酶法提取灵芝多糖的工艺研究

2 结果与分析
2.1 醇沉法提取灵芝发酵液中多糖 共进行 4 次重复性实验，测定灵芝发酵液中
多糖含量，结果见表 1。
表 1 醇沉法提取灵芝发酵液中多糖的含量
样品
多糖/(mg/ 100 mL)
Ⅰ 150.23
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ 平均
149.18 155.19 154.23 152.21
从表 1 可以看出，醇沉法提取灵芝发酵液中 多糖的含量平均为 152.21 mg/100 mL。
2009 年 第 34 卷 第 6 期
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
提取物与应用
酶法提取灵芝多糖的工艺研究
董玉玮， 苗敬芝， 曹泽虹， 高明侠， 吕兆启 * (徐州工程学院食品工程学院，徐州 221008)
摘要： 采用酶法加乙醇沉淀法提取灵芝多糖，研究了酶法提取多糖的工艺条件。结果表明：纤
Key words: enzymatic method; extraction; Ganoderma lucidum; polysaccharide
灵芝(Ganoderma lucidum)是我国医学宝库中的 一味珍贵中药，含有多种有效药用成分，其中灵 芝多糖是一种非特异性免疫刺激剂，具有强化人 体免疫功能、抗肿瘤、抗衰老及清除自由基等生 理功能[1-3]。灵芝多糖的提取方法有水提法[4]、碱提 法、醇提法和酶提法等[5-7]，其中酶提法是利用酶 对细胞结构的破坏作用，使存在于细胞内部的多 糖释放出来，从而提高了多糖的得率。本文采用 纤维素酶、果胶酶和植物蛋白水解酶对灵芝进行 水解作用，研究灵芝多糖的最佳提取工艺，并探
收稿日期： 2008-10-24
＊ 通讯作者
基金项目： 江苏省高校自然科学基础研究面上项目(07 KJD550202)。
作者简介： 董玉玮(1980—)，男，江苏徐州人，讲师，研究方向为食品生物技术。
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2009 年 第 34 卷 第 6 期
按照所得的各种酶的最适条件，进行 3 次重复 性实验，测得灵芝发酵液中多糖含量结果见表 2。
从表 2 可知，纤维素酶水解灵芝发酵液后得 到的多糖含量最多，植物蛋白水解酶次之，但考 虑到其价格昂贵，故选择纤维素酶作为最适酶源。
表 2 灵芝发酵液中多糖的含量
酶类
多糖含量/(mg/100 mL) 平均/(mg/100 mL)
讨酶法加乙醇沉淀法提取灵芝多糖的效果，并进 行多糖提取方法的评价，为今后充分利用灵芝资 源提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料、 试剂与仪器 赤芝：徐州市铜山县食用菌科技开发服务中
心；原料：玉米粉、黄豆粉、马铃薯。 纤维素酶：(10 万 U/g)、果胶酶：(1.8 万 U/g)：天津
市诺奥科技发展有限公司；植物蛋白水解酶：6 万 U/
文献标志码： A
文章编号： 1005-9989(2009)06-0217-03
Extraction of polysaccharide in Ganoderma Lucidum by enzymatic method
DONG Yu-wei, MIAO Jing-zhi, CAO Ze-hong, GAO Ming-xia, LV Zhao-qi*
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pH4.5，酶浓度 0.5%，时间 80 min 时，酶解温度
选择 20、30、40、50、60 ℃。酶解温度对提取多
糖含量的影响结果见图 3。
多糖含量/(mg/100 mL)
多糖含量/(mg/100 mL)
200
180
160
140
120
100
80
纤维素酶
60
果胶酶
40 20
植物蛋白 水解
0
3 3.5 4 4. 5 5 5.5 6 6.5 7
pH 值
图 4 pH 对灵芝多糖提取的影响
由图 4 可以看出，纤维素酶酶解 pH 为 5.0 时 多糖含量最高，为 198.76 mg/100 mL，因此选择 纤维素酶最适 pH 为 5.0；果胶酶和植物蛋白水解 酶pH 为 4.5 时多糖含量最高，分别为 165.72 mg/100 mL 和 173.45 mg/100 mL，因此选择果胶酶和植物 蛋白水解酶最适 pH 为 4.5。 2.2.5 重复性实验
纤维素酶 194.33 198.76 199.39
197.49
果胶酶 169.86 162.45 165.19
165.83
植物蛋白水 解酶
174.23
177.18 179.19
176.87
2.3 酶法与乙醇沉淀法提取灵芝多糖的比较
将同一摇瓶中灵芝发酵液三等分，1/3 发酵液
用纤维素酶法水解，1/3 用醇沉法提取，1/3 用纤 维素酶法加乙醇沉淀法提取多糖，结果见图 5。
多糖含量/(mg/100 mL)
200
180
160
140
120
100 80 60
纤维素酶 果胶酶 植物蛋白水解酶
40
20
0
0
1
2
3
4
5
酶浓度/%
图 1 酶浓度对灵芝多糖提取的影响
从图 1 可以看出，纤维素酶和果胶酶浓度为 0.5%时，多糖含量最高，分别为 181.22 mg/100 mL 和 160.22 mg/100 mL，因此选择纤维素酶和果胶酶 最适浓度为 0.5%；植物蛋白水解酶浓度为 1.0% 时，多糖含量最高，为 166.54 mg/100 mL，因此选 择植物蛋白水解酶最适浓度为 1.0%。 2.2.2 酶解时间对多糖提取的影响 控制纤维素 酶、果胶酶和植物蛋白水解酶 pH 分别为 4.5、4.5 和 5.0，酶浓度分别为 0.5%、0.5%、1%，温度 50 ℃ 下，分别反应 40、60、80、100、120 min。酶解 时间对提取多糖含量的影响结果见图 2。
维素酶提取多糖的最佳条件是：加酶量 0.5%，酶解时间 80 min，酶解温度 55 ℃，pH5.0，多糖
含量为 196.50 mg/100 mL。采用纤维素酶加乙醇沉淀法提取，多糖含量为 211.21 mg/100 mL。灵
芝多糖的提取率显著提高。
关键词： 酶法；提取；灵芝；多糖
中图分类号： TQ 929+2
200
180
160
140
120
100
Biblioteka Baidu
80
纤维素酶
60
果胶酶
40
植物蛋白水解酶
20
0
15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
温度/℃ 图 3 酶解温度对灵芝多糖提取的影响
从图 3 可以看出，纤维素酶和植物蛋白水解 酶酶解温度为 55 ℃时，多糖含量最高，分别为 192.56 mg/100 mL 和 169.87 mg/100 mL，因此选择 纤维素酶和植物蛋白水解酶最适反应温度为 55 ℃； 果胶酶酶解温度为 40 ℃时，多糖含量最高，为 163.56 mg/100 mL，因此选择果胶酶最适反应温度 为 40 ℃。 2.2.4 pH 对多糖提取的影响 控制纤维素酶酶浓 度 0.5%，时间 80 min，温度 55 ℃时， pH 值选择 3.5、 4.0、 5.0、 6.0； 果 胶 酶 和 植 物 蛋 白 水 解 酶 酶 浓度分别为 0.5%、1.0%，时间分别为 80、60 min， 温 度 分 别 为 40、 55 ℃ 时 ， pH 值 选 择 3.5、 4.5、 5.5、6.5。pH 对提取多糖含量的影响结果见图 4。
g，南宁海发生物酶制品厂；其余试剂：分析纯。 PDA 斜面培养基：按照 GB4789.15 配制，用
于菌种的复苏及保存；液体摇瓶培养基：黄豆粉 3%、葡萄糖 2%、酵母膏 0.5%、KH2PO4 0.15%、 MgSO4·7H2O 0.15%、VB1 少量，pH 自然。
HYG-Ⅱ回转式恒温调速摇瓶柜：上海欣蕊自 动化设备有限公司；7200 可见分光光度计：上海 龙尼科公司；PHS- 3C 精密电子酸度计：上海天 达仪器有限公司。 1.2 方法 1.2.1 菌种培养 取一小块菌种接种于斜面培养 基上，27 ℃下培养 6 d，活化 1 次。接种活化后的 菌块于 80 mL 液体培养基中，摇瓶置于 27 ℃摇床 培养，转速 120 r/min，培养 4~5 d。 1.2.2 醇沉法提取灵芝发酵液中多糖 灵芝中发 酵液多糖所占比重最多[8]，故以发酵液中多糖为提 取对象。用两层纱布过滤发酵液，将其在 80 ℃水 浴锅浓缩成原体积的 1/5 倍，冷却后加入 5 倍体积 95%乙醇，4 ℃净置 1d 后 4000 r/min 离心 10 min， 沉淀用无水乙醇洗涤 2 次，60 ℃烘箱烘干至恒质 量，沉淀干燥得胞外粗多糖。 1.2.3 酶法提取灵芝发酵液中多糖 用两层纱布 过滤发酵液，将其置于酶的最适温度的水浴锅内， 根据上清液体积称取一定量的酶，加入缓冲液， 调节最适 pH，将酶液加入已调过 pH 的上清液中， 置于该水浴锅中酶解一定时间，移入 100 ℃水浴 锅中灭酶，4000 r/min 离心 10 min，沉淀用无水乙 醇洗涤 2 次，60 ℃烘箱烘干至恒质量，沉淀干燥 得胞外粗多糖。 1.2.4 灵芝多糖含量的测定 提取液中的多糖含 量测定采用苯酚硫酸法[9]，在 490 nm 波长下测定 吸光度值，并以提取液的 A490 nm 减去空白的 A490 nm， 表示多糖的含量。
(Food Institute of Technology, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008)
Abstract: Alcohol method and enzymatic method were used to extract polysaccharide from Ganoderma
2.2 酶法提取灵芝多糖的效应
2.2.1 酶浓度对多糖提取的影响 控制纤维素酶、
果胶酶和植物蛋白水解酶 pH 为 4.5、4.5 和 5.0，
酶 解 时 间 80 min， 温 度 50 ℃ ， 酶 浓 度 分 别 为
0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%。酶浓度对提取
多糖含量的影响结果见图 1。
lucidum in this paper. The technic conditions of polysaccharide extraction were researched. The results showed that the optimum polysaccharide extraction conditions using cellulase was as follows: the amount of cellulase was 0.5% , hydrolysis time was 80 min, hydrolysis temperature was 55 ℃ , pH was 5.0, the polysaccharide content was 196.50 mg/100 mL. Using cellulase and alcohol-extraction method to extract polysaccharides and the amount of extraction was 211.21 mg/100 mL. The extraction rate was raised highly.
200
多糖含量/(mg/100 mL)
150
100
纤维素酶
果胶酶
50
植物蛋白水解酶
0 0 20 40 60 80 100 120 140 时间/min 图 2 酶解时间对灵芝多糖提取的影响
从图 2 可以看出，纤维素酶和果胶酶酶解时 间为 80 min 时 ，多糖 含 量 最 高 ， 分 别 为 182.05 mg/100 mL 和 158.76 mg/100 mL，因此选择纤维素 酶和果胶酶最适反应时间为 80 min；植物蛋白水 解酶酶解时间为 60 min 时，多 糖含量最高 ，为 164.89 mg/100 mL，因此选择植物蛋白水解酶最适 反应时间为 60 min。 2.2.3 酶解温度对多糖提取的影响 控制纤维素 酶和植物蛋白水解酶 pH 分别为 4.5、5.0，酶浓度 分别 0.5%、0.1%，时间分别为 80、60 min 时，酶 解 温 度 选 择 25、 35、 45、 55、 65 ℃ ； 果 胶 酶