登革2型病毒中国分离株感染性全长cDNA克隆的构建与鉴定
登革病毒实验室检测技术(精美自制)
快速检测试剂
•全血、血清、血浆 •含所有检测所需物品 •储存温度 (2 - 30°C) •>90% 敏感性和特异性 •15 分钟出结果 •可鉴别初次和二次感染 •25 tests
酶联免疫吸附试验
捕捉法（检测登革病毒抗体IgM）
酶标记登革病 毒单抗与登革 病毒复合物
抗人IgM 单克隆抗体
人IgM 抗体
登革1型病毒在C6/36细胞上病变情况 （100X）
登革2型病毒在C6/36细胞上病变情况 （100X）
登革3型病毒在C6/36细胞上病变情况 （100X）
登革4型病毒在C6/36细胞上病变情况 （100X）
血凝抑制试验
血凝试验
血凝抑制试验 有血凝素（HA）的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现象，血凝现象能 被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，原理是相应抗体与病毒结合后，阻止病 毒表面HA与红细胞结合，使原有的血凝反应被抑制。 过去最常规的方法，优点：敏感容易操作，需要的仪器少，结果可靠，HI抗 体可存在30～45年； 缺点：样本要预处理，必须双份血，难以区分登革病毒感染和其他黄病毒感 染（如乙脑病毒、西尼罗病毒等） 。
型别毒株感染无交叉免疫力，因此可以发生二次感染。感染一种病
毒型产生的免疫对同型病毒免疫力可持续1～4年，而对异型病毒的 免疫则短。
登革热流行与预防
有利于DF流行的因素 登革病毒（带毒蚊、人、兽）输入 输入地自然气候 输入地伊蚊密度、 屋内处积水容器、 居民养花、养莲、 建筑工地积 水、水缸积水
登革病毒实验室诊断
登革病毒的概述
黄病毒科 黄病毒属 单股正链RNA
登革病毒 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4个血清型 形态结构 球形，直径37nm～50nm 登革病毒成熟颗粒模拟图 含单股正链RNA，长度约11Kb 编码3种结构蛋白，7种非结构蛋白 5’-C-PrM(M)-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’ 3’端非编码区含高度保守的核苷酸序列 宿主范围 3种自然宿主：伊蚊、人、低等灵长动物
登革2型病毒浙江分离株的鉴定与分子流行病学研究.
登革 2 型病毒浙江分离株的鉴定与分子流行病学研究登革病毒(Dengue virusQV)是黄病毒属的一个血清学亚群,它包括4个不同的血清型, 引起的登革热(Dengue fever,DF) 是一种急性发热性传染病, 这种疾病有时发展成登革出血热及登革休克综合征(Dengue hemorrhagic fever, DHF 或Dengue shock syndrome, DSS), 常可导致患者死亡。
登革热的流行是热带和亚热带地区一个严重的公共卫生问题, 亚热带地区至少基金项目: 浙江省科技厅重点项目(2001136) 作者单位:浙江省疾病预防控制中心(杭州310009) 作者简介: 夏时畅(1962 ), 男,浙江富阳人,副主任医师,中心副主任, 主要从事传染病流行病学研究。
有8 个国家流行该病。
登革出血热是引起儿童住院和死亡的十大原因之一,自1978年以来,我国南方就发生了7次流行,它严重危害着人们的健康。
浙江省在1929年发生过一次登革热流行〔1〕,间隔76年后,于2004 年7-10月又由泰国输入病例引起浙江省本地113 例登革热病例的局部流行。
2004 年10 月浙江省杭州市又报告了 1 例输入性疑似登革热病例。
为了对该病例及时做出实验室确诊, 分析毒株的基因变异和种系进化特征, 从分子水平追踪传染源, 我们采集了患者血清标本, 进行了登革热血清学、病原学和分子生物学特征研究。
1 材料与方法1.1 患者及标本来源周某某,2004年10月8日从马尔代夫归国,发病前曾在该国居住了1个月左右,10 月12日高热不退,在浙江大学医学院附属第一医院就诊,无法诊断,然后转至杭州市第六人民医院(传染病医院)就诊,主要临床表现为发热、头痛、肌痛伴淋巴结肿大。
从马尔代夫大使馆得知, 当时马尔代夫流行登革热。
10月12日采集患者第1份血清,10月17日采集第2份血清,带冰运送到实验室。
1.2 血清抗体测定登革热IgM和IgG抗体测定采用ELISA和间接免疫荧光试验(IFA),ELISA和IFA试剂分别购自广州市中山生物工程有限公司和中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所, 实验均按试剂盒说明书进行。
军事医学科学院传染病预警系统研究进展——重大疫情风险防范系统集成的理论与实践
中国科学: 生命科学2011年 第41卷 第10期: 865 ~ 871 SCIENTIA SINICA Vitae 引用格式: 军事医学科学院. 军事医学科学院传染病预警系统研究进展——重大疫情风险防范系统集成的理论与实践. 中国科学: 生命科学, 2011, 41,865–981, doi: 10.1360/052011-599《中国科学》杂志社SCIENCE CHINA PRESS评 述军事医学科学院传染病预警系统研究进展 ——重大疫情风险防范系统集成的理论与实践军事医学科学院收稿日期: 2011-07-20; 接受日期: 2011-08-22 doi: 10.1360/052011-599摘要 本文简要介绍了军事医学科学院在传染病预警侦察、监测和反应系统建设和现场实践方面所取得的重要创新性研究成果, 提出了重点疾病流行病学的新认识、区域疾病网络计算的新工具、疾病暴发风险管理的新机制、巨灾现场防疫决策的新理念、传染病预警网络协同的新思考, 为强化、发展和推动中国重大疫情风险联合防范系统集成建设、管理与应用提供参考.关键词 传染病 疾病暴发流行病学侦测 预警系统 风险管理传染病是致病性微生物在人与人、动物与人以及动物与动物之间相互传播的疾病. 作为突发事件四大类之一的公共卫生事件, 尤其是重大传染病疫情, 既可自然传播也可人为导致, 其流行隐蔽性、暴发性、全球不确定性, 仍是人类生命和健康的巨大威胁, 也是全球公共卫生安全的重大挑战. 进入新世纪, 特别是经历SARS 突发疫情之后, 中国高度重视军队新发突发传染病预警系统建设, 着眼提高中国人民解放军应对多种安全威胁、完成多样化军事任务保障能力, 建立总部、战区和军以下单位疾病预防控制体系, 并赋予军事医学科学院履行全军疾病预防控制中心的职能任务.“十一五”期间, 军事医学科学院紧扣突发公共卫生事件应急机制和预警体系建设主题, 以军队疾控机构纳入国家公共卫生体系建设规划为主线, 突破疾控资源整合与信息系统建设一系列技术难题, 依靠全军爱国卫生工作规划建设, 依托军事综合信息网和疾控体系, 整合疫情预警侦察、监测、干预、指挥决策和风险评估分析等系统, 建立了独具军队特色的疫情预警监测反应网络, 实现了全军疫情网络直报、联合监测、综合预警、统一指挥, 进一步发展了重大疫情风险综合防范体系. 在应对全球新型流感大流行、抗震救灾、奥运安保、国际人道救援等防疫实践中, 实现由被动预防到疾病风险主动管理的策略转变.1 新发疾病预警侦测系统研究进展—— 重点传染病流行病学的新认识1.1 新发传染病的流行病学研究通过国际公共卫生组织的努力和生物科学技术发展进步, 对传染病的预防、控制、局部地区根除或全球消灭, 已获得了相当大的成功和进展. 但每一次成果和进步, 都伴随着新的病原体出现、新的菌种进化和新的传播环境变化, 对传染病控制带来新的挑战. 两个新的人类感染甲型H5N1禽流感和SARS 突发疫情的出现, 深化了全球公共卫生安全的认识, 加速了《国际卫生条例》的修订和未来大流行应对计划的制定. 为支撑和保障中国全球流感大流行防范计军事医学科学院: 军事医学科学院传染病预警系统研究进展—— 重大疫情风险防范系统集成的理论与实践866划, 军事医学科学院综合运用病毒学、免疫学、流行病学和生物信息学等方法手段, 重点围绕H5N1禽流感和甲型H1N1流感疫情, 开展了深入研究. 通过病毒全基因组序列测定和遗传进化分析, 对禽流感进行了传播风险评估和流行趋势预测, 发现人源H5N1禽流感病毒随时间、地点不同而发生变异, 弄清了与H5N1禽流感传播相关的社会、环境因素; 建立了动物模型和系统配套的快速诊断方法, 完成了达菲, CpGODN, Flutide 等多种候选药物的抗病毒药效学评价, 成功研制流感大流行疫苗获得临床研究批件, 提出了流感表位通用型疫苗的研究策略; 并对2009甲型H1N1流感疫苗接种队列进行随访, 发现了接种后感染病例, 研究显示了接受疫苗接种的病人感染后体液和细胞免疫反应迅速增加和快速清除病毒的能力, 为我国的甲型H1N1流感疫苗的免疫策略提供了重要参考. 军事医学科学院被确认为国家和北京市人禽流感确认实验室和卫生部“病原微生物卫生应急网络实验室”, 参与了国内首例甲型H1N1流感病例的确诊, 是国内最早分离获得甲型H1N1流感病毒的单位之一.为了深入探讨和追踪SARS 生态流行病学以及病原体和宿主关系, 军事医学科学院综合应用描述性研究、分析性研究、理论研究方法及地理信息系统技术, 通过现场调查与实验室分析, 确定了SARS 扩散的空间分布模式及其远距离扩散的主要影响因素, 首次发现了SARS-CoV 北京流行株在传播流行过程中遵循的变异规律, 阐明了病毒变异与疾病流行规律间的关系, 完善了对中国SARS 流行特征的认识, 掌握了自然感染状态下机体保护性抗体的变化趋势; 证实了中和抗体对机体的保护作用, 在国际上首次提出了SARS 病人体液免疫持续时间; 确定了多个宿主基因中多个SNP 位点与SARS 易感性的关联, 揭示了宿主易感基因在SARS 感染过程中的作用; 利用传播动力学方法, 建立流行病学数学模型, 评价了流行过程中干预措施的有效性. 不仅为流行防控和临床治疗提供了科学依据, 也为SARS 疫苗开发、新药研制提供了可以借鉴的新思路. 在中国中欧中心和国家自然科学基金委的资助下, 承办了“SARS 在中国传播流行病学研究国际研讨会” .1.2 传染病分子流行病学研究传染病的发生、传播和流行是一个包括基因突变、漂移、接触、感染和免疫等基本生物学过程, 既具有生物统计学概率分布格局, 也遵循病原体和宿主生态学与进化动力学规律, 而疾控网络实验室及其能力建设是其研究基础平台. 十一五期间, 军事医学科学院联合全军各战区CDC 和有关军队医院, 重点开展了《军队系统细菌性传染病病原谱流行规律及变异研究》, 建立军队统一的传染病症候群监测方案6部、病原检测操作规程56个, 规范了实验室标准化管理、质量控制和生物安全水平; 建立完善了突发新发传染病病例的样本库和菌毒株库, 集成了覆盖全军7个军区和22个哨点医院的军队细菌性传染病病原监测技术平台, 完善了军队系统传染病病原监测体系, 提高了军区疾控机构对肠道腹泻病原菌的快速检测、鉴别、分离培养能力, 总体上提升了军队实验室检测能力.另外, 军事医学科学院还利用国家重点实验室平台, 综合利用基因组学、比较基因组学、转录组学等多种技术, 对鼠疫等重要的自然疫源性疾病的病原体传播、演化、遗传变异和致病机制调控进行了系统深入的研究. 测定了中国五株鼠疫菌的全基因组序列, 建立了国际上首个病原菌溯源的综合性数据库, 提出了鼠疫菌进化的机制, 阐明了鼠疫菌在中国的传播和演化过程, 圈定了可能与致病相关的基因组岛, 首次发现了鼠疫菌中不存在恒定的分子钟、以及基因组突变的累积与流行历史相关. 首先构建了中国登革病毒感染性cDNA 克隆株, 确定了中国登革病毒流行株的基因结构特征及其基因型. 发现并确认了莱姆病、土拉弗氏菌病和斑点热3种蜱媒传染病的新自然疫源地和病原体新基因型, 鉴别出1个中国特有的土拉弗氏菌基因型.1.3 自然疫源性疾病传播与流行规律研究 应用现代信息技术研究传染病的时空传播与流行规律是传染病预警研究的新趋势, 不仅能动态分析传染病的时间与空间分布特征, 而且从全新的角度来观察和认识传染病及其发生和流行的环境, 深化传染病监测、预警和突发疫情控制决策. 十一五期间, 军事医学科学院联合中国科学院、中国疾病预防控制中心和复旦大学, 组织实施了预防医学领域第一个国家自然科学基金重大项目“基于现代信息技术研究传染病时空传播与流行规律”. 通过预防医学与地理信息科学技术相结合的跨学科交叉, 合理、有效地中国科学: 生命科学 2011年 第41卷 第10期867将现代信息技术应用监测血吸虫病和肾综合征出血热疫情, 在传染病流行病学数据整合及其共享分析技术平台建设、血吸虫病时空传播的多尺度定量化模型、预测模型的构建与验证、肾综合征出血热时空分布与传播规律、生态流行病学、传播风险预测等方面取得了重要的创新性研究成果, 尤其在多尺度过程模型研建、基于过程的GIS 分析技术、多学科环境信息数据库建设以及传染病空间流行病学相关理论方面取得了长足的进步, 突破了传染病多元数据集成分析技术难题, 构建了基于地理信息系统、遥感、全球定位系统等现代空间信息技术、国家战略层面的传染病流行病学侦察体系, 为国防建设和重大工程实施过程中传染病流行风险评估提供了支撑技术平台. 为其他媒介传播疾病、地方病以及环境相关疾病的研究和网络监测提供了新的技术方法. 组织承办相关国际学术会议７次, 扩大了中国在该领域的国际影响, 引起国内外同行的关注.2 军队疫情监控网络信息系统建设研 究进展—— 区域疾病网络计算的新工具2.1 军队疫情监控网络信息系统建设与应用虽然分子生物学和遗传学对传染病起源和病理诠释极为重要, 但基于生态流行病学和遗传地理时空模型的传染病监测分析, 才是传染病控制成败的关键. 长期的工作实践和战胜SARS 的经验也表明, 传染病疫情动态监控是预防控制传染病的一条有效的途径, 对于掌握传染病防治工作的主动权, 做好防治规划, 优化应急预案方案, 提高防疫资源的有效性, 具有重要的战略意义. 强化新发突发疫情的公共卫生监测能力, 完善全球疫情预警监测情报网络, 及早发现和防范突发公共卫生事件, 实现疾病风险早期主动管理, 仍是国际公共卫生发展的主线和国家公共卫生建设的核心内容.为适应国家公共卫生体系建设发展、国家公共安全战略和《国际卫生条例》的要求, 军事医学科学院承担军队疾病预防控制网络信息系统建设任务. 十一五期间, 军事医学科学院在总部机关统一组织部署下, 通过纳入国家公共卫生体系建设规划, 依托军综网和军队疾控体系, 综合运用体系结构技术、系统集成验证和系统工程管理技术, 集成了“三军联动、平战兼容、军民融合”的疫情监控信息网络, 创建了全军疫情数据中心及疾控信息平台, 建立了全军疫情直报工作模式, 研发了新一代军队疾控信息系统, 实现了全军突发公共卫生事件和传染病疫情“个案直报、联网计算、实时分析、在线访问、远程咨询指导和区域信息共享”, 建立完善了全军疫情日、周、月和年全时分析制度, 缩短了突发公共卫生事件和传染病疫情响应周期, 提高了传染病疫情的监测敏感性、定位精确性、通报时效性、评估动态性、暴发警觉性. 军事医学科学院基于该平台, 通过军地疫情合作机制和国家疾控信息系统, 实现了军地疫情信息资源交流和共享, 提升了军地重大疫情监控指挥的信息协同能力, 使中国人民解放军疾控信息内容从单一的疫情报告向暴发早期报警和疾病风险综合防范多元信息联动处理转变, 已成为军队实施突发公共卫生事件应急预案和传染病防治管理的重要信息工具.2.2 重点疾病模拟分析智能库及重大疫情现场流行病学调查分析系统研究军事医学科学院综合利用传染病传播动力学数学模型、数据挖掘技术和计算机模拟仿真技术, 探讨建立了甲型H1N1流感、SARS 、痢疾、麻疹、疟疾、流行性出血热等重点传染病传播动力学理论流行病学指标体系, 构建了集重点疾病传播动力学数学模型、暴发风险量化分析矩阵和现场应急处置技术方案为一体的疾控决策专家智能库. 研制了重大疫情现场流行病学调查分析系统, 实现了现场疫情调查信息系统采集、分析以及辅助判别疫情性质、识别疾病危险因素、推判可能的疾病病因, 完善了重大疫情现场流行病学调查的信息工具, 使疫情调查处置更加先进、科学规范和高效快捷. 并基于军队疾控信息平台, 实现了部队远程交互操作、验证重点疾病暴发动力学过程、演示重点疾病暴发因素的非线性、自动拟订重点疾病综合性防控技术方案, 不仅可以预测部队单位发病的变化趋势, 还能自动生成风险评估报告和干预策略建议, 为基层部队掌握传染病风险评估、优化控制措施提供了决策支持. 并可以作为传染病控制模拟训练工具, 加深对传染病传播流行规律的理解, 缩小现场调查处置行动的决策时滞, 促进传染病防治计划方案预案的优化, 提高现场防疫指挥的灵活性, 推进理论流行病学的应用.军事医学科学院: 军事医学科学院传染病预警系统研究进展—— 重大疫情风险防范系统集成的理论与实践8682.3 新发传染病及群体性不明原因疾病监测系统建设与应用针对SARS 、高致病性禽流感和人类新型流感疫情, 军事医学科学院研制并通过总部下发《军队不明原因肺炎病例监测实施方案》、《军队医院死亡病例监测实施方案》以及新发突发传染病监测防控技术规范和预警分析指标体系, 建立了部队不明原因肺炎和死亡病例监测报告制度. 并依托全军疾控信息平台, 研究建立了军队传染病实时监测与暴发早期预警通报系统, 实现对部队新发暴发疾病和群体性不明原因疾病的实时监测、预警通报与风险早期管理. 在应对全球甲型流感大流行中, 实现了军地疫情监控防控同步, 并与国际接轨.3 疾病暴发预警反应系统管理研究进 展—— 突发公共卫生事件风险管理的新机制 3.1 军队重大疫情风险管理体系建设及理论研究 传染病防控是一项社会系统工程. 进入新世纪后, WHO 修订了《国际卫生条例》, 国家修订了《传染病防治法》, 颁发《突发事件应对法》和《突发公共卫生事件应急条例》, 中国人民解放军也发布了《军队应急处置突发公共卫生事件规定》, 赋予军事医学科学院负责突发公共卫生事件预警监测、分析、评估、调查处置技术咨询指导以及疫情风险咨询沟通和风险预警监控任务. 十一五期间, 军事医学科学院在国家社会科学研究基金-军事学项目课题“高技术战争卫勤理论研究”资助下, 联合中国人民解放军卫勤专家和军事理论专家, 紧扣军队突发公共卫生事件应对工作的“一案三制”建设, 重点对现代卫勤思想与观念、一体化卫勤、信息化卫勤、模块化卫勤、时效救治和卫生防疫应急管理理论及方法进行了深入的研究, 研制并协助总部下发了《军队处置突发公共卫生事件应急预案》、《军队处置生物突发事件应急预案》、《军队处置突发动物疫情应急预案》、《军队处置生物突发事件卫勤保障应急预案》, 建立了军队卫勤保障专业人才库, 抽组成立公共卫生专家咨询组, 完善了依托爱卫会“大卫生”的突发公共卫生事件应急机制及其组织领导体系、预防控制体系、应急法规体系, 编写了《现代卫勤前沿理论》和《非战争军事行动卫勤应急管理》, 推进了传染病风险管理机制、突发事件卫勤应急指挥决策管理及现代卫勤理论创新, 以全面、主动、高效地实施“以人为本、预防为主、协同管理、联勤保障”的部队疾病风险管理战略和防疫行动策略.3.2 数字化疾控卫勤保障系统探索性研究卫生防疫防护是通过计算敌对方危害、自然危害和人群危害, 而采取有效行动以降低危害的过程. 随着社会发展和环境变化, 世界各国突发事件发生频率和规模都在不断扩大, 对非战争军事行动卫生防疫科技与管理信息协同提出了更高的要求, 特别是风险事件信息获取、分析、利用的实时性、动态性和前瞻性等独特需求. 为此, 军事医学科学院在军队疫情直报系统运行管理工作实践上, 归纳梳理了重大传染病疫情等突发公共卫生事件风险评估的主要对象、侦察环境和量测指标, 界定了疫情潜在威胁等级、风险事件后果等级、风险事件预警等级、风险事件卫勤响应等级, 构建了突发公共卫生事件风险水平度量等级矩阵, 量化整合了部队突发公共卫生风险事件的发生可能性、危害严重程度、群体脆弱程度和控制系统复杂程度信息, 研究提出了依托军队爱卫会两大授权(风险咨询沟通和风险预警监控)、基于风险环境侦察、风险评估、风险处置、风险监控和风险沟通五大步骤的突发公共卫生事件风险管理业务流程, 编写了《非战争军事行动卫生流行病风险管理评估与侦察》教程, 统一了军队突发公共卫生事件监测预警统计指标体系和工作规程.3.3 突发事件群体心理应激监测预警和干预研究为指导部队早期监测、预警和有效干预作战和处置各种突发事件中的军事群体心理应激, 军事医学科学院在全军医学科学技术研究“十一五”计划课题基金资助下, 系统地开展了《群体心理应激监测、预警、干预研究》. 通过多维度量化评估群体心理应激中介因素, 实现对群体心理应激监测、预警的方法, 编制了军事群体心理应激预警检测工具、建立了全军常模和预警标准, 阐明了军事群体心理应激机制, 建立了军事群体心理应激模型; 制订了《军队心理应激干预技术方案》, 建立了群体心理应激现场干预技术规范以及评估标准、分类干预方案, 创建了群体心理应激预防性、应急、系统心理干预模式, 制订了《军队心理应急干预卫勤预案》, 为构建中国人民解放军平、战时均适宜的心理卫生保障中国科学: 生命科学 2011年 第41卷 第10期869体系及其运行机, 提供了技术支持.4 非战争军事行动现场防疫保障实践—— 巨灾现场防疫指挥的新理念4.1 汶川大地震抗震救灾现场防疫保障“大灾之后必有大疫”是人类社会对灾害现象认识和历史经验的总结, 确保“大灾之后无大疫”既是全球社会应对重大灾害的公共卫生策略目标, 也是国际人道主义救援的核心内容. “5·12”汶川大地震发生后, 军事医学科学院在军委总部统一部署下, 立即举全院之力, 迅速投入到中国历史上救灾速度最快、动员范围最广、参战力量最大的抗震救灾斗争, 一边向总部和国家建言献策, 一边抢先行动奔赴灾区前沿一线. 先后选派7批、186人的现场防疫队赶赴灾情最重的汶川, 牵头负责汶川全县卫生防疫和四川灾区动物疫情防控任务. 在总部和各级指挥部统一指挥下, 军地单位密切协同、攻坚克难, 全方位开展灾区卫生防疫工作, 实现了“大灾之后无大疫”的目标. 在同特大地震灾害的艰苦搏斗中, 军事医学科学院抗震救灾防疫队, 针对任务突发性、措施专业性、力量多元性和灾情复杂性等灾害特性, 创造性地提出了“科学防疫、重点防控、统筹医防协同”的工作思路, 创立了“军地结合、专群结合、点面结合、防治结合”的工作原则, 精心组织整合军地42支现场防疫力量, 统筹开展流行病学调查、遇难者遗体处理、媒介生物防制、卫生监督监测、免疫预防、健康教育和人畜共患病防控; 重点针对紧急避难、临时安置和恢复重建的不同阶段防疫卫生需求难点问题, 先后提交60多项卫生防疫工作建议、技术方案和业务规范; 着眼建立长效机制, 与阿坝州、汶川县签订支援帮扶协议, 协助制定灾后疾病预防控制体系, 广泛开展专业技术培训, 为灾区留下了一支不走的防疫队, 创建了“大灾无大疫”的示范和样板, 充分展示了防疫主力军和突击队作用, 充分发挥人才、技术和装备优势, 充分发挥决策咨询和培训指导作用. 受到了灾区各级政府、人民群众和救灾部队的充分肯定, 被誉为防疫铁军. 被党中央、国务院、中央军委授予抗震救灾英雄集体.在抗震救灾防疫行动中, 军事医学科学院还将现场防疫指挥所快速部署到了灾区前沿, 将机关参谋队伍部署到重灾区前沿一线, 依靠灾区抗震救灾指挥部和院前线指挥部, 快速建立了现场防疫指挥系统; 将现场防疫分队署到乡村一线, 迅速恢复灾区“县-乡-村-组”四级防疫组织体系, 完善灾后食品水源等公共卫生安全监管网络, 依托当地爱国卫生体系, 强化现场卫生监督, 及早发现、查找和防堵灾后公共卫生安全隐患. 探索建立了“院后方指挥中心-院前线指挥所-覆盖乡村的防疫分队”协同分布式的现场防疫指挥系统.在灾区现场防疫决策与保障具体实践, 军事医学科学院针对当地是中国建立最早、面积最大、以保护大熊猫等珍稀野生动植物和高山森林生态系统为主的综合性国家级自然保护区, 汲取应对SARS 经验教训, 结合当地实际, 适时提出“灾区不是疫区、防疫与生态环保兼顾”的“生态防疫”科学理念, 加强灾区卫生防疫工作的理论指导、现场指导和实践指导. 现场工作期间, 始终秉承保护生态、保护环境的理念, 提倡“土洋结合”、合理适量用药, 以减少对自然环境的破坏; 协同把握防疫工作节奏, 改进防疫工作方式方法, 积极贯彻落实党中央、国务院关于卫生防疫“进村入户”的指示要求, 探索构建了“进村入户、心身兼顾、医防同步、生态防疫”的巨灾现场防疫新模式, 为今后应对巨灾危机时保持科学理性的典范.为了总结检验和集成军队卫生系统此次抗震救灾卫勤保障成果, 结合“卫勤使命-2009”演习评估工作需要, 军事医学科学院系统地开展了突发事件现场防疫能力评估研究. 借鉴运用系统论、卫生系统宏观模型和疾控绩效评估考评方法, 理论与实践专家咨询论证相结合, 定性与定量分析相结合, 系统地梳理归纳了军地疾控、医疗和部队卫生三类卫勤机构的机动卫勤分队突发事件现场防疫能力评估工作流程, 研制了一套现场防疫模拟演练评估办法和标准, 对参加“卫勤使命－2009”演习的16支军地机动卫勤现场防疫能力进行了整体综合评估, 建立了机动卫勤分队现场防疫能力评估指标体系、现场项目规范处置指数及其观测评分模型, 规范了公共卫生系统现场防疫效能评估工作.4.2 巴基斯坦特大洪涝灾害的国际医学救援保障 2010年7月巴基斯坦发生80年来最为严重的洪涝、泥石流灾害. 覆盖全国五分之一的国土、造成 1600多人死亡、2000多万人受灾、120多万栋房屋。
登革2型病毒（ngc株）e基因的rt-pcr扩增、克隆、部分测序及真核表达
ａａＡＤＥＡｍｐｄｄＩ－Ｉ，ＯＤＥＰＣＤＦＤＨＦ／ＤＳＳｄＮＴＰＤＴＴＤＶ（１－４）ＥＥＢＦＩＴＣＭｃＡｂ２．ＭＥＮＧＣ０ＤＰＡＧＥＰＢＳＰｃｍｖＲＴ．ＰＣＲＳＤＳＴＥＴＥＭ［ＥＤ英文缩写词表ａｒｎｍｏａｃｉｄ缸正ｂ（）ｄｙ＿ｄ印ａ础啦ｄ血ｍ跏耐ＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎＤｏｕｂｌｅｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒＤｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅＤｅｎｇｕｅｆｅｖｅｒＤｅｎｇｕｅｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｆｅｖｅｒ／ＤｅｎｇｕｅｓｈｏｃｋｓｙｎｄｒｏｍｅＤｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ硒ｐ｝１０：枇ｌ－４－Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔ０１ＤｅｎｇｕｅｖｉｒｅｓＥｎｖｅｌｏｐｅＥｔｈｉｄｉｕｍＢｒｏｍｉｄｅＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉＳＯｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅＭｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ２－ＭｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌＮｅｗＧｕｉｎｅａＣＯｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙＰｏ㈣ｄｅ酎ｅｌ‘矧【。
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【CN110426517A】一种检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白、试剂盒及其应用【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910320435.7(22)申请日 2019.04.19(71)申请人 中国人民解放军南部战区疾病预防控制中心地址 510507 广东省广州市天河区东莞庄路91号(72)发明人 任瑞文 李硕 李春缘 陈月 李以圣 陈迪佳 刘军 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限公司 44102代理人 江裕强(51)Int.Cl.G01N 33/569(2006.01)(54)发明名称一种检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白、试剂盒及其应用(57)摘要本发明公开了一种检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白、试剂盒及其应用。
重组抗原蛋白的制备包括：筛选检测靶标编码基因，然后将编码基因连接到原核表达载体中，构建得到重组表达载体；转化入宿主细胞中，诱导表达，得到重组抗原蛋白DENV -Ag2。
所述重组抗原蛋白为登革2型病毒特异性抗原，经原核表达、纯化而成。
本发明的重组抗原蛋白具有特异性强、亲和力高的优点，与登革2型病毒抗体具有很高亲和力，而与其它型别登革病毒及相近虫媒病毒无血清学交叉反应。
本发明提供的试剂盒具有操作简单方便、灵敏度高、特异性强等优点，能够快速、准确地鉴别诊断登革2型病毒抗体，从而诊断登革病毒的感染情况，为之后的治疗提供有利依托。
权利要求书1页 说明书9页序列表1页 附图2页CN 110426517 A 2019.11.08C N 110426517A权 利 要 求 书1/1页CN 110426517 A1.一种检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白DENV-Ag2，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种权利要求1所述检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白DENV-Ag2的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，插入了权利要求2中所述SEQ ID NO.1所述核苷酸序列。
登革2型病毒E基因的表达及应用于血清学检测
登革2型病毒E基因的表达及应用于血清学检测张志珊;严延生;翁育伟【摘要】To obtain dengue virus type 2 envelope glycoprotein used for serologic diagnosis of dengue virus infection, the truncated K protein deleting the carboxy-terminal - 100 aa of dengue virus type 2 was amplified by reverse transcription PCR. The products of PCR were ligated with plasmid pET-30a and transformed into Escherichia coli competent cells BL21 (DE3) to express recombinant protein. The expressed product was purified by electroelution. The purified recombinant protein was applied to test sera from patients infected with dengue virus type 2 by indirect ELISA. The results were compared with those tested by IFA or Panbio Dengue IgG capture ELISA. Results showed that the recombinant plasmid was successfully constructed and expressed in E. Colt. After the recombinant protein was used to detect sera from patients infected with dengue virus type 2, a sensitivity of 95. 6% and a specificity of 96. 8% were obtained by comparing with IFA. Furthermore, the results were in excellent agreement with those obtained by using a commercially available diagnostic kit, Dengue Duo rapid strip test from Panbio (P>0. 05). In conclusion, the truncated E protein of dengue virus type 2 was successfully expressed in E. Coli and the recombinant protein could be applied as antigens for dengue serum detection.%目的利用大肠杆菌表达登革病毒2型外膜蛋白,获得重组抗原应用于血清学检测.方法用RT-PCR法扩增登革2型病毒去除C端100个氨基酸的外膜蛋白基因片段,与表达载体pET-30a连接,构建重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,重组蛋白用电洗脱法进行纯化.纯化的重组蛋白用间接ELISA法检测登革2型感染者血清,检测结果与间接免疫荧光法、澳大利亚Panbio试剂进行比较.结果重组质粒构建成功,经IPTG诱导后在大肠杆菌中表达重组蛋白.纯化的重组蛋白用于检测登革2型感染者血清,以IFTA作为参照标准,其敏感性为95.6%,特异性为96.8%.与澳大利亚Panbio IgG捕获法ELISA试剂盒检测结果相比,两种方法对登革2型IgG的检出率无统计学意义(P>0.05).结论成功通过大肠杆菌表达登革2型去除C端疏水区的外膜蛋白,重组抗原可应用于血清学检测.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2012(028)005【总页数】4页(P421-424)【关键词】登革病毒;E蛋白;大肠杆菌;基因表达【作者】张志珊;严延生;翁育伟【作者单位】福建医科大学附属泉州第一医院检验科,泉州,362000;福建省疾病预防控制中心,福州,350001;福建省疾病预防控制中心,福州,350001【正文语种】中文【中图分类】R373.3登革热是由登革病毒引起的急性虫媒传染病，广泛流行热带、亚热带地区，100多个国家有地方性登革热传播，每年均出现几百万病例，其中以东南亚国家最为严重。
登革2型病毒NGC株基因组亚克隆的构建及其鉴定
登革2型病毒NGC株基因组亚克隆的构建及其鉴定贡树基;曹虹;赵卫;张文炳;周浩;陈丽丹【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2006(026)004【摘要】目的构建登革2型病毒NGC株基因组全序列的亚cDNA克隆,为进一步构建全长感染性cDNA克隆奠定基础.方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列中的酶切位点设计2对引物,从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA,采用长链RT-PCR 技术扩增出覆盖病毒基因组全长的2个cDNA片段,并克隆至pCR-XL-TOPO载体后测序.结果经酶切鉴定和序列测定表明,获得的cDNA克隆为登革2型病毒NGC 株特异的.结论已成功构建出登革2型病毒NGC株基因组的2个cDNA亚克隆.【总页数】3页(P469-471)【作者】贡树基;曹虹;赵卫;张文炳;周浩;陈丽丹【作者单位】南方医科大学公共卫生与热带医学学院,微生物学系,广东,广州,510515;南方医科大学公共卫生与热带医学学院,微生物学系,广东,广州,510515;南方医科大学公共卫生与热带医学学院,病毒研究所,广东,广州,510515;南方医科大学公共卫生与热带医学学院,微生物学系,广东,广州,510515;南方医科大学公共卫生与热带医学学院,微生物学系,广东,广州,510515;南方医科大学公共卫生与热带医学学院,微生物学系,广东,广州,510515【正文语种】中文【中图分类】R373.33【相关文献】1.登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核蛋白多克隆抗体的制备 [J], 张莉莎;吕秉乐;左丽2.登革2型病毒及其NGC株、M株E基因的原核蛋白对HUVEC通透性的影响[J], 任玮;左丽;吕秉乐3.登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列pcDNA3.1载体的构建 [J], 任丽娟;左丽;朱海东4.登革2型病毒NGC株感染白纹伊蚊C6/36细胞中浓核病毒DNA的扩增和序列测定 [J], 王娇;左丽;周永兵5.登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核载体的构建及蛋白表达 [J], 张莉莎;吕秉乐;左丽因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
登革2型病毒包膜蛋白在毕赤酵母中的表达和病毒样颗粒的组装
登革2型病毒包膜蛋白在毕赤酵母中的表达和病毒样颗粒的组装刘文权;江丽芳;刘岩;江汉宁;汤云霞;方丹云【摘要】The aim of this study was to express the dengue type 2 envelope and pre-membrane proteins in the constitutive Pichia pastoris system, and study the assembly characteristic of virus-like particles in cells. The virus mRNA was taken as the template to amplify the prM/E genes. Then the genes were cloned into the multiple clone sites of the expression vector pGAPZa A,and transformed into Pichia pastoris GS115. By the selection of Zeocin and the identification of PCR, the positive clones was expressed and analyzed. Results demonstrated that dengue virus type 2 prM/E genes were successfully cloned into expression vector; SDS-PAGE and Western blot showed that the envelope protein was high-level expressed in constitutive Pichia pastoris system; the virus-like particles with diameters of 30-50 nm, and the double membrane structures which was similar with the cells infected dengue virus were detected by transmission electron microscopy; results of immune-electron microscopy indicated that the recombinant virus-like particles could be recognized by the anti-dengue type 2 mouse serum, revealed that the particles had immunoreactivity. These results indicate that the constitutive Pichia pastoris system which express dengue type 2 virus-like particles has been established successfully,which will provide the basis for further studies of dengue virus-like particles vaccine.%目的在组成型的毕赤酵母系统中表达登革2型病毒包膜蛋白E和前膜蛋白prM,并研究病毒样颗粒在酵母细胞中的组装特性.方法以登革2型病毒ZS0I/01株mRNA为模板,扩增编码prM/E蛋白的基因.将目的基因克隆至表达载体pGAPZaA的多克隆位点,并转化毕赤酵母GS115.经Zeocin抗生素筛选和PCR鉴定后获得酵母菌重组克隆,并进行表达和鉴定.结果成功克隆登革2型病毒prM/E基因,SDS-PAGE和Western blot检测表明包膜蛋白E在组成型的毕赤酵母系统中得到高水平表达;利用透射电镜在重组酵母胞浆内检测到30-50 nm的登革2型的病毒样颗粒,并发现类似登革病毒感染的双层膜结构;免疫电镜结果证实重组病毒样颗粒可以与抗登革2型病毒血清反应,具有免疫反应性.结论成功的建立了组成型表达登革2型病毒样颗粒的毕赤酵母系统,为登革病毒样颗粒疫苗的制备奠定了基础.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2011(027)005【总页数】5页(P376-380)【关键词】登革病毒;包膜蛋白;毕赤酵母;病毒样颗粒【作者】刘文权;江丽芳;刘岩;江汉宁;汤云霞;方丹云【作者单位】温州医学院基础医学院,温州,325035;中山大学中山医学院微生物学教研室,广州,510089;中山大学中山医学院微生物学教研室,广州,510089;中山大学中山医学院微生物学教研室,广州,510089;中山大学中山医学院微生物学教研室,广州,510089;中山大学中山医学院微生物学教研室,广州,510089【正文语种】中文【中图分类】R373.3登革病毒(Deng ue virus ,DENV)包含4个血清型(DENV-1,DENV-2,DENV-3和D ENV-4),属于黄病毒科、黄病毒属[1]。
登革2型病毒及其NGC株、M株E基因的原核蛋白对HUVEC通透性的影响
登革2型病毒及其NGC株、M株E基因的原核蛋白对HUVEC通透性的影响任玮;左丽;吕秉乐【摘要】目的:研究登革2型病毒(DENV-2)、登革2型病毒国际参考株(NGC)E基因1-476序列原核蛋白、登革2型病毒贵州蚊虫分离株(M)E基因1476序列原核蛋白对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)通透性的影响.方法:将DENV-2 M株和NGC株E基因1-476序列原核表达产物及DENV-2接种于HUVEC单层细胞,用tran-swell法检测HUVEC的通透性,透射电镜观察细胞超微结构的改变.结果:DENV-2、NGC株E基因的原核蛋白、M株E基因的原核蛋白分别在30 min、3h、12 h时对HUVEC通透性的影响最为明显,透射电镜结果显示有细胞超微结构的改变.结论:DENV-2、DENV-2 NGC株E基因原核蛋白、M株E基因原核蛋白对HUVEC 通透性、细胞超微结构有明显影响.【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2014(039)003【总页数】5页(P302-306)【关键词】登革热病毒;E基因;内皮,血管;脐静脉;细胞膜通透性【作者】任玮;左丽;吕秉乐【作者单位】贵阳医学院免疫学教研室,贵州贵阳550004;贵阳医学院免疫学教研室,贵州贵阳550004;贵阳医学院免疫学教研室,贵州贵阳550004【正文语种】中文【中图分类】R385;R392.1登革病毒(DENV)是以蚊虫为媒介的RNA病毒，E蛋白是病毒体最大的结构蛋白和主要的包膜蛋白，决定着病毒的组织嗜性，影响病毒毒力，E蛋白介导病毒颗粒对宿主细胞进行黏附与穿入[1]。
登革出血热或登革出血综合征(DHF/DSS)是登革病毒感染引起的严重的临床类型，其主要特点是毛细血管通透性增加引起的血浆渗出和出血 [2]。
大量体外实验表明，内皮细胞是DENV的靶细胞[3-4]。
DENV作用后，血管内皮细胞黏附分子改变，引起血管局部内环境紊乱，造成血管局部炎症介质的大量聚集，使血管通透性增加，促进DHF/DSS病情的发生发展。
带组氨酸标签的登革病毒2型和4型病毒样颗粒的表达鉴定和纯化的开题报告
带组氨酸标签的登革病毒2型和4型病毒样颗粒的
表达鉴定和纯化的开题报告
引言：
登革热是由登革病毒（DENV）引起的一种由蚊子叮咬传播的急性病毒性疾病，全球范围内广泛存在。
DENV由四个血清型（DENV1-DENV4）组成，其基因组为正链单股RNA。
DENV感染严重威胁全球卫生，缺乏特效治疗手段，目前疫苗虽然已经有研发，但是对于该病毒的深入认识及
其病理机制的探究还需要更多的基础和应用研究。
方法：
通过构建带有组氨酸标签的DENV2和DENV4基因组，利用转染的
方式在细胞中表达病毒样颗粒。
等待疫苗样颗粒的发生后，使用Ni-NTA
融合蛋白层析柱纯化嗜铜组氨酸标签化的DENV病毒样品。
最终通过
SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot检测等方法来评估所纯化样品的纯度和可靠性。
预期结果：
带有组氨酸标签的DENV2和DENV4病毒样颗粒的成功表达和纯化，为分子机制和病理学机制的深入研究奠定了基础。
此外，成功纯化的嗜
铜组氨酸标签化的DENV病毒样品还可以用于药物筛选和疫苗开发的相
关研究。
结论：
通过本研究，在体外制备和纯化DENV2和DENV4的病毒样颗粒标
本的基础上，为后续的深入机制研究，以及新型药物和疫苗的开发提供
了重要的实验基础。
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[收稿日期] 2005-12-27[基金项目] 全军“十五”指令课题(01L054)[作者简介] 朱武洋(1971-),男,河北省石家庄市人,在读博士生。
3通讯联系人,Tel:010*********;E 2mail:qinede@s ohu .com登革2型病毒中国分离株感染性全长cDNA 克隆的构建与鉴定朱武洋,陈水平,秦成峰,于 曼,姜 涛,邓永强,秦鄂德3(军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室,北京 100071)[摘要]目的:构建登革2型病毒中国分离株(DE N2243)的感染性全长c DNA 克隆。
方法:根据我室测定的DE N2243株病毒全基因组序列,利用长链RT 2PCR 及融合PCR 技术扩增此病毒基因组全长c DNA 分子,并将其克隆至低拷贝载体p W SK29中构建该病毒株的全长c DNA 克隆。
将此克隆体外转录后,通过电穿孔导入宿主细胞获得恢复病毒。
结果与结论:构建的DE N2243基因组全长c DNA 克隆具有感染性,所获得的恢复病毒具有与原型病毒类似的生物学性质及小鼠乳鼠神经毒力,且可稳定传代。
该感染性克隆的构建为深入探讨登革病毒的致病机制及研制新型登革疫苗奠定了基础。
[关键词] 登革病毒;感染性全长c DNA 克隆;恢复病毒[中图分类号] R373133[文献标识码] A[文章编号] 100025501(2006)022*******Con structi on and i den ti f i ca ti on of i n fecti ous full 2length c D NA clone of dengue type 2v i rus isol a ted i n Ch i n aZHU W u 2Yang,CHEN Shui 2P ing,Q I N Cheng 2Feng,YU M an,J I AN G 2Tao,D EN G Yong 2Q iang,Q I N E 2D e3(State Key Laborat ory of Pathogen and B i osecurity,I nstitute ofM icr obi ol ogy and Ep ide m i ol ogy,Acade my ofM ilitaryM edi 2cal Sciences,Beijing 100071,China )[Abstract] O bjecti ve:To construct infecti ous full 2length c DNA cl one of dengue virus type 2is olated in China (DE N2243).M ethods:According t o the published nucleotide sequence of DE N2243,the app r oxi m ate 11kb full 2length c DNA s of dengue virus type 2were a mp lified by l ong RT 2PCR and overl op 2PCR.Full 2length cDNA cl one was constructed by cl oning the full 2length c DNA int o a l ow copy nu mber vect or p W SK 29,fr om which recovered virus D2012was acquired by tran 2scri p ti on in vitro and electr oporati on .Results and Conclusi on:The full 2length c DNA cl one of DE N2243constructed was infecti ous,and recovered virus D212was indistinguishable fr om DE N2243in bi ol ogical p r operties including suckling m ice neur ovirulence .The full 2length c DNA cl one lays the basis for elucidating the mechanis m of pathogenesis of dengue virus and devel op ing novel vaccine against dengue fever .[Key words] dengue virus;infecti ous full 2length c DNA cl one;recovered virus 登革病毒为黄病毒科(Flaviviridae )的重要成员,是一类经蚊媒传播的、有包膜的RNA 病毒,基因组全长约11kb,两端为非编码区,在其5′端含有一Ⅰ型帽子结构,3′端无多聚A (Poly A )尾,其编码区为单一的开放读码框(ORF ),编码3种结构蛋白(C,Pr M ,E )和7种非结构蛋白(NS1,NS2a,NS2b,NS3,NS4a,NS4b,NS5)。
登革病毒分为4个血清型(DE N1,2,3和4),是登革热(DF )、登革出血热(DHF )和登革休克综合征(DSS )的病原体。
登革热流行已有200多年的历史,近20年来随着气候变暖在世界范围内的流行和暴发更为频繁,尤其在我国东南沿海地区和东南亚,其发病率和病死率急剧上升。
但目前对登革病毒致病机制仍不清楚,也缺乏安全有效的疫苗。
登革病毒的基因组是单股正链RNA 分子,由于其复制过程不涉及DNA 中间体,对其基因组RNA 进行分子生物学操作有赖于病毒基因组全长感染性克隆(反向遗传系统)。
通过感染性克隆可在DNA 水平上对病毒基因组进行改造和修饰,从而可进一步阐明其致病及减毒的分子机制。
自1978年Taniguchi 等[1]首次获得动物病毒的感染性克隆以来,该技术已成为RNA 病毒分子生物学研究的有力工具。
为探讨我国登革病毒基因组结构与功能的关系,尤其是衣壳蛋白C 基因突变对其生物学性质的影响,本研究拟构建我国登革2型病毒DE N2243株的反向遗传系统,为进一步深入探讨其致病机制及新型减毒疫苗的研制奠定基础。
611 军事医学科学院院刊 2006年4月第30卷第2期Bull Acad M ilMed Sci,Ap r 2006; Vol 30 No 2 1 材料与方法1.1 病毒株、细胞株和载体登革2型病毒43株(DE N2243),1987年从我国广西登革热患者血清中分离,病毒经小鼠乳鼠脑传代后于-70℃保存;C6/36细胞和BHK细胞,以上均为本室保存。
低拷贝载体p W SK29由Georgia大学Kushner博士赠送。
1.2 工具酶及主要试剂用于制备RNA的TR I zol试剂购自Gibco BRL公司; RNaseH、高效反转录酶(Superscri p t T M RNaseH-reverse tran2 scri p tase)购自I nvitr ogen公司;高保真PCR扩增系统(expand high fidelity PCR system)购自B.M.公司;T4DNA连接酶,体外转录试剂盒(R ibo MAXT M Large Scale RNA Pr oducti on Syste m s),帽子结构类似物(RNA cap structure anal og)及5′/ 3′RACE试剂盒均购自Pr omega公司;RNA提取试剂盒(RNeasy m ini kit),质粒提取试剂盒(Q I A quick p las m id ex2tracti on kit)购自Q iagen公司。
1.3 引物设计根据我室已测定的DE N2243株病毒基因组序列(Gen2 Bank登录号为AF119661)及载体p W SK29序列(Gen Bank 登录号为AF016889)设计扩增及鉴定引物,由上海生物工程公司合成。
用于DE N2243病毒株基因组全长c DNA分子扩增的上、下游引物分别为2(+)和2(-),为进行体外转录,在上游引物中添加一长度为18bp的T7RNA聚合酶启动子核心序列。
同时,为将全长c DNA分子克隆至载体p W SK 29,在该对引物中分别添加C laⅠ和XbaⅠ内切酶识别序列。
用于5′半分子扩增的上、下游引物分别为2(+)和2.5 (-);3′半分子扩增的上、下游引物分别为2.6(+)和2 (-)。
用于全长cDNA分子鉴定的引物为2.1(+)、2.1 (-)～2.10(+)、2.10(-),所对应的10个片段2.1～2.10覆盖DE N2243病毒株整个基因组。
全长c DNA分子与p W SK29接头部分的测序引物为D(+)和D(-),见表1。
表1 用于D EN2243病毒株基因组全长c D NA扩增和鉴定的引物引物名称位置PCR产物长度(bp)核苷酸序列(5′3′)2(+)1～30AGG GCC ATC G AT TAA TAC G AC TCA CTA TA G AGT TGTT AG TCT ACG TGG ACC G AC AAA2(-)10723～1069910765AGT GTC TCT AG A ACC TGT TG A TT C AAC AGC ACC ATTCCA TTT TC2.1(+)1～30AGT TGT T AG TCT ACG TGG ACC G AC AAA2.1(-)2450～24262450TTT TTC CAG CTC ACA ACG CAA CCA C2.2(+)1993～2012ACA GTC AAC CCA ATC GT A A C2.2(-)2450～2426518TTT TTC CAG CTC ACA ACG CAA CCA C2.3(+)2244～2266CCA CCA AGT TTT CGG AGC AAT CT2.3(-)4300～42782057CGG CTC TCT CCA GTT CCA AAT CG2.4(+)4201～4223AAT G AC ATT CCC ATG ACA GG A CCA2.4(-)4892～4870692CCT ATG GTT CCG GCG TTG GTT TT2.5(+)4201～4223AAT G AC ATT CCC ATG ACA GG A CCA2.5(-)5846～58191645ATC ACC CGC TCT TCA CCA TCT GTT AGT A2.6(+)5375～5401AAG CCC ATT TCA CAG ACC CAG CAA GT A2.6(-)6000～5977626CAT TTT AGC TTC TTT CCA GTG TGC2.7(+)5375～5401AAG CCC ATT TCA CAG ACC CAG CAA GT A2.7(-)7881～78582507TGT T AG GCC TTT G AC TTC TCT T AC2.8(+)7413～7431AGC GCA CGG GGC T AT CTC C2.8(-)7881～7858469TGT T AG GCC TTT G AC TTC TCT T AC2.9(+)7714～7737G AA ACG G AC CAT CAC GCT GTG T CG2.9(-)9396～93731683G AG TCC AT A GGT ACC AAC TTG TCC2.10(+)9313～9336AG A CCA ACA CCA AG A GGC ACA GT A2.10(-)10723～106991411AG A ACC TGT TG A TTC AAC AGC ACC AD(+)1683～1712GCA AGG CG A TT A AGT TGG GT A ACG CCA GGGD(-)1919～1890AAC CCT CAC T AA AGG G AA CAA AAG CTG G AG 斜体部分为T7RNA聚合酶启动子核心序列;加线处为内切酶识别序列;黑体为保护性碱基1.4 全长c D NA的扩增与鉴定取DE N2243病毒株感染发病的乳鼠脑,用T R I zol试剂提取总RNA,加入反转录引物2.10(-),95℃作用3m in后,依次加入RNA酶抑制剂(150U)、5×第一链缓冲液、d NTPs(终浓度为0.45mmol/L)及高效反转录酶(200U),加水至30μl,42℃保温3h进行反转录。