2010010513-凌今-分子生物学作业(基因组与蛋白质组)

1.什么是SNP？试述研究SNP的意义。

答：SNP, 全称Single Nucleotide Polymorphisms，单核苷酸多态性标记,是1996年被美国MIT 的nder提出的,被称为“第三代DNA遗传标记"。

它是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。

在基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入。

从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式,但实际上发生的只有两种,即转换和颠换,二者之比为2 :1。

SNP 在CG序列上出现最为频繁,而且多是C 转换为T ,原因是CG中的C 常为甲基化的,自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。

一般而言,SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。

在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ,人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×106 个。

这可能达到了人类基因组多态位点数目的极限。

这些SNP标记以同样的频率存在在基因组编码区或非编码区,存在在编码区的SNP约有20万个,称为cSNP(coding SNP)。

因此,SNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。

SNP作为继RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)和小卫星DNA重复序列(Minisatellite)、微卫星DNA重复序列(Microsatellite)后的第三代DNA 水平遗传多态性标记，在整个人类基因组中分布密集，与疾病的相关性稳定，是遗传学研究的新工具，在基因研究和药物设计中被广泛应用，被认为是应用前景最好的遗传标记物，其意义是非常深远的。

一是对基础生命科学会产生深远影响,人类基因组计划的DNA测序工作的完成,提供了研究遗传信息秘密的平台,把人类的全基因研究列入了视野范围,大大方便了基因家族的研究,基因结构的研究等。

而SNP标记的确立,不仅便利了遗传病的原因基因的克隆工作,也便利了单基因、多基因病等各种遗传病的研究工作。

SNP还可以用于疾病的连锁分析和未知致病基因的定位。

SNP数量大和分布广，在任何已知或未知致病基因附近都可能找到众多的SNP，并用于遗传病的单倍型诊断。

在有适当的家系资料时，SNP又可用作遗传标记来定位未知基因。

与目前广泛使用的微卫星小卫星基因图比较，未来SNP图的标记更多，分辨率更高，定位基因也更加准确。

此外，基因组的多态性，尤其是SNP多态性能充分地反映个体间的遗传差异。

通过研究遗传多态性与个体对药物敏感性或耐受性的相关性，可以阐明遗传因素对药物效用的影响，从而对医生针对性的用药和药物性的开发提供指导和依据。

二是SNP标记对临床医学的重大意义。

SNP标记首先应该是作为一种有效的遗传多态性标记物为临床医学服务的,比其它的遗传标记物更能真实的反映人种,人群,及个体之间的遗传差异。

我们人类的祖先被认为诞生在非洲大陆,他们的后代,经过了漫长的岁月而移居到了世界各地,产生了不同的人种,人群,经过漫长岁月而产生的突然变异也在不同的人种,人群中固定,形成了遗传的多态性。

因此,对SNP标记的分析可以追踪人类进化的过程。

另外,利用基因分型还可以帮助解释不同的人种、人群、个体对疾病易感性的不同,以及对药物的不同反应能力。

SNP可应用于疾病的关联分析，复杂疾病或过程的基因定位，疾病发病的分子遗传机理的阐明等。

2.简述蛋白质组学研究中，蛋白质分离常用的方法及其原理。

答：对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括：盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。

这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化，同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段，如层析、电泳等。

1、双向凝胶电泳双向凝胶电泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis , 2D电泳)是分离蛋白质最基本的工具。

其原理是:第一向是等电聚集电泳:用pH值呈梯度排列的凝胶,分离等电点不同的蛋白质。

第二向是十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2PEGE):由于带负电荷的SDS 可与蛋白质多肽链结合,掩盖了蛋白质原有的电荷差别,故可分离分子量不同的蛋白质。

双向凝胶电泳不仅用于蛋白质的分离,同时也用于蛋白质的纯化,一张凝胶可分离纯化出几千个甚至上万个蛋白质。

双向凝胶电泳技术存在的问题是不易分离极酸或极碱、极大( > 200kD)或极小( < 10kD) 的蛋白质,不易检测低拷贝( < 1000 拷贝) 蛋白质或难溶解蛋白质2、高效液相色谱（HPLC）HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段，因为蛋白质、多肽的HPLC 应用与其它化合物相比，在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的，更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。

2.1 反相高效液相色谱（RP-HPLC）2.2 疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatogrphy，HIC）HIC是利用多肽中含有疏水基因，可与固定相之间产生疏水作用而达到分离分析的目的，其比RP-GPLC具有较少使多肽变性的特点。

利用GIC分离生产激素（GH）产品的结构与活性比EP-GPLC分离的要稳定，活性较稳定。

2.3 分子排阻色谱（Sizs-Exclusion chromatogrphy，SEC）SEC是利用多肽分子大小、形状差异来分离纯化多肽物质，特别对一些较大的聚集态的分子更为方便，如人重组生长激素（hgH）的分离，不同结构、构型的GH在SEC柱上分离行为完全不同，从而可分离不同构型或在氨基酸序列上有微小差异的变异体，利用SEC 研究修饰化的PEG的分离方法，此PEC具有半衰期长、作用强的特点。

一些分子量较大的肽或蛋白均可利用此法分离分析。

2.4离子交换色谱（Iron-Exchange chromatography,IEXC）IEXC可在中性条件下，利用多肽的带电性不同分离纯化具有生物活性的多肽。

其可分为阳离子柱与阴离子柱两大类，还有一些新型树脂，如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶树脂等。

在多肽类物质的分离分析研究中，对多肽的性质、洗脱剂、洗脱条件的研究较多，不同的多肽分离条件有所不同，特别是洗脱剂的离子强度、盐浓度等对纯化影响较大。

2.5膜蛋白色谱（Chromatography of Membrane Protein,CMP）CMP+分离强蔬水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。

羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。

利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现，样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。

2.6高效置换色谱（High-Performance Displacement Chromatography,HPDC）HPDC是利用小分子高效置换剂来交换色谱柱上的样品，从而达到分离的目的。

它具有分离组分含量较少成分的特性。

利用HPDC鉴定分离了低于总量1%组分的活性人重组生长激素（rHG ）。

2.7 灌注层析（Perfusion Chromatography，PC）PC是一种基于分子筛原理与高速流动的流动相的层析分离方法，固定相孔径大小及流动相速度直接影响分离效果。

试验证明其在生产、制备过程中具有低投入、高产出的特性。

目前市场上可供应的PC固定相种类较多，适合于不同分子量的多肽分离使用。

2 8多维液相色谱多维液相色谱(multi dimentional liquid chromatography)，即将样品在第一根液相色谱柱的洗脱液依次注入后续的色谱柱进行分离的液相色谱柱专用技术。

这种技术可以根据样品组分的性质差别，选择具有最大分离效果的几种色谱分离模式组合(反向色谱、离子交换色谱、分子排阻色谱、亲和色谱或者毛细管电泳等)，对样品进行分离。

样品中各组分以进样点为原点在多维的分离方向上展开。

1987年，Giddings指出，多维联用系统的总分辨率约等于各维分辨率平方和的平方根，总峰容量约等于各维峰容量的乘积，多维分离系统可以减少峰重叠，提高系统的分辨率和峰容量，为样品的定性提供更多的数据信息，它还具有分离速度快、重现性好、自动化程度高的优点。

3 亲和层析（Affinity Chromatography，AC）AC是利用连接在固定相基质上的配基与可以和其特异性产生作用的配体之间的特异亲和性而分离物质的层析方法。

自1968年Cuatrecasas提出亲和层析概念以来，在寻找特异亲和作用物质上发现了许多组合，如抗原-抗体、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸与其互补链等等。

固定金属亲和层析（Immobilized Metal Affinity Chromatography.LMAC）是近年来发展起来的一种亲和方法。

其固定相基质上鳌合了一些金属离子，如Cu2+、Ni2+、Fe3+等，此柱可通过配为键鳌合侧链含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特别是肽序列中含有His-X-X-X-His的结构最易结合到金属离子亲和柱上，纯化效果较好。

其中胰岛素样生长因子（Insylin Like Growth Factor，IGF）、二氢叶还原酶融合蛋白等均用此方法分离到纯度较高的产品。

另一种亲和层析方法，利用反义DNA表达产生，其与正链DNA表达产生的肽或蛋白具有一定的亲和性，如Arg加压素受体复合物，已用此法分离得到。

DNA与蛋白、多肽复合物之间的作用也是生物亲和中常用的方法。

将人工合成的寡核苷酸结合在固定相基质上，将样品蛋白或多肽从柱中流过，与之结合可达到分离特定结构多肽的目的。

4 毛细管电泳（Capillary electrophoresis，CE）--分离分析方法CE是在传统的电泳技术基础上于本世纪60年代末由Hjerten发明的，其利用小的毛细管代替传统的大电泳槽，使电泳效率提高了几十倍。

此技术从80年代以来发展迅速，是生物化学分析工作者与生化学家分离、定性多肽与蛋白类物质的有利工具。

CE根据应用原理不同可分为以下几种；毛细管区带电泳Capillary Zone electrophoresis，CZE）、毛细管等电聚焦电泳（Capillary Isoeletric Focusing，CIEF）毛细管凝胶电泳（CapillaryGelElectrophoresis，CGE）和胶束电动毛细管层析（Micellar Electokinetic Electrophoresis Chromatorgraphy,MECC）等。