酶法提取猪皮中胶原蛋白的工艺优化

吉林农业大学学士学位论文题目名称：酶法提取猪皮中胶原蛋白的工艺优化学生姓名：王发明院系：生命科学学院专业年级：07级生物技术指导教师：王莘职称：教授2011年5月17日目录题目 (Ⅰ)摘要及键词 (Ⅰ)1 前言 (1)2 实验材料和方法 (1)2.1 实验材料和仪器 (1)2.1.1 实验材料及试剂 (1)2.1.2 实验仪器 (1)2.2 实验方法 (1)2.2.1 猪皮的简单预处理 (1)2.2.2 胶原蛋白的提取和纯化 (1)2.3 蛋白质含量测定 (1)2.3.1 考马斯亮蓝法 (1)2.3.1.1 标准曲线的制作 (1)2.3.1.2 样品蛋白的测定 (2)2.3.1.3 蛋白质含量计算 (2)3 结果与分析 (2)3.1 酶处理条件对胶原蛋白提取量的影响 (2)3.1.1 酶处理pH值对胶原蛋白提取量的影响 (2)3.1.2 酶处理时间对胶原蛋白提取量的影响 (3)3.1.3 酶处理温度对胶原蛋白提取量的影响 (3)3.1.4 加酶量对胶原蛋白提取量的影响 (4)4 讨论 (4)5 结论 (5)参考文献 (5)致谢 (6)酶法提取猪皮中胶原蛋白的工艺优化姓名：王发明专业：生物技术指导教师：王莘摘要：目的：对猪皮中进行胶原蛋白提取。

方法：用中性蛋白酶预处理猪皮，再用考马斯亮蓝法测得胶原蛋白的含量。

结果：在单因素试验的基础上，通过对比实验确定胶原蛋白提取的最佳条件:酶处理pH6,加酶量(E/ S)400 U/g，温度40 ℃，处理时间2h。

关键词：胶原蛋白; 酶处理; 考马斯亮蓝Semi-bionic extraction of pigskin to optimize the technology ofcollagenName：Wang FamingMajor：BiotechnologyTutor：Wang XinAbstract: purpose:The pigskin extraction of collagen. Methods: use neutral protease pretreatment pigskin, reoccupy test measured MaSiLiang blue method of collagen content. Results: on the basis of single factor experiment, through the contrast experiment determined the best condition of collagen extraction enzyme treatmentpH6, add, enzyme quantity (E/S) 400 U/g, temperature 40 ℃, the processing time 2h. Keywords: Collagen; Enzyme treatment; Coomassie Brilliant BlueI1 前言猪皮中的蛋白质含量高达33%，其中胶原蛋白含量为87.8%[1]，而瘦猪肉的蛋白含量仅为18 %左右。

由此看来猪皮中的蛋白质含量远高于瘦猪肉，其营养价值十分可观。

此外胶原蛋白具有特殊的结构与功能,并具有皮肤保湿等的用途，开发胶原蛋白产品已经成为人们研究的热点[2]。

随着生物和高分子科学的不断发展,人们会对此有更深的了解和认识，因此开发胶原蛋白资源具有广阔的前景。

本论文实验研究主要利用中性蛋白酶处理猪皮，采用考马斯亮蓝方法测定猪皮中的胶原蛋白含量的方法。

通过酶的不同处理条件，胶原蛋白提取量的比较来确定胶原蛋白提取的最佳条件，是对胶原蛋白的提取进行的基础性研究工作。

2 材料和方法2.1 实验材料和仪器2.1.1 实验材料及试剂猪皮，中性蛋白酶，牛血清蛋白，无水乙醇，NaCl溶液，蒸馏水，考马斯亮蓝溶液2.1.2 实验仪器电动搅拌器，电子天平，恒温水浴锅，离心机，分光光度计2.2 实验方法2.2.1 猪皮的简单预处理[3]将皮下脂肪剔除，切成10mm×10mm的小块，用35℃的清水洗2次，再用无水乙醇浸泡，振荡约10小时，弃掉有机溶剂。

2.2.2 胶原蛋白提取和纯化称取一定量经简单预处理的皮块于烧杯中，加入相应量的中性蛋白酶，并用缓冲溶液控制pH值，在一定温度下搅拌一定时间，离心去残渣[4]，上清液经考马斯亮蓝法测得蛋白质提取量[5]。

2.3 蛋白质含量的测定2.3.1 考马斯亮蓝法2.3.1.1 标准曲线的制作[6]称取10mg牛血清蛋白用蒸馏水定容至100ml（100ug/ml）分别取0ml，0.1ml，0.2ml，0.3ml，0.4ml，0.5ml，0.6ml，0.7ml，0.8ml，用蒸馏水补足1ml，再分别加入5ml考马斯亮蓝G-250，摇匀。

放臵2min后在595nm波长下比色测定（比色应在1h内完成测定）。

以牛血清蛋白含量（ug）为纵坐标，以吸光度为横坐标。

如图3-11图2-1标准曲线Figure2-1 standard curve2.3.1.2 样品蛋白的测定取1试管准确加入0.1ml蛋白溶液，再加入0.9ml蒸馏水，5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放臵2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595nm 波长下比色，记录吸光度2.3.1.3 蛋白质含量计算样品蛋白质含量（ug/g)=CV T/WV S试中C ——查标准曲线值V T——提取液总体积W——猪皮鲜重V S——测定时加样量3 结果与分析3.1 酶处理条件对胶原蛋白提取量的影响3.1.1 酶处理pH值对胶原蛋白提取量的影响称取一定量经简单预处理的猪皮,在不同pH体系下进行酶处理，酶处理温度35℃、酶处理时间2h、加酶量400U/g。

之后进行考马斯亮蓝法测得蛋白质含量，实验结果见图3-1所示。

图3-1酶处理时pH对提取蛋白量的影响Figure 3-1 Enzymes to extract protein when processing the amount of the pH influence2从图3-1可以看出，蛋白的提取量在pH6到6.5的区间内不断升高，pH6.5时达到最大值，而pH6.5到7.5之间逐渐下降，之后逐渐趋于平稳，说明pH6.5是该酶的最适PH。

3.1.2 酶处理时间对胶原蛋白提取量的影响称取一定量经简单预处理的猪皮，用酶处理不同的时间，酶处理温度35 ℃、pH 6.5加酶量400 U/g。

之后进行考马斯亮蓝法测得蛋白质含量，实验结果见图3-2所示。

图3-2 酶处理时间对蛋白量的影响Figure 3-2 Enzymes to protein processing time the amount of influence从图3-2可以看出，蛋白提取量在酶处理时间1小时到2小时逐渐升高，在2小时时达到最大值，之后又随着酶处理时间增加而降低，说明该酶的最适处理时间为2小时。

3.1.3 酶处理温度对提取量的影响称取一定量经简单预处理的猪皮，在不同温度下进行酶处理，酶处理时间2 h、pH 6.5、加酶量400U/g。

之后进行考马斯亮蓝法测得蛋白质含量，实验结果见图3-3所示。

图3-3 酶处理温度对蛋白量的影响Figure 3-3 Enzyme treatment effect of temperature on protein quantity3从图3-3可以看出蛋白的提取量随着酶处理温度的升高而逐渐升高在40℃的时候达到最大追，之后又随着温度升高而降低，说明该酶的最适温度为40℃。

3.1.4 加酶量对胶原蛋白提取量的影响称取一定量经简单预处理的猪皮，采用不同的加酶量对猪皮进行酶处理，酶处理温度35℃、pH 6.5、时间2h。

之后进行考马斯亮蓝法测得蛋白质含量，实验结果见图3-4所示。

图3-4 加酶量对蛋白量的影响Figure 3-4 Add enzyme amount of protein amount of influence从图3-4可以看出，蛋白提取量随着加酶量的增加而组建升高在400U/g时达到最大值，之后随着加酶量增加而组建降低，说明加酶量在400U/g时蛋白提取量最大。

4 讨论4.1 胶原蛋白的提取量在pH值6.5时最大。

而在两边区域，蛋白量均有所降低。

这说明对于中性蛋白酶而言，在pH偏酸性时，对猪皮的处理效果最好。

4.2 胶原蛋白的提取量在酶处理时间为2 h时出现最高值。

而在两边区域，蛋白质的量均有所降低，酶处理时间过短，不能充分疏松猪皮表层结构、除去非纤维蛋白中的球状蛋白、软化胶原蛋白的皮层，酶处理时间过长，猪皮中部分胶原蛋白可能溶于缓冲溶液中，导致猪皮中胶原蛋白溶失，胶原蛋白提取量低，因此酶处理时间过长或过短，都会影响胶原蛋白的提取量。

4.3 胶原蛋白的提取量在酶处理温度40 ℃时出现最高值。

而在两边区域，提取率均有所降低。

说明中性蛋白酶在40℃时酶处理效果最好，过高或者过低的温度都可能导致酶活性的降低，甚至失活，从而影响酶处理的效果。

4.4 胶原蛋白的提取量在加酶量400 U/g 时出现最高值。

而在两边区域，提取率均有所降低。

这是由于中性蛋白酶作为一种生物催化剂，对底物的吸附作用有一定的饱和度，随着加酶量的增加，与底物的结合是逐渐饱和,因此提取率逐渐增加；然而，当酶用量增大到饱和值后，猪皮中一部分胶原蛋白由于受酶作用而被缓冲溶液溶解，所以导致提取率略有下降。

45 结论采用中性酶法预处理再用考马斯亮蓝法测定猪皮中胶原蛋白的最佳工艺条件是酶处理pH 6.0、处理温度40℃、加酶量(E/S)400 U/g、处理时间2h。

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