羊布鲁氏菌非编码小RNA分子BSR_2的预测与鉴定

ISSN 1007-7626CN 11-3870/Q中国生物化学与分子生物学报Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology2010年10月26（10）：923 929收稿日期：2010-06-07；接受日期：2010-07-22国家传染病重大专项（No.2008ZX1004-015），国家重点基础研究发展规划（973计划，No.2009CB522602）*联系人Tel ：86-10-66948434；E-mail ：yufeiwang21@ （王玉飞）Tel ：86-431-87836161；E-mail ：bo_liu@ （刘波）Received ：June 7，2010；Accepted ：July 22，2010Supported by National Key Program for Infectious Disease of China （No.2008ZX10004-015）and Major State Basic Research Development Program of China （973Program ，No.2009CB522602）*Corresponding author Tel ：86-10-66948434；E-mail ：yufeiwang21@ （Wang Yu-Fei ）Tel ：86-431-87836161；E-mail ：bo_liu@ （Liu Bo ）羊布鲁氏菌非编码小RNA 分子BSR-2的预测与鉴定王同坤1），2），王立贵2），陈泽良2），杜昕颖2），汪舟佳2），黄留玉2），刘波1）*，王玉飞2）*（1）吉林大学畜牧医学院，长春130062；2）军事医学科学院疾病预防控制所，北京100071）摘要利用RT-PCR 和RACE 等方法对生物信息学预测的羊布鲁氏菌非编码小RNA （small non-coding RNA ，sRNA ）BSR-2进行了实验鉴定，并通过分析BSR-2在胞内生存缺陷株中的转录情况以及预测BSR-2的靶标基因对BSR-2的功能进行初步探讨.RT-PCR 结果表明，BSR-2在羊布鲁氏菌的总RNA 中存在转录本，而且在不同的应激条件下转录水平不同.RACE 结果表明，BSR-2长224nt ，位于Ⅱ号染色体的BMEII0742和BMEII0743之间的基因间区.进一步的实验结果表明，BSR-2可能与布鲁氏菌的胞内生存能力相关.关键词布鲁氏菌；非编码小RNA ；胞内生存；靶基因中图分类号Q933Prediction and Identification of Small Non-coding RNA BSR-2in Brucella melitensisWANG Tong-Kun 1），2），WANG Li-Gui 2），CHEN Ze-Liang 2），DU Xin-Ying 2），WANG Zhou-Jia 2），HUANG Liu-Yu 2），LIU Bo 1）*，WANG Yu-Fei 2）*（1）College of Animal Science and Veterinary Medicine ，Jilin University ，Changchun130062，China ；2）Institute of Disease Control and Prevention ，Academy of Military Medical Science ，Beijing100071，China ）Abstract The small non-coding RNA （sRNA ）BSR-2in the pathogenic bacterium B.melitensis waspredicted by bioinformatics approach.The expression of BSR-2was examined under different stressconditions （acid shock ，limited nutrition ，and oxidative stress ）simulating the intracellular environmentof macrophage by reverse transcription-PCR （RT-PCR ），and the precise start and endpoint of BSR-2were determined by using the 5ᶄand 3ᶄRACE （rapid amplification of cDNA ends ）experiments.Thetranscriptional profiles of BSR-2in B.melitensis strain deficient for intracellular survival were analyzed.The mRNA targets of BSR-2were predicted by TargetRNA.RT-PCR analysis showed that BSR-2-encodestranscripts were detected under TSB4.0（acid shock ），GEM7.0（limited nutrition ），and H 2O 2（oxidative stress ）in B.melitensis ，verifying the presence of BSR-2.The 5ᶄand 3ᶄends of BSR-2weremapped by RACE experiments ，showed that BSR-2was 224nt.Sequence analyses of BSR-2indicatedthat BSR-2was located on the intergenic regions between BMEII0742and BMEII0743，transcribedindependently of the flanking ORFs ，and highly conserved in Brucella species.The transcriptional profiles of BSR-2were significantly influenced by the mutation of virB and vjbR ，which played important中国生物化学与分子生物学报第26卷role in the Brucella intracellular survival.And BSR-2was predicted to have three mRNA targets，including the transcriptional regulator AraC involved in virulence gene control in B.melitensis.These results indicated that the small non-coding RNA BSR-2was located on the chromosomeⅡof B. melitensis and associated with the intracellular survival of B.melitensis.Key words Brucella；small non-coding RNA；intracellular survival；target gene细菌非编码小RNA（small non-coding RNA，sRNA）是近年来在细菌等原核生物中发现的一类RNA调控子.它们不编码蛋白质，通常位于基因间区，长度在50 500个核苷酸之间，广泛参与体内多种生命活动的调控［1］.细菌sRNA是细菌代谢、毒力和适应环境压力的重要调节因子，在应对环境变化的基因表达调控中发挥重要作用［2，3］.sRNA主要通过碱基配对与靶标mRNA结合来发挥生物调控作用，而且sRNA与靶标mRNA的配对大多需要RNA 伴侣分子Hfq蛋白的参与［4］.迄今为止，大部分细菌sRNA的研究集中在大肠杆菌等模式生物.但随着研究的深入，已有越来越多的研究转向致病菌，如：霍乱弧菌、产单核细胞李斯特菌、铜绿假单胞菌、结核杆菌、沙门氏菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌等.在这些病原菌中，已经证实sRNA在转录后水平调控基因的表达，并在毒力调控中发挥重要作用［3，5 8］.布鲁氏菌病是由布鲁氏菌入侵机体引起的人畜共患传染病，在我国广泛流行，不仅给我国畜牧业生产造成巨大的经济损失，也严重威胁人民的健康生活，是一个重要的公共卫生问题.布鲁氏菌是一种兼性胞内寄生菌，它们主要寄生于机体的单核细胞（主要是巨噬细胞）内，胞内存活和复制是布鲁氏菌致病的关键，而适应胞内的环境又是布鲁氏菌实现胞内生存的关键［9］.因此，了解布鲁氏菌如何适应胞内的恶劣环境并在其中生存对于理解布鲁氏菌的致病机理至关重要.由于sRNA是细菌适应环境压力的重要调节因子，我们推测，sRNA在布鲁氏菌的胞内生存中发挥重要作用.因此，识别布鲁氏菌的sRNA并对其功能进行研究将有助于理解布鲁氏菌的致病机理.已有研究表明，布鲁氏菌内有sRNA的分子伴侣Hfq蛋白，而且Hfq与布鲁氏菌对高氧、酸等胞内环境的适应和毒力有关［10］.但至今为止，在布鲁氏菌中还未见有sRNA的报道.本文利用生物信息学对布鲁氏菌的sRNA进行了预测，共得到21个候选的sRNA分子，对其中的BSR-2进行了实验鉴定，并初步探讨了BSR-2的功能.1材料和方法1.1材料1.1.1菌株和质粒羊布鲁氏菌（Brucella melitensis，16M）是布鲁氏菌强毒株，为本室保存；大肠杆菌（Escherichia coli，DH5α）为本室保存；ΔvirB 和ΔvjbR为本室构建的羊布鲁氏菌胞内生存缺陷株；pMD19-T Simple Vector购自TaKaRa公司.1.1.2引物从NCBI中下载B.melitensis16M （AE008918）的序列，使用Primer Premier5（PREMIER Biosoft International，Palo Alto）软件进行引物设计，设计的引物由北京奥科生物技术有限公司合成.5ᶄ和3ᶄRACE Outer/Inner Primer序列来自TaKaRa公司的5ᶄFull RACE Kit和3ᶄFull RACE Core set说明书.Table1为引物序列.Table1Primer sequence used in this studyPrimer Sequence（5ᶄ→3ᶄ）Sequence No.of AE008918 BSR-2-F GCAACAGAATCGCCTACAATC781718-781698BSR-2-R CGGCTTTTCGCTGTCATTC781611-78162916sRNA-F CACTGGACCATTACTGACGC190440-19045916sRNA-R ACTAAGGGCGAGGGTTGC190831-1908145ᶄRACE Outer CATGGCTACATGCTGACAGCCTA5ᶄRACE Inner CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG3ᶄRACE Outer TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT3ᶄRACE Inner CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG1.1.3试剂大豆胰蛋白胨肉汤（TSB）购自OXOID公司，用于布鲁氏菌的培养；质粒提取试剂盒、随机引物、DNaseⅠ、核糖核酸酶抑制剂RNasin 和逆转录酶M-MLV购自Promega公司；Trizol购自429第10期王同坤等：羊布鲁氏菌非编码小RNA分子BSR-2的预测与鉴定lnvitrogen公司；PolyA聚合酶和ATP购自NEB公司；dNTP、rTaq酶、Premix Ex Taq TM（Perfect RealTime）试剂盒、5ᶄFull RACE Kit和3ᶄFull RACECore set购自TaKaRa公司.1.2BSR-2的生物信息学预测从NCBI（ftp：///genomes/Bacteria/）下载羊布鲁氏菌B.melitensis16M的染色体序列（NC_003317.1和NC_003318.1两条染色体，Ⅰ和Ⅱ），提取基因间区片段.在基因间区用pftools2.3（http：//www.isrec.isb-sib.ch/ftp-server/pftools/）寻找启动子（cut-off值取255），用RNAMotif寻找终止子，其中的motif descriptor来自（http：///sackler/waldorlab/sRNAPredict/），然后再在去冗余基础上预测出具有完整转录单元的基因间区，去除含有tRNA和rRNA的序列.最后，通过与相近的基因组比对，找出保守的基因间区作为候选的sRNA序列.1.3RNA、DNA的操作和序列分析RNA的提取采用Trizol法，为了去除DNA的污染，用DNA酶对抽提的RNA进行处理.质粒DNA提取采用Promega试剂盒.DNA序列分析采用的软件为Artemis和BLAST.RNA二级结果预测采用MFOLD软件（http：///applications/mfold/）.1.4BSR-2的RT-PCR鉴定将培养至对数生长中期（A600=1.6）的16M菌液离心，PBS漂洗3遍.将菌体重悬到等量的不同培养基中进行应激刺激处理.酸刺激是将菌体重悬到TSB培养基（pH4.0）中，37ħ作用20min；营养缺乏刺激是将菌体重悬到GEM培养基［11］（pH7.0）中，37ħ作用20min；高氧刺激是将菌体重悬到含有1.5mmol/L H2O2的TSB培养基（pH7.0）中，37ħ作用20min；同时将菌体重悬于pH7.0的TSB培养基中，37ħ作用20min.刺激处理后用Trizol抽提RNA，Nanodrop1000核酸蛋白微量定量仪测定浓度后，以随机引物为逆转录引物，用M-MLV逆转录酶将其逆转录成cDNA.以不同刺激条件下的16M cDNA为模板，分析预测的BSR-2在不同应激条件下的转录情况，同时以转录相对保守的16S rRNA 作为内参.1.5RACE5ᶄRACE使用Takara Biochemical的5ᶄFull RACE Kit.具体操作见相关说明书.进行3ᶄRACE 实验时，首先利用poly A聚合酶在提取的总RNA的3ᶄ端加上poly A尾，然后以poly（A）-RNA为模板，使用3ᶄRACE Adaptor引物进行逆转录反应，合成cDNA.首先用BSR-2-F和3ᶄRACE Outer Primer进行Outer PCR反应，再用BSR-2-F和3ᶄRACE Inner Primer进行Inner PCR反应.5ᶄ和3ᶄRACE的PCR产物与pMD19-T Simple Vector相连，转入E.coli DH5α感受态细胞，涂布氨苄抗性平板.对抗性平板长出的克隆进行PCR鉴定.首先用BSR-2特异引物进行PCR鉴定，结果为阳性的再进一步用5ᶄRACE inner primer与BSR-2-R（或用BSR-2-F和3ᶄRACE Inner Primer）扩增，阳性克隆送往北京奥科生物技术有限公司测序.测序结果与B.melitensis16M序列进行BLAST比对分析，确定BSR-2的5ᶄ和3ᶄ端.1.6荧光定量RT-PCR检测BSR-2在ΔvirB和ΔvjbR中的转录将培养至对数生长中期（A600=1.6）的16M、ΔvirB和ΔvjbR菌液离心，PBS漂洗3遍，将菌体重悬到TSB培养基（pH4.0）中，37ħ作用20min后提取菌体的RNA，DNase I处理后，逆转录成cDNA.以不同菌株的cDNA为模板，分析预测的BSR-2在不同菌株中的转录情况.BSR-2的定量PCR测定采用Bio-Rad IQ5荧光定量PCR仪.定量PCR反应体系：Premix Ex Taq TM（2ˑ）12.5μL，引物（20μmol/L）各0.5μL，cDNA模板1μL，dd H20加至终体积25μL.反应条件：预变性95ħ15s；扩增95ħ30s，60ħ30s，72ħ30s，50个循环，60ħ单点收集荧光；熔解曲线60ħ30s.每次试验均包括无菌水对照.PCR完成后，根据扩增曲线，确定Ct值，在Excel 软件上进行相对定量研究和统计处理.以16S rRNA 为阳性内对照基因，校正cDNA模板的拷贝数.相对定量采用2－ΔΔCt方法计算，即ΔCt目标基因=Ct（目标基因）－Ct（同一样本16S rRNA）；ΔΔCt目标基因=实验组ΔCt目标基因－对照组ΔCt目标基因，而相对倍数（实验组/对照组）=2－ΔΔCt.实验重复3次.以野生株16M作为对照组，ΔvirB和ΔvjbR作为实验组.1.7BSR-2靶标基因的生物信息学预测利用TargetRNA预测BSR-2靶标基因. TargetRNA主要是利用动态规划算法，在特定的基因组中寻找与sRNA存在潜在碱基配对的mRNA分子.在进行靶标预测时，首先根据情况选择一种模型对候选的sRNA和mRNA序列进行打分，并假定分数遵从极值分布，于是每1个候选靶标得到1个P529中国生物化学与分子生物学报第26卷值，P 值越小，相应的mRNA 越可能是靶标.TargetRNA 可从网上免费获取（http ：// /targetRNA ）.2结果2.1BSR-2的预测通过生物信息学预测，在布鲁氏菌B.melitensis16M 的两条染色体上共预测了21个候选的sRNA 分子.将预测的sRNA 分子命名为BSR （Brucella small RNA ），BSR-2即为我们预测的sRNA 分子之一.BSR-2的预测转录起点为781743，转录终点781583，位于Ⅱ号染色体上.2.2BSR-2在不同应激条件下的转录情况通常细菌sRNA 的表达与应激条件有关.因此，我们利用RT-PCR 对预测的BSR-2在酸、营养缺乏、氧化应激等模拟巨噬细胞内环境的不同应激条件下的转录情况进行了检测.从Fig.1中可以看出，BSR-2在布鲁氏菌的标准培养基TSB7.0中不能转录，在酸（TSB4.0）、营养缺乏（GEM7.0）和氧化应激条件（H 2O 2）等模拟巨噬细胞内环境的应激条件下可以转录.实验结果表明，BSR-2在总RNA 中存在转录本，而且仅在模拟巨噬细胞内环境的应激条件下转录，提示BSR-2可能与布鲁氏菌适应巨噬细胞内环境有关.Fig.1Transcriptional analysis of BSR-2underdifferent conditionsB.melitensis 16M was culturedin TSB to logarithmic phase （A 600=1.6）and subjected to different stresses.Total RNA was isolated and relative transcription of BSR-2was quantified by normalization with 16S rRNA.BSR-2was transcribed under TSB4.0（acid shock ），GEM7.0（limited nutrition ），and H 2O 2（oxidative stress ），but could not transcribed under TSB7.0（normal laboratory conditions ）2.3BSR-2的序列分析通过RACE 获得BSR-2的5ᶄ端为781806，3ᶄ端为781583，长224nt ，其编码基因位于 B.melitensis 16M 的BMEII0742和BMEII0743之间的基因间区（Fig.2A ）.由于BSR-2的转录方向与两侧的ORF 均相反，证实BSR-2肯定是单独转录的，符合sRNA 的特征.BLAST 比对结果表明，BSR-2在布鲁氏菌种间的同源性达到100%（Fig.2B ），说明BSR-2具有高度保守性，这也符合sRNA 的特征.利用MFOLD 软件分析BSR-2折叠后的二级结构，见Fig.2C.2.4BSR-2在ΔvirB 和ΔvjbR 中的转录BSR-2在不同应激条件下的转录分析结果提示，BSR-2与布鲁氏菌适应巨噬细胞内环境有关，因此有可能影响布鲁氏菌的胞内生存能力.为了进一步分析BSR-2与布鲁氏菌胞内生存的关系，我们比较了BSR-2在野生株16M 和胞内生存缺陷株ΔvirB 和ΔvjbR 中的表达情况.由virB 操纵子编码的Ⅳ型分泌系统是布鲁氏菌的重要毒力因子，与布鲁氏菌的胞内生存密切相关，ΔvirB 突变株在巨噬细胞内的生存能力减弱，在小鼠体内很快被清除［11］.VjbR是布鲁氏菌密度感应系统的LuxR 转录激活子，与布鲁氏菌的胞内生存能力和毒力相关［12］.从Fig.3可以看出，BSR-2在ΔvirB 和ΔvjbR 突变株中的转录水平明显下降.荧光定量RT-PCR 结果再次提示，BSR-2可能与布鲁氏菌的胞内生存相关.2.5BSR-2靶基因的预测利用TargetRNA 对BSR-2的靶标基因进行了预测，翻译起始区的取值范围从起始密码子上游-30nt 到下游20nt ，核心匹配片段的长度为9nt ，预测结果见Fig. 4.BSR-2的靶基因有3个，BMEII0588（formatedehydrogenaseaccessoryprotein ）、BMEII1098（transcriptional regulator ，araC family ）、BMEII0502（carbonic anhydrase ）.其中AraC 是布鲁氏菌的重要毒力调控因子，与布鲁氏菌的胞内生存能力和毒力相关［13，14］.因此，我们推测BSR-2可能通过毒力调控子AraC 来调控布鲁氏菌的胞内生存能力.3讨论细菌sRNA 最初于上世纪60年代被发现，早期由于实验手段的限制，只有10几种编码sRNA 的基因在大肠杆菌中被发现，而且大多是由于其高丰度而偶然被发现.近几年，随着各种创新性的生物信息学手段和实验方法的发展，才真正开始对细菌sRNA 进行系统研究［15，16］.布鲁氏菌全基因组测序工作的完成，使得采用系统搜寻的方法在基因组中寻找sRNA 的编码基因629第10期王同坤等：羊布鲁氏菌非编码小RNA 分子BSR-2的预测与鉴定Fig.2Sequence and structure of BSR-2（A ）The location of BSR-2on the chromosome of B.melitensis ；（B ）Sequencealignment of BSR-2in Brucella ；（C ）Predicted secondary structure of BSR-2in B.melitensis at 37ħusing the MFOLDprogramFig.3Transcriptional analysis of BSR-2in ΔvirB andΔvjbRRelative transcription of BSR-2in 16M ，ΔvirB and ΔvjbR.B.melitensis were cultured in TSB tologarithmic phase and transferred into TSB4.0for 20min at 37ħ.RNA was isolated and relative transcription of BSR-2was quantified by RT-PCR成为可能.我们首先利用生物信息学对布鲁氏菌16M 的全基因组进行sRNA 预测，主要是通过在基因间区寻找具有转录子和终止子的完整转录单元来预测sRNA.BSR-2就是我们预测得到的sRNA 之一.计算机预测的方法虽然具有快速、低成本等优点，但预测的结果常存在假阳性，所以计算机预测所得到的sRNA 需要进行实验确认.由于细菌sRNA 的表达通常与应激压力相关.因此，本研究首先利用RT-PCR 对预测的BSR-2在不同应激条件下的转录情况进行了检测.结果表明，BSR-2在布鲁氏菌的总RNA 中存在转录本.接着，我们又通过5ᶄ和3ᶄRACE 来获取BSR-2的准确转录起点及终点，并对BSR-2的序列进行了分析.分析结果表明，BSR-2的转录方向与两侧的ORF 均相反，是单独转录的，为729中国生物化学与分子生物学报第26卷Fig.4Prediction of mRNA targets of BSR-2The mRNA targets of BSR-2 were predicted by TargetRNA（http：///targetRNA）反式非编码小RNA；此外，BSR-2在布鲁氏菌种间还具有高度的保守性，这些均符合sRNA的特征，也再次确定了BSR-2作为sRNA存在的真实性.布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，胞内生存是布鲁氏菌致病的关键环节，而适应胞内环境则是布鲁氏菌实现胞内生存的关键.目前认为，大部分的sRNA 在应对环境变化的基因表达调控中发挥重要作用，而且，有些还与细菌的毒力有关.因此，我们在试验中也初步探讨了BSR-2与布鲁氏菌胞内生存的关系.RT-PCR结果表明，BSR-2仅在模拟巨噬细胞内环境的应激条件下转录，而在实验室培养条件TSB7.0中不能转录，提示BSR-2可能与布鲁氏菌适应巨噬细胞内环境有关.此外，BSR-2在布鲁氏菌的胞内生存缺陷株ΔvirB和ΔvjbR中转录水平降低，表明BSR-2可能与布鲁氏菌的胞内生存相关.靶基因预测结果表明，BSR-2有3个靶基因，其中AraC 是布鲁氏菌的重要毒力调控因子，与布鲁氏菌的胞内生存能力和毒力相关.因此，我们认为sRNA可能与布鲁氏菌的胞内生存相关，在应对环境变化中发挥的重要作用.通过本研究，我们在布鲁氏菌中证实了sRNA 分子的存在，并对其功能进行了初步分析.下一步我们准备一方面对其它预测的sRNA分子进行鉴定，另一方面开展BSR-2对araC的调控作用研究，深入探讨BSR-2在布鲁氏菌胞内生存中的作用，为进一步阐明布鲁氏菌的胞内生存机制和致病机理提供新的思路和线索，并为防治布鲁氏菌感染提供新的疫苗作用靶标.参考文献（References）［1］Gottesman S.Micros for microbes：non-coding 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