杀菌剂生物测定技术

孢子萌发法的适用范围
孢子萌发法只适用于产生孢子的真菌。 一般的供试病菌有： 马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans） 水稻稻瘟病菌（Piricularia oryzae） 小麦赤霉病菌（Gibberella zeae） 玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）
（4）用消毒镊子夹取灭菌的圆形滤纸片
（直径为0.6或0.8cm）投入不同浓度药液 中，1分钟后取出，放入含真菌孢子的 培养基上，每皿放6片（5个浓度各1片， 另1片为对照片），恒温培养一定时间， 测抑菌圏直径。
注意事项
各滤纸片间距要适合，以防形成的抑菌圈 不园 放滤纸片时要平放、更迅速、准确、放下 后不能再移动 用十字交叉法测量抑菌圈的直径
抑菌圏法的优缺点
抑菌圏法的优点
精确度高 操作简单
抑菌圏法的缺点
溶解性 扩散性
含有孢子 的培养基
不同浓度 的药液
抑菌圈法示意图
根据施加药剂在洋菜培养基表 面的方式，抑菌圈法又分为管碟法 （牛津杯法）、滤纸片法、孔碟法。
管碟法 又称牛津杯法
（1） 用灭菌蒸馏水将供试药剂配制成一系列
梯度浓度，一般5~7个浓度。 （ 2 ） 制备一定“浓度”的供试菌悬浮液（如 真菌，则宜用孢子悬浮液），浓度以在低倍镜 （15X10倍）下每视野80一100个左右孢子为宜。
反面（有菌丝的一面向下和培养基贴合）移植 到带毒培养基平板上，一个培养皿最好接一个 菌饼。 （4）测定菌落直径 恒温培养到预定时间后，
取出培养皿测量菌落直径。每个菌落十字交叉 测两次直径。
菌饼
含药剂的 培养基
生长速率法示意图
菌饼
含毒培养基
计算公式
纯生长量＝菌落直径－菌饼直径
对照的纯生长量－处理的生长量
第三章 杀菌剂生物测定技术
供试菌种 杀菌剂生测的应用 杀菌剂生测方法 杀线虫生测方法 杀菌剂盆栽试验 杀菌剂田间药效试验
杀菌剂室内生物测定的主要内容 是将杀菌物质作用于细菌、真菌或 其他病原微生物，根据其作用的大 小来判定药剂的毒力。或将杀菌物 质施于植物，对病害发生的有无或 轻重观察比较来判定药剂的效果。
2.含毒介质培养法
有 3种 ： （1）抑菌圈法 （2）生长速率法 （3）最小浓度法
（1）抑菌圈法的原理
基本原理是在已经接种供试菌的洋菜培养基 基本原理是在已经接种供试菌的洋菜培养基 （通常在培养皿内）表面，利用各种方法（管 通常在培养皿内）表面，利用各种方法（ 碟法，滤纸片法，孔碟法 ）使药液和培养基接 碟法，滤纸片法， 触，恒温培养一定时间后，由于药剂的渗透扩 恒温培养一定时间后， 散作用， 散作用，施药部位周围的病菌被杀死或生长受 到抑制，从而产生了抑制圏。 到抑制，从而产生了抑制圏。根据抑菌圈的大 小来比较不同杀菌剂的毒力大小。 小来比较不同杀菌剂的毒力大小。
有效好的水溶性
（2）生长速率法原理
将不同浓度的药液和热的培养基 混合，用这种含毒培养基培育病， 以病原菌的生长进度的快慢来判定 药剂的毒力大小。
病原菌生长的表示方法
有2种： ① 菌落达到一定的大小所需时间，
② 一定时间内菌落的直径大小。
生长速率法的优缺点
优点： ① 操作比较简单
② 适用范围广，适用于乳油、水剂、可湿性 粉剂等 ③ 重复性好。只要操作认真，均可得到可靠 的结果
抑制率计算
孢子萌发率（%）＝萌发孢子数/检查孢子数X100 若对照组有20%以上孢子不萌发，则应重做。 对照萌发率－处理萌发率 抑制孢子萌发率（%）＝－－－－－－－－－X100 对照萌发率
LC50 和LC95的计算
将抑制孢子萌发率换算成机率值，作为Y； 药剂的浓度以对数值来表示作为X，直线回归， 求得回归方程Y＝a+bx，可得LC50和LC95.。
三、杀菌剂室内主要生测方法
孢子萌发法 管碟法 含毒介质培养法 滤纸片法 孔碟法 生长速率法 最小浓度法 叶碟法 抑菌圈法
1.孢子萌发法
孢子萌发法是历史最悠久而广泛被采用 的 杀 菌 剂 毒 力 测 定 方 法 。 早 在 1807 年 。 Prevost 就采用此法，后经不少学者改进， 使之日趋规范、合理。
抑菌圈法示意图
注意事项
上述操作应尽量在无菌条件下进行， 以防污染 操作室的温度最好在26～28℃左右， 如室温太低，则50℃左右的培养基在操作 过程中迅速冷凝，无法制作平板 十字交叉法测量抑菌圈的直径 ，消除误 差
滤纸片法
（1） （2） （3） 配制不同浓度的药液 配孢子悬浮液 制含孢子的平板 前三步完全和上述管碟法相同
原理：都是将供试药剂附着在载玻片上或其 他平面上，然后将供试病菌孢子悬浮液滴在 上面（或将施于悬浮液和药液混合后滴在玻 片上），在保温，保温条件下培养一定时间 后镜检，以孢子萌发率判断杀菌剂毒力。孢 子萌发法的突出优点是快速，试验当天即可 获得结果，尤其适合于保护剂的筛选。
孢子萌发的标准
以病菌孢子作为指示物进行杀菌剂毒力测定。 用孢子液和不同浓度的药液混合，恒温保湿培养， 培养一定时间后即可检查孢子萌发率。一般在低 倍镜下，每处理随机检查200个孢子。
叶碟漂浮法
还有一种叶碟漂浮法，其原理是 将容易感染供试菌的植物叶片（如黄 瓜叶片）制成直径1.5cm叶碟，漂浮 在不同浓度的药液中，将供试菌（如 黄瓜霜霉病菌）孢子悬浮液定量滴加 在叶碟上，在光照下培养一定时间， 调查病斑面积。
四、杀线虫剂的生物测定技术
特别是为某一特定病害寻求有效的防治药剂时， 实际上不可能对供试菌进行选择，但以水平扩散 法作生物定量测定，如抗菌素效价测定，则必须 对供试菌有如下的要求： 对被测定的药剂有适当的敏感性，抑菌圈界 限明显 培养容易，生长迅速不易为杂菌污染 发生变异 不易
容易作成接种菌液（菌丝体或孢子悬浮液） 菌种有较强的耐热能力
生长速率法
（1）制备菌饼：用无菌的打孔器在供试菌种边缘 打下菌块即菌饼（在无菌条件下进行） （2）含毒培养基的制备：奖供试药剂稀释成一系 列梯度浓度后，准确取一定量的药液加入到热的培 养基中，混匀，倒入灭菌的小培养皿中（直径为 6cm），待冷凝后即为含毒培养基
（3）移植菌饼
用接种针或消毒的摄子将菌饼
（3）待培养基冷至50℃左右（凭经验估计）， 迅速吸取10ml菌液加入培养基内，充分混合后， 倒入灭菌的培养皿中，制成含菌培养基平板。
（4）在每皿培养基上按合适的间隔放置6个 不锈钢小管（即牛津杯，外径8.0士 0.lmm。 内径6.0士0.1mm，高10.0士0.lmm），其中1 个管为对照，其余5管为5个不同浓度的药液， 在适合的温度下培养一段时间，取出用十字 交叉法测是抑菌圈的直径。
一、供试菌种
供试病原菌要求
在分类上有一定代表性，最好是重要的农 业植物病害的病原菌， 而且容易培养， 多代繁殖不易产生变异。
常用的供试菌种
番茄灰霉病菌（Botrytis cintrea） 番茄早疫病菌（Alternaria solani） 辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici） 苹果轮纹病菌（Physalospora berengeriana） 苹果炭疽病菌（Glomerella cingulata） 苹果腐烂病菌（Valsa mali） 葡萄黑痘病菌（Elsinoe ampelina） 葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）
根据培养基是固态还是液态又将最低抑制浓度法 分为 液体培养基稀释法 固体培养基稀释法
液体培养基稀释法
取若干只灭菌试管，顺序编号，在每只试管 中加入适合供试菌生长的液体培养基Nml，然后 在第一号试管中加入一定浓度的供试药液Xml， 充分混合后自第一管中取Nml放入第二管，充分 混合后取Xml加入第3管，直到最后一管不加药 液作为对照。自倒数第二管中取出Xml弃去不用， 如此所得的一系列浓度顺序相差一倍。
2
对药剂的要求
用抑菌圈法测定一种药剂的抑菌作用的大小，有一定
的局限性。如与该药剂的理化性质有密切的关系。如是否 容易扩散。若有很好的扩散性能，就能真实反映该药剂的 杀菌毒力。如由于大多数抗生素都有一定的水溶性，因此， 抑菌圈法为抗生素的科研和生产广泛采用。而有相当一部 分杀菌剂的原药是不易溶解于水，故扩散性不好，要用该 法，就要用适量的乙醇或丙酮溶解后，再用水稀释至所需 的浓度。
缺点： 对供试菌种要求严格，病菌要易于培养， 生长较快且边缘 整齐、产孢子缓慢，而且 是农业生产上重要的的病原菌。 对供试药剂要求，有一定的耐热性，遇 热不易分解。
生长速率法常用的菌种
苹果腐烂病菌（Valsa mali） 小麦纹枯病菌（Rhzoctonia solani ） 棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium） 葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella） 小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis） 辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）
在各管中加入供试菌悬浮液一滴，在该供 试菌最适温度下培养一定时间，取出观察 “终点”，一般以混浊度为准，即以某编号 试管以下不再发生明显混浊现象，这一试管 的浓度就是最低抑制浓度。1234 Nhomakorabea5
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固体培养基稀释法
用灭菌蒸馏水将供试药制按等比或 等差级数稀释一系列药液浓度。分别取 每种浓度的药液Xml分放50ml灭菌三角 瓶，加 入灭菌 并冷至60 左右的 培养基 Yml，立即摇匀倒入培养皿内凝固。用 接种环沾取供试菌液进行划线培养，至 一定时间后观察抑制病菌生长的最高稀 释倍数即最低抑制浓度。
水稻稻瘟病菌（Piricularia oxyzae） 小麦赤霉病菌 (Gibberella zeae) 小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis） 玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum） 玉米弯孢病菌（Curvularia lunocto） 棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium） 枯草杆菌（Bacillus subtilis） 白菜软腐病菌（Erwinia carotovora sub sp.carotovora） 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas campestrispv.oryzae） 等。