第六章真核基因在大肠杆菌中的表达课件

4.使用galK（半乳糖激酶基因）作报告 基因分离功能启动子
能够检测启动子活性强弱的新型质粒载体系统。 来源于pBR322
转译终止密码子
无启动子的galK
原理： 半乳糖激酶能够从ATP分子上转移一个磷酸集 团给半乳糖分子，从而催化半乳糖发生磷酸化作 用，形成半乳糖-1-磷酸。 用同位素标记ATP，测定从ATP转移到半乳糖去 的32P的放射性强度，可推算报告基因（galK）表 达的半乳糖激酶的产量。
第六章 真核基因在大肠杆菌中的表达
真核基因的大肠杆菌表达体系 大肠杆菌的表达载体 克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中 的表达 影响克隆基因在大肠杆菌中表达效 率的因素
大肠杆菌表达体系 克隆基因正确表达的基本条件 克隆基因表达活性的检测
大肠杆菌表达体系
优越性： 1. 对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分 子机理有深刻的了解；
cAMP CAP
高效转录
Plac
葡萄糖代谢
o
基底水平转录
cAMP浓度降低
Plac
o o
高效动子封堵作用：由一个上游启动子驱动的转录作 用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的功 能受到抑制，将这种由一个启动子的功能活性抑制另 一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性，从而提高 蛋白质产物的水平。
克隆基因表达活性的检测
2.将含有外源基因的λ 噬菌体重组子，感染 到事先经过紫外线严格照射的大肠杆菌细胞上。 由于细胞经紫外线照射使DNA受到了损伤，自 身基因的表达受到了严重的抑制。通过同λ 噬 菌体载体编码的蛋白质种类作比较，就可以鉴 定出克隆基因编码的蛋白质产物。
克隆基因表达活性的检测
偶联反应测定法
克隆基因表达活性的检测
巨细胞检测法
1. 经紫外线照射的大肠杆菌recA uvrA细胞，DNA停 止合成，而质粒载体则可以继续合成，在紫外线照 射后6小时，细胞内质粒DNA的数量增加了10倍左右， 在紫外线照射后的几个小时内，加入经放射性标记 的氨基酸，此时合成的蛋白质绝大部分是质粒基因 所编码的。
筛选Apr、Tcs的转化子
3.核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转 录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起 始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分 子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数 百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列 所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
4.转译增强子
显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。
5. 转译终止子
mRNA转译终止必须存在终止密码子。 大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAA，尤其是在其后加 上U形成UAAU四联核苷酸的情况下，转译终止的效率便 会得到进一步的增强。
功能启动子的分离：
1.一般程序： 1. 选用一种适当的核酸内切酶，消化切割大肠杆菌 的染色体DNA， 2. 接着将切割产生的DNA限制片断群体，同一种无 启动子的质粒载体重组，按实验设计要求使克隆 的片断恰好插入在紧邻报告基因的上游位置 3. 随后把此重组混合物转.启动子的构建
Ptac =3 Ptrp = 11 Plac
常用的大肠杆菌表达载体
1. Lac启动子的表达载体
2. Trp启动子的表达载体 3. PL启动子的表达载体
理论上，凡是具有包括控制区段在内的lac操 纵子的质粒，都基本上具备了用作克隆基因表达 载体的条件。这类表达载体的最突出的特点是， 含有一条足够大的编码β -半乳糖苷酶的lacZ基因 片断。因此，每当有一个克隆的外源DNA片断插入 到这个启动子之后，人保持着lacZ基因固有的读 码结构时，这个重组质粒就会合成出一种由外源 克隆基因编码的多肽和β -半乳糖苷酶组成的融合 蛋白质。
基地水平转录
阻遏蛋白
乳糖启动子Plac的可控性 野生型的Plac与 其控制区Olac偶联 在一起，在没有诱 导物存在时，整个 操纵子处于基底水 平表达；诱导物可 以使启动子Plac介 导的转录大幅提高 P
乳糖 异丙基β－ D硫代半乳糖苷 IPTG
O
诱导
高效转录
P
O
乳糖启动子Plac的可控性
野生型的Plac上游附近 拥有代谢激活因子 （CAP）结合区， cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区， 进而促进Plac介导的转 录。葡萄糖代谢使cAP 减少，也能阻遏Plac介 导的转录。因此，基 因工程中使用的乳糖 启动子均为抗葡萄糖 代谢阻遏的突变型， 即Plac UV5
Ecoli DNA
2.无启动子的CAT质粒载体 CAT活性的检测： 氯霉素乙酰转移酶 可以催化氯霉素（2-或3-） 发 乙酰辅酶A
利用CAT基因 进行功能启动子 的分离和活性测定
薄层层析 放射自显影
3.使用tetr作报告基因分离功能启动子
强化转录终止的必要性：
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转 录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录 质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物 过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的 表达，其原因如下：
转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时 间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA 功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚 合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能， 甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程 菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级 结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率
1. 首先在大肠杆菌质粒pBR316（含有一个tet基因、 Hind 位点）上的tet的启动子序列中插入一个EcoR1的 酶切位点（ pBRH3B, pBRH1 ），使之失活。 2. 将纯化的细菌染色体DNA片断，克隆在pBRH3B或 pBRH1 的EcoR1限制性位点上；转化给对tet敏感的大肠杆菌寄主 细胞。
分离功能的启动子： 将大肠杆菌基因组的酶切片断，克隆在pOK1质粒载 体的MCS区的单克隆位点上； 将体外连接的DNA重组分子，转化给具GalE＋、 GalK －的大肠杆菌寄主细胞，避免内源半乳糖激酶的 干扰； 将它们涂布在麦氏培养基（含有PH值指示剂的中性 红和结晶紫，检测碳水化合物）上，筛选转化子（重 组子产生红色的菌落）。
报告基因（reporter gene）：
特指那些编码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单元 （半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤光素酶基因、半乳 糖激酶基因以及氯霉素乙酰转移酶基因等）。 追踪某种特定的DNA结构（重组质粒）是否已经导入寄主 细胞、抑或是器官和组织；也可用来同任何一种目的启动子 连接，因此其表达活性可作为检测启动子功能的依据
大肠杆菌表达体系
4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修 饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌 细胞中并不存在； 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白 质分子，并把它们降解掉。
克隆基因正确表达的基本条件
最基本条件：应该能够进行正常的转录和转译， 以及在正常情况下还与转译后加工及新生多肽在 细胞中的分布有关。
使DNA模板在细菌无细胞体系中，进行转录－ 转译偶联反应。经过改良的这种体系中，可以使 克隆在细菌质粒或噬菌体基因组上的外源片断进 行体外表达，就可以比较容易的确定多肽片断是 由编码模板上的哪个小片段指导合成的。
优点：
1. 放射性标记参入到蛋白质的效率，比体内标记 法高的多，而且这个系统十分敏感。经35S标记的 多肽分子，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显 影若干小时后可被迅速检出； 2. 应用这个体系，其它原核生物的基因也能够得 到有效的表达。
微细胞：指由某些细菌突变体菌株在其生长期间连续产 生的一类微小的圆形的无核细胞。
克隆基因表达活性的检测
通过蔗糖梯度离心将微细胞与正常细胞分开， 含有质粒载体的微细胞是适于检测重组子质粒 所携带的外源基因表达状况的理想体系。
克隆基因表达活性的检测
Example:
ColE1的衍生质粒（缺失了106dal）, 在微细胞中不能合成出56103dal、 42103dal、30103dal、 28103dal四种多 肽。其中3种多肽是大肠杆菌E1的降解产物。 当一段含有EcoR1甲基化酶的DNA片断插 入到卡那霉素基因内部时，便能在微细胞 中合成EcoR1甲基化酶和另外2种其它的多 肽分子。
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大肠杆菌表达载体
核糖体结合位点
启动子
组成部分
转录终止子
复制 起点
1.启动子 最佳启动子具备的条件 第一 必须是启动子能够克隆基因的蛋白质产物 的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上
第二 这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平， 因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的 蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种 极为重要的条件 第三 这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式 使用廉价的诱导物而得以诱导。 （IPTG）
启动子的筛选
采用鸟枪法战略，将合适 大小的DNA片段克隆到启 动子探针质粒pKO1上受体 细胞染色体DNA上的galE、 galT与质粒上报告基因galk 的表达产物联合作用，可 将培养基中的半乳糖酵解 成红色素物质
转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株
含有外源启动子活性的重组克隆
重要条件：编码的蛋白质产物应能维持正常的 稳定性。
克隆基因正确表达的基本条件
具有核糖体结合位点； 具有克隆基因的功能（强）启动子； 插入序列的正确取向。
克隆基因表达活性的检测
1.微细胞检测法； 2.巨细胞检测法； 3.偶联反应测定法。
克隆基因表达活性的检测
微细胞检测法
这是一种适于检测质粒基因表达的体内检测法。