分子标记
5-分子标记及相关的实验技术.
优点：多态性十分丰富，共显性。
缺点：引物设计比较困难。
4）AFLP标记
AFLP是基于限制性酶切和PCR的DNA标 记。 将样品DNA用限制内切酶进行酶切，再 对酶切片段进行有选择地扩增，检测其 多态性。
首先用两种能产生粘性末端的限制性内切酶将基
因组DNA切割成分子量大小不等的限制性片段，然 后将这些片段和与其末端互补的已知序列的接头连 接，所形成的带有接头的特异片段用作随后的PCR 反应膜板。 PCR引物5´端与酶切位点序列互补，3 ´端在酶切 位点后增加1-3个选择性碱基，使得一定比例的酶切 片段被选择地扩增，PCR产物在变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳来分辨。
优点：多态性丰富。 缺点：引物需要标记。
5) CAPS标记
特异引物PCR与酶切相结合的一种标记。
根据RAPD标记或RFLP标记，设计特异引物进行PCR
扩增（SCAR，STS）。有时扩增片段大小无差异，此
时对扩增片段进行酶切，然后再通过琼脂糖或聚丙
烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。
揭示的是特异PCR产物DNA序列内限制性酶切位点变 异的信息。
例1、CTAB法小量制备植物DNA
以小麦为例： CTAB缓冲液： 1.4M 山梨醇 10ml 1M Tris_Cl PH8.0 22ml 0.5M EDTA PH8.0 4.4ml CTAB 0.8ml N-LSC 1g 加水至100ml (1)取少许小麦叶片,放入1.5ml离心管中,加入液氮冷 冻,用带尖的玻璃棒研碎。 (2)加入500ul,65℃预热的缓冲液混匀,65 ℃水浴保温 20分钟。 （3）加入500ul氯仿-异戊醇（24：1），混匀。
1）DNA提取
CTAB法 根据试剂不同分为 SDS法 大量制备 根据实验目的不同分为 小量制备
分子标记
生化标记
生化标记包括同工酶和等位酶标记。（以酶作为标记）
同工酶是指一个以上基因座位编码的酶的不同形式，而等位酶是指由一个基因座位的 不同等位基因编码的酶的不同分子形式。分析方法是电泳和组织化学染色法将酶的多 种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。
生化标记具两个方面的优点：一是表现近中性，对生物经济性状一
第三代分子标记技术
章丽
SNP
1.什么是SNP? 2.SNP的分类 3. SNP的检测方法
SNP: Single nucleotide polymorphism 个体间基因组DNA序列同一位置单 个核苷酸变异(替换、插入或缺失) 所引起的多态性。
2.SNP的分类
同义cSNP(synonymous cSNP) 基因编码区SNPs（cSNPs） SNP 基因周边SNPs（pSNPs） 非同义cSNP(non-synonymous cSNP) 基因间SNPs（iSNPs）
遗传多样性分析： 筛选出的13条引物共产生104条清晰条 带，其中多态性条带94条，多态百分率为 90.38% ，平均每个引物扩增条带数为8条。 结果显示，ISSR分子标记对攀枝花苏铁多 样性的研究效果很好。
最新的分子标记技术 1. RGAs 标记( Resistance Gene Analogs ,抗病基 因类似物) 2. 3. 4.
什么是遗传标记？
遗传标记genetic marker:指可追踪染色体、染 色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何 一种遗传特性。 它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性； 因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可 作为遗传标记。
遗传标记的类型
形态学标记（morphological marker）
分子标记的三个阶段
分子标记介绍
分⼦标记介绍分⼦标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋⽩质。
即DNA⽚段即能反映⽣物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA ⽚段；能受基因控制并且能够稳定遗传的，能代表个体或群体的遗传特征，并可被⽤作遗传分析的物质。
它能够直接反映基因组间DNA间的差异。
常⽤的分⼦标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、EST等。
RAPD、AFLP属于以PCR为基础的分⼦标记；RFLP属于以Southern为基础的分⼦标记；SSR、ISSR属于以重复序列为基础的分⼦标记；EST以mRNA为基础的分⼦标记。
1 主要的分⼦标记介绍1.1 限制性⽚段长度多态性（RFLP）RFLP是应⽤Southern杂交技术检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA⽚段的⼤⼩。
所以对于引起酶切位点变异的突变如点突变或部分DNA⽚段的缺失、插⼊、倒位⽽引起酶切位点缺失或获得等均可应⽤。
此⽅法的基本步骤包括：DNA的提取、⽤限制性内切酶酶切DNA、凝胶电泳分开DNA⽚段、把DNA⽚段转移到滤膜上、利⽤放射性标记的探针显⽰特定的DNA⽚段、分析结果。
探针⼀般选择单拷贝的。
其优点为共显性标记，稳定且可重复但耗时，昂贵且需应⽤同位素。
⽤该技术可作出植物的RFLP图谱，并应⽤于植物遗传和育种研究。
杨长红等采⽤PCR-RFLP技术，对库尔勒⾹梨等19个主要梨品种的cpDNA遗传多态性进⾏研究，其利⽤10对通⽤引物对总DNA进⾏扩增，并且采⽤7种限制性内切酶对PCR产物进⾏酶切，通过软件分析得出：7对引物（cp01、cp02、cp03、cp04、cp06、cp09、cp10）能在梨属植物上扩增出1条特异性谱带，cp09／MvaI，cp03／Hin6I的酶切位点有显著差异。
根据结果分析，库尔勒⾹梨与鸭梨、砀⼭梨、苹果梨、早酥、慈梨、⾦川雪梨、锦丰、新疆句句梨的平均距离系数较⼩，与其他梨的平均距离系数较⼤。
1.2 随机扩增多态性DNA(RAPD)RAPD是以8-10个碱基的随机寡聚核苷酸序列为引物，利⽤PCR技术⾮特异性扩增DNA⽚段，然后⽤凝胶电泳分开扩增⽚段，即得到⼀系列多态性DNA⽚段.染⾊后即可进⾏多态性分析。
分子标记
DNA分子标记 分子标记
是指能反映基因组某种变异特征的DNA片段。 片段。 是指能反映基因组某种变异特征的 片段
因为生物各种性状的差异主要是遗传物质DNA的差异造成， 的差异造成， 因为生物各种性状的差异主要是遗传物质 的差异造成 因而通过DNA分子标记可以直接检测基因组的遗传变异，它 分子标记可以直接检测基因组的遗传变异， 因而通过 分子标记可以直接检测基因组的遗传变异 更能准确揭示同一物种内不同种、变种、品种、品系间个体 更能准确揭示同一物种内不同种、变种、品种、 的差异。
分子标记是指能反映生物个体多态性的生物 大分子。 大分子。
广义的分子标记包括两类， 广义的分子标记包括两类，即：同工酶标记和 DNA标记，狭义的分子标记仅指 标记， 标记。 标记 狭义的分子标记仅指DNA标记。 标记
同工酶标记
编也有其内在的局限性。 同工酶标记也有其内在的局限性。由于翻译后的 修饰作用、组织特异性和发育阶段性， 修饰作用、组织特异性和发育阶段性，特别是相 对较少的多态性位点， 对较少的多态性位点，使其在应用上受到一定的 限制。 限制。
微卫星DNA（Microsatellite）又称简单 （ 微卫星 ） 重复序列（ 重复序列（Simplified Sequence Repeats） ）
SSR广泛分布于真核生物基因组中，是一种 广泛分布于真核生物基因组中，是一种1~6 广泛分布于真核生物基因组中 个碱基组成的长度为几十个核苷酸的简单重复 序列，在重复序列的两端， 序列，在重复序列的两端，往往是相对保守的 限制性内切酶位点。 限制性内切酶位点。 可根据其两端特异序列设计引物通过PCR反应， 反应， 可根据其两端特异序列设计引物通过 反应 检测简单重复序列重复单位书不同的DNA区域 检测简单重复序列重复单位书不同的 区域 的多肽性。 的多肽性。
分子标记
分子标记分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。
分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。
每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。
植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。
②不受环境影响。
因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。
③标记数量多,遍及整个基因组。
④多态性高,自然存在许多等位变异。
⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。
⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。
⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。
因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。
1. 1 第1 代分子标记1.1. 1 RFLP 标记技术。
1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术。
RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。
优点：RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于构建遗传连锁图。
缺点：在进行RFLP 分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。
第八章分子标记及其应用
第八章分子标记及其应用第八章分子标记及其应用1) 分子标记的种类与特点1. 遗传标记的种类与特点遗传标记：指可以稳定遗传的、易于识别的特殊遗传多态性形式。
Minisatellites：小卫星序列遗传标记的种类与特点1）形态标记：肉眼可见的特征性状，简单实用，但数目少，受发育阶段与环境影响。
2）细胞标记：染色体核型与带型，受环境影响小，稳定可靠，但耗时耗力，信息量不足。
3）生化标记：贮藏蛋白、同工酶等，信息量较大，取材方便，但不能反映基因组非编码区信息，仍受发育阶段与环境影响。
4）DNA分子标记：基因组DNA 水平的变异，理想的遗传标记。
2. DNA分子标记DNA分子标记：简称分子标记，指基因组DNA 水平上的任何差异，来自缺失、插入、置换、颠换、重复等，通常以分子杂交或凝胶电泳图谱的形式体现。
2.1 分子标记的优点1）数量多，遍及整个基因组，理论上检测位点近乎无限；2）稳定遗传，不受环境、发育阶段和是否表达等限制;3）多态性高，自然存在，无须专门创造；4）表现为“中性”，即不影响性状的表达；5）许多为共显性，能鉴别杂合与纯合，提供完整的遗传信息。
2.2 分子标记的类型分三大类:1) 基于核酸分子杂交: 第一代，1980s, RFLP（Restriction fragmentlength polymorphism ），限制性片段长度多态性2) 基于PCR或限制酶切+PCR: 第二代，1990s ,RAPD、AFLP、SSR、ISSR、 SCAR、STS等3) 基于DNA测序:第三代，近年来SNP和EST,反转录转座子等第三节分子标记的应用1. RFLP标记RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)：限制性片段长度多态性，1980，Botstein。
基本原理：不同基因组DNA经特定限制酶消化后产生大小不等的片段，再经电泳分离、Southern 印迹杂交和检测后，得到特异的RFLP 标记，它反映不同DNA对所用探针限制性酶切片段长度的多态性，实际是酶切位点的变化和分布情况。
《分子标记的应用》课件
通过检测犯罪现场遗留的生物样本中的分子标记，为犯罪调查提供 证据和线索。
遗传疾病研究
利用分子标记研究遗传性疾病的发病机制和家族遗传规律，为法医学 中的遗传疾病分析提供支持。
THANKS
分子标记技术的种类
01
限制性片段长度多态性（RFLP）
利用限制性内切酶切割基因组DNA，产生不同长度的片段，再通过电
泳和 Southern 杂交技术检测多态性。
02
微卫星标记
利用串联重复的DNA序列在不同个体间的变异来标记基因组，具有高
度多态性和遗传稳定性。
03
单核苷酸多态性（SNP）
检测单个核苷酸位点的变异，是最常见和应用最广泛的分子标记之一。
通过分子标记技术，可以鉴定 家禽品种间的遗传差异，为品
种选育提供依据。
分子标记还可以用于研究家禽 繁殖和生长等重要经济性状的 遗传基础，为育种提供理论支
持。
通过分子标记辅助选择，可以 快速准确地选择具有优良性状 的个体，提高家禽生产效益。
分子标记在兽医学中的应用
分子标记在兽医学中主要用于动物疾病诊断、抗病育种 和药物研发等方面。
利用分子标记技术快速筛选具有潜在活性的药物候选物，提高药 物研发效率。
药物靶点发现
通过研究分子标记与药物反应的关系，发现新的药物作用靶点， 为新药研发提供方向。
药物疗效评估
利用分子标记监测药物治疗过程中的生物标志物变化，评估药物 疗效和安全性。
分子标记在法医学中的应用
身份鉴定
利用DNA分子标记进行个体身份鉴定，在法医鉴定、亲子鉴定等领 域具有重要应用。
种群遗传多样性分析
分子标记可以揭示种群内的遗传变异，了解种群的遗传结构、变 异水平和进化历史。
分子标记
1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。
SCAR标记是在RAPD技术基础上发展起来的。SCAR标记是将目标 RAPD 片段进行克隆并对其末端测序，根据 RAPD 片段两端序列设计特异引物，对基因 DNA 片段再进行PCR特异扩增，把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。SCAR标记是共显性遗传，待检 DNA 间的差异可直接通过有无扩增产物来显示。SCAR标记方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。
① 随机扩增多态性DNA (Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD )
RAPD技术是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法。基本原理：它是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DAN片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。
分子标记
RFLP标记多态性的分子基础
Southern blotting
RFLP实验流程
移
自显影
RFLP 图谱
RFLP
显性标记 or
共显性标记
RFLP的应用：
1. 分类及遗传多样性研究
2. 遗传图谱的建立
遗传图谱(genetic map)指某一物种的染色体图谱(即连锁图谱)，
分子标记 Molecular Marker
遗传标记
遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。 1. 形态标记
形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、
穗形、粒色或芒毛等的相对差异。形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的 外观性状，如株高、穗形、粒色或芒毛等的相对差异。
2. 细胞学标记 细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。染色体的
第四类为基于单核苷酸多态性的DNA标记。如：SNP标记。它是由DNA序列中因单个碱 基的变异而引起的遗传多态性。目前SNP标记一般通过DNA芯片技术进行分析。
DNA标记多态性分子基础示意图
分子标记的类型
① 基于杂交的分子标记，如RFLP（Restriction
fragment length polymorphism,即限制性长度片
Southern杂交技术才能够检测到。可见，要进行RFLP分析首先要
分离单拷贝的基因组DNA克隆或cDNA克隆，才能进行多态性分 析。 RFLP标记具有共显性、信息完整、重复性和稳定性好等优点。 但RFLP技术的实验操作过程较复杂，需要对探针进行同位素标
记，即使应用非放射性的Southern杂交技术，仍然是个耗时费力
随机引物PCR产物多态性的分子基础
类型1为显性标记，是最常见的多态 性，类型2、3、4为共显性标记，但 较少见
分子标记技术
1.2DNA分子标记的定义及特征
• 定义：指能反映生物个体或种群间基 因组中某种差异特征的DNA片段，它 直接反映基因组DNA间的差异 • 特征：不受环境和其他因素的影响； 多态性几乎遍布整个基因组；不受基 因表达与否的影响，具有数量丰富、 多态性强及操作简单等特点
• 基于单核苷酸多态性的DNA分子标记 • SNPs（Simple Nucleotide Polymorphisms,单核 苷酸多态性） • 同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几 个核苷酸的差异，从分子水平上单个核苷酸的差 异进行检测具有重要意义 • 检测SNPs方法a.随机扩增DNA（RAPD）法 b.DNA芯片（DNA-chip）检测法
3.3 遗传连锁图谱的构建
• 连锁图谱（linkage map），又称遗传图谱（ genetic map ） 或 遗 传 连 锁 图 谱 （ genetic linkage map），是指基因或DNA分子标记在 染色体上的相对位置 • 绘制遗传连锁图的方法有很多，但是 DNA多 态性技术未开发时，鉴定的连锁图很少，随 着 DNA 多态性的开发，使得可利用的遗传标 志数目迅速扩增
• AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism,扩增片段长度多态性） • AFLP基本原理：对DNA限制性酶切片段进 行选择性扩增 • AFLP指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传 • AFLP兼具RAPD与RFLP优点，有较高的稳 定性
对PCR扩增片段的限制性酶切来 揭示扩增区段的多态性——CAPS
分子标记技术知识讲解
苷酸多态性） • 同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几
个核苷酸的差异，从分子水平上单个核苷酸的差 异进行检测具有重要意义 • 检测SNPs方法a.随机扩增DNA（RAPD）法
的需要量大，在很大程度上限制了该 技术的应用
2.2 第二代分子标记技术
随机引物PCLeabharlann 标记• RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，DNA随机扩增多态性）
• RAPD具有技术简单、检测迅速、灵敏度 高、特异性强、检测容易、DNA样品用量 少的优点，但RAPD为显性遗传，侧你在 共迁移问题，并且重复性较差
1.1分子遗传标记
• 从广义上，是指可遗传并可检测的 DNA序列或蛋白质
• 从狭义上，是指DNA标记，这个界现 在别广泛采纳
• 具有分辨率好和信息量大等优势的分 子遗传标记目前已广泛应用于生物基 因组研究以及生物遗传育种、进化起 源、分类等诸多方面。
1.2DNA分子标记的定义及特征
• 定义：指能反映生物个体或种群间基 因组中某种差异特征的DNA片段，它 直接反映基因组DNA间的差异
• ISSR在引物设计上比SSR简单，无需知道 DNA序列就可用引物扩增，还比RFLP、 RAPD、SSR提供的遗传信息更多，但多 数情况下，不能区别一个位点扩增的DNA 片段
特异引物PCR标记
• SSR（Simple Sequence Repeats,简 单重复序列）
• SSR基本原理：根据微卫星序列两端 互补序列设计引物，通过PCR反应扩 增微卫星片段，由于核心序列串联重 复数目不同，因而能够用PCR的方法 扩增出不同长度的PCR产物，将扩增 产物进行凝胶电泳，根据分离片段的 大小决定基因型并计算等位基因频率
分子标记技术
CAPACITY
RFLPs
HiSpeed sequ
DArT SNPs Multi-SSRs SRAP, TRAP SSRsAFLPs RAPDs
1985
1990
1995
2000
2 分子标记来源于DNA水平的突变
突变(Mutation)是指DNA水平的可遗传的变异，不
管这种DNA变异能不能导致可检测的表型或生化改 变，突变产生的变异是自然选择的基础，可遗传 的突变在群体中扩散从而产生多态性。
7. 近10年来，在人类基因组研究计划的 推动下，分子标记的研究与应用得到迅 速的发展。
分子标记的历史
第一代分子标记技术
RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性）
第二代分子标记技术
RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，
RFLP
原理：
DNA
限制性内切酶酶切
电泳
转移到硝酸纤维素滤膜
同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交
胶片放射自显影，显示酶切片段大小
RFLP的应用
1.遗传学图的构建 结合RFLP连锁图， 任何能用RFLP探针检测出的基因及其 DNA片段都可以通过回交，快速有效地 进行转移。
2.基因定位 利用RFLP技术能够准确地 标记定位种质中的目标基因，结合杂交， 回交及组织培养等技术就可以快速有效的 将所需目标基因的DNA片段引入栽培品 种中，实现品种改良。
都有害； ✓ 探针的制备、保存和发放也很不方便； ✓ 分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。
2.随意扩增多态性DNA标记—RAPD
Random Amplified Polymorphismic DNA
分子标记名词解释
分子标记名词解释
分子标记 ( Molecular Marker) 是指用于遗传分析、基因组学研究、生物信息学等方面的一类技术工具。
它可以是 DNA、RNA、蛋白质等分子，也可以是其他生物分子，如多糖、脂类等。
分子标记既可以是标记基因 (marker gene),也可以是其他非编码 RNA(ncRNA) 或蛋白质。
分子标记技术广泛应用于遗传多样性分析、基因组学研究、生物信息学等领域。
其中，遗传多样性分析包括遗传图谱构建、单核苷酸多态性 (SNP) 分析、微卫星标记分析等;基因组学研究包括基因组组装、基因组注释、基因组比对等;生物信息学则利用分子标记进行基因预测、蛋白质结构预测、基因表达分析等。
常见的分子标记技术包括：基因测序、分子标记辅助选择、基因组芯片、蛋白质组芯片、生物信息学分析等。
其中，基因测序是目前分子标记技术中最前沿、最常用的技术之一。
它可以通过测序获取基因组序列信息，为基因组学研究和生物信息学分析提供更多的信息资源。
几种分子标记技术
SNP标记技术的应用实例
疾病关联研究
SNP标记技术广泛应用于疾病关联研究，通过检测SNP位 点，可以揭示疾病的遗传机制，为疾病的预防、诊断和治 疗提供依据。
药物研发
SNP标记技术可以用于药物研发，通过检测SNP位点，可 以预测个体对药物的反应差异，为个体化用药提供依据。
生物进化研究
SNP标记技术也可以用于生物进化研究，通过检测不同物 种或种群的SNP位点，可以揭示物种的遗传差异和进化关 系。
分子标记技术的应用领域
01
02
03
04
遗传育种
用于标记和选择具有优良性状 的基因，提高育种效率和品质
。
生物分类
用于区分不同物种、亚种和种 群，研究生物多样性和进化关
系。
疾病诊断
用于检测和诊断遗传性疾病、 癌症和其他重大疾病，为个性
化治疗提供依据。
药物研发
用于筛选和鉴定具有药效的分 子靶点，加速新药研发进程。
几种分子标记技术
contents
目录
• 简介 • RFLP标记技术 • AFLP标记技术 • SSR定义
01
分子标记技术是指利用生物分子 的特征来标记和识别生物体的技 术。
02
它通过检测生物体内特定基因或 蛋白质的表达水平，来反映生物 体的遗传特征、生理状态和环境 适应能力。
RFLP标记技术的优缺点
优点
RFLP标记技术具有高特异性、高稳定 性，是早期应用广泛的分子标记技术。
缺点
RFLP标记技术操作繁琐、成本较高， 且检测时间长，限制了其在实际应用 中的推广。
RFLP标记技术的应用实例
植物遗传育种
RFLP标记技术广泛应用于植物遗传 育种领域，用于鉴定品种纯度、遗传 多样性分析以及基因定位等。
分子标记
遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生DNA 片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位 点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加、缺少或 发生分子量变化。增加或缺少的PCR产物则为RAPD标记。
1990, Williams, et al. found.
4
RAPD
Williams等1990年创立。 RAPD 标记技术就是用一个（有时用两个）随 机引物（一般8-10个碱基）非定点地扩增基因 组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。遗传 材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发 生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就有可能 导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导 致PCR产物增加、缺少或发生分子量变化。若 PCR产物增加或缺少，则产生RAPD标记。
1974, Grodzicker, et al. found.
基本步骤
DNA提取 DNA限制性内切酶消化 凝胶电泳分离限制性片段 将这些片段按原来的顺序和 位臵转移到易操作的滤膜上
用放射性同位素或非放射性 物质标记的DNA作探针与膜 上的DNA杂交（Southern blot）
放射性自显影或酶学检测 显示出不同材料对该探针 的限制性酶切片段多态性
SF - seminal fluid DNA; MB - Matina Brunswick's DNA; S1 - DNA from suspect one; S2 - DNA from suspect two; FD - DNA from Fiona Dandenong as a control. a. Sean Upfield b. Suspect 1 c. Suspect 2 d. Fiona Dandenong e. Matina Brunswick
分子标记技术
应非定点地扩增DNA片段；
2.扩增片段经琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳分
离；
3.溴化乙锭染色或银染等专一性染色技术即可记录
RAPD 指纹；
4.进行DNA 多态性分析。
RAPD技术流程：
RAPD分子标记的应用
RAPD技术已在苜蓿，豆类，番茄，辽东 栎，蔗糖，丁香，葡萄，番木瓜，棉花， 月季，牡丹，锦鸡儿，野大豆，桉树，玉 米，水稻等多种植物中广泛应用。
RFLP 的多态性程度偏低；
分子杂交时会用到放射性同位素，对人体和环境
都有害；
探针的制备、保存和发放也很不方便； 分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。
2.随意扩增多态性DNA标记—RAPD
Random Amplified Polymorphismic DNA 概念：RAPD技术建立于PCR技术的基础 之上，它是利用一系列不同的随机排列碱 基顺序的寡聚核苷酸单链为引物，对所研 究的基因组DNA进行PCR扩增，这些引 物在一定的退火条件下，
以单个核甘酸的变异为核心的分子标记技术
单核苷酸多态性标记(SNP)
以特定序列为核心的分子标记技术
线粒体DNA分子标记(mtDNA)
三. 几种分子标记介绍
1.限制性片段长度多态性标记 Restriction Fragment Length Polymorphism
RFLP：限制性片段长度多态性，为第一代 多态性记。 原理：限制性内切酶能识别并切割基因组DNA分
第一代分子标记技术 RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性） 第二代分子标记技术 RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA， 随机扩增多态性DNA ） AFLP （Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片断长度多态性） 事实上，还有很多分子标记技术像SSR、ISSR、SRAP （相关序列扩增多态性）另外，还有现在号称为第三代 分子标记的SNP（ 单核苷酸多态性)
分子标记
分子标记概念广义分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。
狭义分子标记概念只是指DNA标记能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异代数类型概念原理优点缺点主要应用第一代RFLP 限制性片段长度多态性限制性内切酶能识别并切割基因组DNA分子中特定的位点，如果因碱基的突变、插入或缺失，或者染色体结构的变化而导致生物个体或种群间该酶切位点的消失或新的酶切位点的产生，那么利用特定的限制性内切酶切割不同个体的基因组DNA，就可以得到长短、数量、种类不同的限制性DNA片段，通过电泳和Southern杂交转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上,选用一定的DNA标记探针与之杂交，放射自显影后就可得到反映个体特异性的DNA限制性片段多态性图谱。
1.标记广泛存在于生物体内，不受组织、环境和发育阶段的影响。
2.RFLP 标记的等位基因是共显性的，不受杂交的影响，可区分纯合基因与杂合基因。
3.可产生的标记数目很多，可覆盖整个基因组。
1.标记技术需要酶切, 对DNA 质量要求高；RFLP 的多态性程度偏低。
2.分子杂交时会用到放射性同位素，对人体和环境都有害。
3.探针的制备、保存和发放也很不方便。
4.分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。
1.遗传学图的构建结合RFLP连锁图，任何能用RFLP探针检测出的基因及其DNA片段都可以通过回交，快速有效地进行转移。
2.基因定位利用RFLP技术能够准确地标记定位种质中的目标基因，结合杂交，回交及组织培养等技术就可以快速有效的将所需目标基因的DNA片段引入栽培品种中，实现品种改良。
3.遗传多态性分析运用RFLP技术可以尽可能多地保存那些在已知位点上有异态的品系，以求最大程度地保持品种的多样性。
细胞质遗传研究RFLP技术是对DNA序列自然变异的直接检测，只需选择适当的限制性内切酶或DNA探针作分子标记，因而对植物不同种属或杂种后的细胞质遗传变异及基因型的鉴定具有较高的灵活性和灵敏性，从而能较好地应用于细胞质遗传的研究。
分子标记
分子标记的概念有广义和狭义之分。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。
狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。
基本简介细胞标记（cytological markers）主要是染色体核型（染色体鼠数目、大小、随体、着丝点位置等)和带型(C带、N带、G带等)，这类标记的缺点是数目有限。
目前，还未发现用其进行小麦抗叶锈基因的标记。
生化标记(biochemical markers)主要包括同工酶和储藏蛋白。
生化标记具有经济方便的优点，但其标记数有限。
DAVlD【6】等曾利用生化标记内肽酶同工酶EP-Dld作为遗传标记对以Thatcher为背景的小麦抗叶锈病近等基因系进行连锁分析，发现EP-Dld与Lr19紧密连锁，重组值为(0.01士0.09)个作图单位。
WINZELER【7】等利用含Lr19的小麦抗叶锈病近等基因系，发现生化标记内肽酶同工酶EP-Dl的无效等位基因EP-Dlc可以作为与Lr19紧密连锁的生化标记，遗传距离为(0.33士0.33)cM。
分子标记与形态标记、细胞标记、生化标记相比较，有以下几方面的优点:①在植物体的多个组织及生育阶段均可检测到，不受时空限制。
②数量多，遍及整个基因组。
③有许多标记表现为共显性，能够鉴别基因型纯合与否，提供完整的基因型。
在标记小麦抗叶锈病基因方面，分子标记可以在更深层次上揭示小麦抗锈遗传机制。
通过找到与抗锈基因紧密连锁的分子标记，不但能在遗传背景不同的育种材料中特异性的检测目的基因，而且可以在任一生育阶段同时对多个抗性基因进行筛选，这为了解抗源和抗病品种中所含有的抗性基因提供了更为迅速、稳定、可靠的方法。
理想要求折叠理想的分子标记必须达以下几个要求：⑴具有高的多态性；⑵共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；⑶能明确辨别等位基因；⑷遍布整个基因组；⑸除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；⑹选择中性（即无基因多效性）；⑺检测手段简单、快速（如实验程序易自动化）；⑻开发成本和使用成本尽量低廉；⑼在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换）。
分子标记方法
分子标记方法分子标记方法可以分为DNA标记和蛋白质标记两大类。
DNA标记包括核酸杂交、PCR（聚合酶链式反应）等；蛋白质标记包括Western blot、质谱分析等。
本文将主要介绍DNA标记的方法。
DNA标记是利用特定的标记物或探针来特异性地检测DNA序列的技术。
分子标记的方法有许多种，常见的DNA标记方法包括Southern blot、北方印迹、Southern杂交、PCR、原位杂交等。
Southern blot是通过将DNA样品电泳后转移到薄膜上，然后使用探针来特异性地探测感兴趣的DNA序列。
这种方法可以检测DNA序列的拷贝数、大小和杂交等信息，广泛应用于基因组学和遗传学研究中。
其主要步骤包括DNA电泳、转膜、杂交等。
北方印迹是一种检测RNA的方法，其原理与Southern blot相似，只是探针是用于RNA的。
它可以检测基因的表达水平和RNA的大小等信息，被广泛用于研究基因的表达调控。
PCR是一种利用DNA聚合酶扩增特定DNA序列的方法，是一种快速、敏感的DNA标记方法。
它可以从少量DNA样品中扩增特定序列，广泛应用于基因克隆、DNA序列检测等领域。
原位杂交是一种在细胞或组织中检测特定DNA序列的方法，其原理是使用标记的DNA或RNA探针与待检测的细胞或组织中的目标DNA序列特异性结合，然后用显色或荧光方法来检测结合情况。
这种方法可以用于检测基因的定位、表达模式等，广泛应用于发育生物学、遗传学等领域。
除了上述常见的DNA标记方法外，还有一些新的分子标记方法不断涌现。
例如，基于高通量测序技术的NGS分子标记方法、基因编辑技术的CRISPR-Cas分子标记方法等，都为生物学和医学研究提供了更多的选择。
总之，分子标记方法是现代生物学和医学研究中不可或缺的重要技术手段。
随着生物技术的不断发展，分子标记方法也在不断创新和完善，为科学研究和医学诊断提供了更多的可能性。
希望本文的介绍对您有所帮助，谢谢阅读！。
分子标记名词解释
分子标记名词解释
分子标记是一种在化学反应中使用的术语，用于标记特定的分子或原子。
它通常是一个唯一的名称或符号，用于区分不同的分子或原子。
分子标记可以是化学式、结构式、系统命名或其他特定的标记方式。
在化学反应中，分子标记被用于描述反应物、生成物以及反应中的中间体。
通过使用分子标记，化学家可以准确地描述反应的发生和反应物的转化。
分子标记也可以用于分子的追踪或标记，以便在实验或研究中进行跟踪或定位。
分子标记在化学和生物化学研究中起着重要的作用。
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分子标记3分（内容丰富）编辑词条分子标记技术在搜搜百科中为本词条的同义词，已为您做自动跳转。
摘要Molecular Markers【分子标记的概念】分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。
与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。
随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。
分子标记的概念有广义和狭义之分。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。
狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。
理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。
但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。
【分子标记的种类】一、基于分子杂交技术的分子标记技术此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物 DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。
①限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。
RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。
通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。
它所代表的是基因组DNA 在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。
由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。
RFLP的等位基因其有共显性特点。
RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个。
RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。
自RFLP问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。
②数目可变串联重复多态性(Variable Number of Tandem Repeats，VNTR )数目可变串联重复序列又称小卫星DNA (Minisatellite DNA)，是一种重复DNA小序列，为10到几百核苷酸，拷贝数10一10001不等。
VNTR基本原理与RFLP大致相同，只是对限制性内切酶和DNA探针有特殊要求：(1)限制性内切酶的酶切位点必须不在重复序列中，以保证小卫星或微卫星序列的完整性。
(2)内切酶在基因组的其他部位有较多酶切位点，则可使卫星序列所在片段含有较少无关序列，通过电泳可充分显示不同长度重复序列片段的多态性。
(3)分子杂交所用DNA探针核昔酸序列必须是小卫星序列或微卫星序列，通过分子杂交和放射自显影后，就可一次性检测到众多小卫星或微卫星位点，得到个体特异性的DNA指纹图谱。
小卫星标记的多态信息含量较高，在17一19之间。
缺点是数量有限，而且在基因组上分布不均匀，这就极大限制其在基因定位中的应用。
VNTR也存在实验操作繁琐、检测时间长、成本高的缺点。
二、基于PCR技术的分子标记技术（一）、随机引物的PCR标记所用引物的核苷酸序列是随机的，其扩增的 DNA 区域事先未知。
随机引物PCR扩增的 DNA 区段产生多态性的分子基础是模板 DNA 扩增区段上引物结合位点的碱基序列的突变，不同来源的基因组在该区段上表现为扩增产物有无差异或扩增片段大小的差异。
随机引物PCR标记表现为显性或共显性。
①随机扩增多态性DNA (Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD )RAPD技术是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA 多态性的方法。
基本原理：它是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。
扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。
RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DAN片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。
就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。
与RFLP相比，RAPD具有以下优点：(1)技术简单，检测速度快；(2) RAPD 分析只需少量DNA样品；(3)不依赖于种属特异性和基因组结构，一套引物可用于不同生物基因组分析；(4)成本较低。
但RAPD也存在一些缺点：(1) RAPD标记是一个显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子；(2)存在共迁移问题，凝胶电泳只能分开不同长度DNA片段，而不能分开那些分子量相同但碱基序列组成不同的DNA片段；(3) RAPD技术中影响因素很多，所以实验的稳定性和重复性差。
②任意引物PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction，AP—PCR)在AP—PCR分析中，所使用的引物较长(10－50 bp) ， PCR反应分为两个阶段，首先寡核昔酸引物在低严谨条件下与模板DNA退火，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用。
然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增。
采用变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分析PCR产物，最终反应结果与RAPD类似。
只要设计的引物在低严谨退火条件下能减少引物产生人为产物，应用成对组合的引物可以产生新的AP—PC R谱带，但引物配对组合使用时，得到的图谱与单引物单独使用时产生的图谱之和很不相同，这样，50个引物能产生1250种不同指纹图谱。
AP—PCR方法不需预知序列资料，而且检测的基因组样本是任意的，还能够用于检测近等基因系(或同类系)中的多态性。
AP—PCR的缺点是每个新的多态性都必须经纯化才能进一步使用。
另外，此方法在杂合体中仅可辨别长度多态性。
③DNA扩增指纹印迹(DNA Amplification Fingerprinting，DAF)DAF是一种改进的RAPD分析技术，与RAPD技术不同的是，DAF分析中所使用的引物浓度更高，长度更短(一般为5一8 bp)，因此它所提供的谱带信息比RAPD大得多，如当使用5个核昔酸的引物时，引物和模板的组合大约可扩增出10一100个DNA片段。
PCR扩增产物是在凝胶上进行分离，通过银染即可产生非常复杂带型。
（二）、特异引物的PCR标记特异引物的PCR标记所用引物是针对已知序列的 DNA 区段而设计的，具有特定核苷酸序列（通常为 18—24 bp），可在常规PCR复性温度下进行扩增，对基因组 DNA 的特定区域进行多态性分析。
①序列标志位点(Sequence Tagged Sites，STS)STS是对以特定对引物序进行PCR特异扩增的一类分子标记的统称。
通过设计特定的引物，使其与基因组DNA序列中特定结合位点结合，从而可用来扩增基因组中特定区域，分析其多态性。
利用特异PCR技术的最大优点是它产生信息非常可靠，而不像RFLP和RAPD那样存在某种模糊性。
②简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1一6 bp，其中最常见是双核昔酸重复，即(CA) n和(TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10一60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。
SSR 标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。
SSR具有以下一些优点：(l)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。
显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。
如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。
③序列特异性扩增区(Sequence—characterized Amplified Region，SCAR)SCAR标记是在RAPD技术基础上发展起来的。
SCAR标记是将目标 RAPD 片段进行克隆并对其末端测序，根据 RAPD 片段两端序列设计特异引物，对基因 DNA 片段再进行PCR特异扩增，把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。
SCAR 标记是共显性遗传，待检 DNA 间的差异可直接通过有无扩增产物来显示。
SCAR 标记方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。
④单引物扩增反应(Single Primer Amplificatipn Reawtion，SPAR)SPAR技术是与RAPD技术相似的一种标记技术，SPAR也只用一个引物，但所用的引物是在SSR的基础上设计的。
这些引物能与SSR之间的间隔序列进行特异性结合，然后通过P(：R技术扩增SSR之间的DNA序列，凝胶电泳分离扩增产物，分析其多态性。
另外，还有一种与SPAR技术非常相似的标记技术，即ISTR ( Inverse Sequence—tagged Repeat)技术，ISTR所用的引物是在反向重复序列基础上设计的，PCR扩增的是反向重复序列之间的DIVA序列。