗原：兔抗人IgG(RabbitAanti-humanIgG，CodeNo.A0423);②酶标抗抗体：兔抗鼠IgG-HRP(RabbitAnti-mouseIgG-HRP，CodeNo.P0260);均为DAKO公司产品，使用时按照说明书要求稀释。
elisa检测抗体效价
实验目的：实验材料：1、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、浓硫酸、Tween-20 、BSA等。
2、酶标抗小鼠IgG3、TMB溶液配制：1、抗原包被液：PH9.6的碳酸盐缓冲液（0.05 M）批号：称取：Na2CO3（分子量105.99） 1.59 gNaHCO3（分子量84.01） 2.9 g加蒸馏水至1000ml，调PH值。
滤膜（0.45 μm）过滤，4℃保存。
2、洗涤缓冲液(PBS-T) 批号：PBS缓冲液1000 mlTween-20: 0.5 ml调PH值至7.39。
滤膜（0.45 μm）过滤，室温保存或4℃保存。
3、封闭液（1.0% BSA/PBS-T）批号：洗涤缓冲液1000 mlBSA: 10 g现用现配。
4、血清稀释液(pH7.4 PBS)：0.0067 M(PO4+)5、洗涤用PBS (pH7.4), 0.15 M(PO4+) 批号：称取：NaCl8.0 gNa2HPO4·12H2O 2.9 gKH2PO40.2 gKCl0.2 g加蒸馏水至1000 ml，调PH值至7.39。
滤膜（0.45 μm）过滤，室温或4℃保存。
6、二抗稀释液：同洗涤缓冲液7、终止液：2M H2SO4批号：水90ml浓硫酸10.64ml浓硫酸逐滴加入水中，不断搅拌，防止局部过热。
4℃保存。
实验器材：1、1 ml枪头；200 μl枪头；10 μl枪头，。
2、1.5 ml EP管。
3、移液器1 ml、200 μl、100 μl、20 μl、10 μl、2 μl。
4、96孔板（costor，美国）。
5、电子天枰。
6、酶标仪（Labsystems DragonMK3，芬兰）。
7、洗板机（BIORAD MODEL 1575，美国）。
8、电子pH计（SevenEasy S20）。
方法步骤：1 包被抗原：用μg/ml 的蛋白包被，每孔100μl。
密封，4℃过夜。
2 洗板：取出预先4℃包被过夜的96孔板，用PBS-T洗液300 μl/孔洗板5次，每次轻轻振荡，拍干。
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抗体效价测定操作规程
操作步骤：
一.IgG 类
I.IgG类抗体效价滴定，须取适量血清200］加等体积2—Me溶液混合，封口，置37C水浴箱作用60分钟，先稀释血清：200L病人血清
600L 生理盐水备用，排列6 支试管按顺序编号。
第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L，在第一管和第二管中各加入稀释血清200L，第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L 暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。
这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是
1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256 。
2.加红细胞悬液（自配红细胞悬液同反定型试剂）每管各加2％相应红细胞悬液200L，混匀。
（如待检血清抗体为抗A,则加入A型标准红细胞悬液；如待检血清抗体为抗B,则加入B型标准红细胞悬液；如待检血清中既有抗A又有抗B,则倍量稀释两份血清，一份加入A 型标准红细胞悬液，另一份加入B型标准红细胞悬液；）
3.先直接观察离心结果，之后在每管分别加入凝聚胺试剂盒中的R1 液3d,混合30S均匀后，在各加R2液2滴，操作方法同凝聚胺交叉配血法，然后判读结果。
通常以肉眼观察到的第一个“±”的凝集管作为判断的终点, 终点血清稀释度的倒数为效价（Titer ）,或称滴度。
二.IgM
1•血清连续倍量稀释法先稀释血清：100L病人血清+700L生理盐
水备用，排列6 支试管按顺序编号。
第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L,第一管和第二管中各加入稀释血清200L,第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L 暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。
这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是
1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256 。
2. 加红细胞悬液（自配红细胞悬液同反定型试剂）每管各加2％相应红细胞悬液200L,混匀。
（如待检血清抗体为抗A,则加入A型标准红细胞悬液；如待检血清抗体为抗B,则加入B型标准红细胞悬液；如待检血清中既有抗A又有抗B,则倍量稀释两份血清，一份加入A 型标准红细胞悬液，另一份加入B型标准红细胞悬液；）三．此类为IgM 类盐水抗体可立即离心后观察。
四．
五．（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）。