分子标记

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。

分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。

理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。

【分子标记的种类】

一、基于分子杂交技术的分子标记技术　

此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物 DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。　

①　限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)　

1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片

段长度的差异。

RFLP的等位基因其有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。自RFLP问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。

②　数目可变串联重复多态性(Variable Number of Tandem Repeats，VNTR )　

数目可变串联重复序列又称小卫星DNA (Minisatellite DNA)，是一种重复DNA小序列，为10到几百核苷酸，拷贝数10一10001不等。VNTR基本原理与RFLP大致相同，只是对限制性内切酶和DNA探针有特殊要求：(1)限制性内切酶的酶切位点必须不在重复序列中，以保证小卫星或微卫星序列的完整性。(2)内切酶在基因组的其他部位有较多酶切位点，则可使卫星序列所在片段含有较少无关序列，通过电泳可充分显示不同长度重复序列片段的多态性。(3)分子杂交所用DNA探针核昔酸序列必须是小卫星序列或微卫星序列，通过分子杂交和放射自显影后，就可一次性检测到众多小卫星或微卫星位点，得到个体特异性的DNA指纹图谱。

小卫星标记的多态信息含量较高，在17一19之间。缺点是数量有限，而且在基因组上分布不均匀，这就极大限制其在基因定位中的应用。VNTR也存在实验操作繁琐、检测时间长、成本高的缺点。　

二、基于PCR技术的分子标记技术

（一）、随机引物的PCR标记

所用引物的核苷酸序列是随机的，其扩增的 DNA 区域事先未知。随机引物PCR扩增的 DNA 区段产生多态性的分子基础是模板 DNA 扩增区段上引物结合位点的碱基序列的突变，不同来源的基因组在该区段上表现为扩增产物有无差异或扩增片段大小的差异。随机引物PCR标记表现为显性或共显性。

①　随机扩增多态性DNA (Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD )

RAPD技术是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法。基本原理：它是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DAN片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用

一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。

与RFLP相比，RAPD具有以下优点：(1)技术简单，检测速度快；(2) RAPD分析只需少量DNA样品；(3)不依赖于种属特异性和基因组结构，一套引物可用于不同生物基因组分析；(4)成本较低。但RAPD也存在一些缺点：(1) RAPD标记是一个显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子；(2)存在共迁移问题，凝胶电泳只能分开不同长度DNA片段，而不能分开那些分子量相同但碱基序列组成不同的DNA片段；(3) RAPD技术中影响因素很多，所以实验的稳定性和重复性差。

②　任意引物PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction， AP—PCR)　

在AP—PCR分析中，所使用的引物较长(10－50 bp) ， PCR反应分为两个阶段，首先寡核昔酸引物在低严谨条件下与模板DNA退火，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用。然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增。采用变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分析PCR产物，最终反应结果与RAPD类似。只要设计的引物在低严谨退火条件下能减少引物产生人为产物，应用成对组合的引物可以产生新的AP—PC R谱带，但引物配对组合使用时，得到的图谱与单引物单独使用时产生的图谱之和很不相同，这样，50个引物能产生1250种不同指纹图谱。


AP—PCR方法不需预知序列资料，而且检测的基因组样本是任意的，还能够用于检测近等基因系(或同类系)中的多态性。AP—PCR的缺点是每个新的多态性都必须经纯化才能进一步使用。另外，此方法在杂合体中仅可辨别长度多态性。


DNA扩增指纹印迹(DNA Amplification Fingerprinting，DAF)

DAF是一种改进的RAPD分析技术，与RAPD技术不同的是，DAF分析中所使用的引物浓度更高，长度更短(一般为5一8 bp)，因此它所提供的谱带信息比RAPD大得多，如当使用5个核昔酸的引物时，引物和模板的组合大约可扩增出10一100个DNA片段。PCR扩增产物是在凝胶上进行分离，通过银染即可产生非常复杂带型。

（二）、特异引物的PCR标记　

特异引物的PCR标记所用引物是针对已知序列的 DNA 区段而设计的，具有特定核苷酸序列（通常为 18—24 bp），可在常规PCR复性温度下进行扩增，对基因组 DNA 的特定区域进行多态性分析。　

①　序列标志位点(Sequence Tagged Sites，STS)

STS是对以特定对引物序进行PCR特异扩增的一类分子标记的统称。通过设计特定的引物，使其与基因组DNA序列中特定结合位点结合

，从而可用来扩增基因组中特定区域，分析其多态性。利用特异PCR技术的最大优点是它产生信息非常可靠，而不像RFLP和RAPD那样存在某种模糊性。

②　简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)

简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1一6 bp，其中最常见是双核昔酸重复，即(CA) n和(TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10一60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。

SSR具有以下一些优点：(l)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。

③　序列特异性扩增区(Sequence—characterized Amplified Region，SCAR)　

SCAR标记是在RAPD技术基础上发展起来的。SCAR标记是将目标 RAPD 片段进行克隆并对其末端测序，根据 RAPD 片段两端序列设计特异引物，对基因 DNA 片段再进行PCR特异扩增，把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。SCAR标记是共显性遗传，待检 DNA 间的差异可直接通过有无扩增产物来显示。SCAR标记方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。　

④　单引物扩增反应(Single Primer Amplificatipn Reawtion，SPAR)

SPAR技术是与RAPD技术相似的一种标记技术，SPAR也只用一个引物，但所用的引物是在SSR的基础上设计的。这些引物能与SSR之间的间隔序列进行特异性结合，然后通过P(：R技术扩增SSR之间的DNA序列，凝胶电泳分离扩增产物，分析其多态性。另外，还有一种与SPAR技术非常相似的标记技术，即ISTR ( Inverse Sequence—tagged Repeat)技术，ISTR所用的引物是在反向重复序列基础上设计的，PCR扩增的是反向重复序列之间的DIVA序列。

⑤　DNA单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)

SSCP是指等长的单链DNA因核昔酸序列的差异而产生构象变异，在非变性聚丙烯酞胺中的表现为电泳迁移率的差别。单链DNA构象分析对DNA序列的改变非常敏感，常常一个碱基差别都能显示出来。在SSCP分析中，利用PCR技术定点扩增基因组DNA中某一目的片段，将扩增产物进行变性处理，双链DNA分开成单链，再用非变性

聚丙烯酞胺凝胶电泳分离，根据条带位置变化来判断目的片段中是否存在突变。SSCP结果判定是通过多个样品之间对比，观察条带之间位置改变，从而显示出不同生物个体的DNA特异性，达到指纹分析目的。为了进一步提高SSCP的检出率，可将SSCP分析与其它突变检测方法相结合。其中与杂交双链分析(Heterocluplex analysis，Het)法结合可以大大提高检出率。Het法是用探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互补的杂交链在非变性PAG凝胶上通过电泳被分离开。对同一靶序列分别进行SSCP和Het分析可以使点突变的检出率接近100%，而且实验简便。

⑥　双脱氧化指纹法(Dideoxy Fingerprints，ddF )

ddF是将双脱氧末端终止测序法与SSCP结合起来的分析技术，对由双脱氧末端终止的长短不一的单链DNA进行SSCP分析。如果目的片段存在一个突变，则所有大于某一大小对应于突主变位置的双脱氧终止片段无野生型系统，对于每一个突有多次机会检测其迁移率改变，提高了检测突变的效率。ddF方法克服了SSCP分析时因DNA长度影响SSCP显示的困难，通过一种双脱氧核昔酸生产特异性的单链DNA，使其中长度合适的DNA片段显示SSCP改变。

三、基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记　

①　扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP )　

AFLP是1993年荷兰科学家Zbaeau和Vos发展起来的一种检测DN A多态性的新方法。AFLP 是 RFLP 与PCR相结合的产物，其基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组 DNA 产生不同大小的 DNA 片段，再使双链人工接头的酶切片段相边接，作为扩增反应的模板 DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加 1—3个选择性核苷酸作引物对模板 DNA 基因再进行选择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。引物由三部分组成：与人工接头互补的核心碱基序列、限制性内切酶识别序列、引物3’端的选择碱基序列（1—10 bp）。接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列为结合位点。该技术的独特之处在于所用的专用引物可在知道 DNA 信息的前提下就可对酶切片段进行PCR 扩增。为使酶切浓度大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一个酶为多切点，另一个酶切点数较少，因而 AFLP 分析产生的主要是由两个酶共同酶切的片段。AFLP 结合了 RFLP 和 RAPD两种技术的优点，具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。但它的技术费用昂贵，对 DNA 的纯度和内切酶的质量要求很高。尽管 AFLP 技术诞生时间较短，但可称之

为分子标记技术的又一次重大突破，被认为是目前一种十分理想、有效的分子标记。　

②　酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplified Polymorphism Sequences，CAPS )　

CAPS技术又称为PCR—RFLP，它实质上是PCR技术与RFLP技术结合的一种方法。CAPS的基本原理是利用己知位点的DNA序列资源设计出一套特异性的PCR引物(19—27bp），然后用这些引物扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并进行RFLP分析。GAPS标记揭示的是特异PGR片段的限制性长度变异的信息。CAPS是一类共显性分子标记，其优点是避免了RFLP分析中膜转印这一步骤，又能保持RFLP分析的精确度。另外，由于很多限制性内切酶均可与扩增DNA酶切，所以检测到多态性机会较大。

四、基于DNA芯片技术的分子标记技术　

核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)

SNP标记是美国学者Lander E于1996年提出的第三代DNA遗传标记。SNP是指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异。人类基因组大约每 1000 bp SNP 出现一次，已有2000多个标记定位于人类染色体，对人类基因组学研究具有重要意义。检测 SNP 的最佳方法是 DNA 芯片技术。SNP 被称为第三代 DNA 分子标记技术，随着 DNA 芯片技术的发展，其有望成为最重要最有效的分子标记技。　
1 RFLP

该技术由Grodzicker等于1974年创立。特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段，或称限制性等位片段。RFLP标记技术的基本原理就是通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP。该技术包括以下基本步骤：DNA提取；用DNA限制性内切酶消化；凝胶电泳分离限制性片段；将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜上；用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上的DNA杂交（称 Southern杂交）；放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性。

RFLP标记的主要特点有：（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规

模的育种实践中。

2 RAPD

由Williams等于1990年创立。其基本原理与PCR技术一致。

PCR技术是一种体外快速扩增特异基因或DNA序列的方法，由Mullis等于1985年首创。该技术在试管中建立反应体系，经数小时后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数百万倍。其原理与细胞内发生的DNA复制过程相类似，首先是双链DNA分子在邻近沸点的温度下加热时便分离成两条单链DNA分子，然后DNA聚合酶以单链DNA为模板，并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新生的DNA互补链，以上过程为一个循环，每一个循环的产物可以作为下一个循环的模板，经过20-30个循环后，介于两个引物间的特异DNA片段以几何数得以大量复制。

RAPD标记技术就是用一个（有时用两个）随机引物（一般8-10个碱基）非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加、缺少或发生分子量变化。若PCR产物增加或缺少，则产生RAPD标记。

RAPD标记的主要特点有：（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。

3 AFLP

Zabeau和Vos于1993年发明。AFLP标记是选择性扩增基因组DNA酶切片段所产生的扩增产物的多态性，其实质也是显示限制性内切酶酶切片段的长度多态性，只不过这种多态性是以扩增片段的长度不同被检测出来。该技术结合了RFLP的稳定性和PCR技术的简便高效性，同时又能克服RFLP带型少、信息量小以及RAPD技术不稳定的缺点。其基本技术原理和操作步骤如下：首先用限制性内切酶酶解基因组DNA，形成许多大小不等的随机限制性片段；接着在这些片段的两端连接上特定的寡聚核苷酸接头（Oligo nuleotide adapter）；然后根据接头序列设计引物，由于限制性片段太多，全部扩增则产物难以在胶上分开，为此在引物的3’端加入1-3个选择性碱基，这样只有那些能与选择性碱基配对的片段才能与引物结合，成为模板被扩增，从而达到对限制性片段进行选择扩增的目的；最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将这些特异性的扩增产物分离开来。

AFLP标记的主要特点有：（1）由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的；（2）典型的AFLP分析

，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；（3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；（4）分辩率高，结果可靠；（5）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。

4 SSR（SSLP）

由Moore等于1991年创立。SSR即微卫星DNA，是一类由几个（多为1-5个）碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重复。不同遗传材料重复次数的可变性，导致了SSR长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础。尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性，即SSR标记。

SSR标记的主要特点有：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。

5 STS

由Olson于1989年开发成功。STS是指基因组中长度为200-500bp，且核苷酸顺序已知的单拷贝序列，通过PCR可将其专一扩增出来。其基本原理是，依据单拷贝的RFLP探针、微卫星序列、Alu因子等两端序列，设计合适的引物，进行PCR扩增，电泳显示扩增产物多态性。有时扩增产物还需要特定的限制性内切酶酶解后才能表现出多态性。目前用于STS引物设计的主要是RFLP探针。

STS标记的主要特点有：（1）标记来源广，数量多；（2）共显性遗传，可区分纯合子和杂合子；（3）技术简便，检测方便；（4）与SSR标记一样，开发依赖于序列分析及引物合成，成本较高；（5）多态性常常低于相应的RFLP标记，这是因为STS仅仅检测该引物所分布区域的片段差异或酶切位置差异，而RFLP标记的多态性往往可能是探针以外区域的差异，这一部分差异无法转化成STS标记的多态性。

6 染色体原位杂交

染色体原位杂交技术是DNA探针与染色体上的DNA杂交，并在染色体上直接进行检测的分子标记技术。目前发展最快的是荧光素标记的原位DNA杂交技术，即荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, 简称FISH技术），是利用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与抗原标记的探针分子特异性的结合来检测DNA序列在染色体上的位置。用作植物染色体原位杂交的探针因研究目的不同有许多种，主要的有：用于物种

起源和亲缘关系研究的物种专化DNA序列或外源物种总基因组DNA；用来构建染色体物理图谱的低拷贝或单拷贝序列；用于转基因植物鉴定的含目的基因的BAC和YAC克隆。原位杂交技术的基本步骤为：制备探针；染色体制片；染色体处理与变性；染色体与探针杂交；显微检测。

染色体原位杂交技术比较简便，结果直观。但其灵敏度和分辩率很大程度上依赖于制片技术和观察设备，一般实验室无法满足需要
二，，新型分子标记的方法
传统作物育种过程主要依赖于植株的表型选择（phenotypic selection），性状选择效果难以提高。遗传标记特别是基于DNA多态性的分子标记在作物遗传连锁图谱构建、重要性状基因标记定位与克隆、种质资源遗传多样性与系统发育分析、品种指纹图谱绘制及遗传纯度检测等方面广泛应用，尤其是分子标记辅助选择(molecular marker-assisted selection, MAS)为育种工作提供了极大方便，可显著提高育种的选择效率与育种预见性。

1 现有的分子标记

目前分子标记技术主要有RFLP、RAPD、ISSR、 AFLP、 SSR、SCAR和单核苷酸多态性 (SNP)、表达序列标签 (EST)等。由于PCR技术的优点，基于PCR的标记体系类型多样，应用广泛，但各自的复杂性、可靠性与遗传信息不同。如RAPD方法简单、成本低，但重复性较差、检测位点不多；SSR多为共显性、重复性好，但位点较少、引物开发成本高；AFLP谱带多，但分析程序复杂、成本高，有时要用到同位素，而且甲基化敏感的限制酶由于基因组DNA的甲基化可导致“假多态性”产生，识别AATT位点的MseI酶常会引起一些物种基因组中标记分布不均衡；多数情况下，RAPD与AFLP标记测序需要克隆，增加了工作量。

2 SRAP标记体系分析原理与方法

相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)是一种新型的基于PCR的标记系统，由美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros博士于2001年提出，又叫基于序列扩增多态性（sequence-based amplified polymorphism，SBAP）。

2.1 SRAP标记引物设计原理

引物设计是SRAP分析的核心。SRAP标记分析共有两套引物。在一组正向SRAP引物中使用“CCGG”序列，其目的是使之特异结合可译框（ORFs）区域中的外显子。研究表明外显子一般处于富含GC区域，如拟南芥2和4号染色体的全序列中，外显子CG比例分别为46.5%和44.08%，而内含子中则为 32.1%和33.08 %；而且除着丝粒区域有较低基因密度外，基因几乎平均分布在这两个染色体上。从GenBank中随机选择20个BAC序列，发现约66%的CCGG序列位于这些克隆中的外显子内。据统计，拟南芥约1/3基因组外显子位于2、4号染色体上。运用CCGG序列就可特异扩增出包含

这些组分的序列。
当然，由于外显子序列在不同个体中通常是保守的，这种低水平多态性限制了将它们做为标记的来源。由于内含子、启动子和间隔序列在不同物种甚至不同个体间变异很大，富含AT的区域序列通常见于启动子和内含子中，SRAP中使用的反向引物的3′ 端含有核心AATT，以特异结合富含AT区，这就使得有可能扩增出基于内含子与外显子的SRAP多态性标记。

2.2 引物设计与应用

引物大小和引物组合是成功进行SRAP分析的关键。SRAP-PCR反应体系中使用两个引物：17碱基正向引物（F-primer）和18碱基反向引物(R-primer)；早期反向引物在3’端选择性核苷前多一个C（19个）；使用同位素检测时引物可用33P-ATP标记。正向引物含有一段14碱基的核心序列（core sequence）：5′端前10个碱基为“填充”序列（filler sequence），无任何特异组成，接着为CCGG序列；随后为3′ 端的3个选择性碱基，选择性碱基的变化与相同核心序列组合成一套正向引物。反向引物的组成与正向引物类似，但“填充”序列后连接的为AATT；AATT序列后为3个选择性可变碱基，位于引物3′ 端。当然，构建正向与反向引物的总体要求是它们不形成发夹结构及其他二级结构，且CG含量为40%－50%，且两者“填充”序列在组成上必须不同，长度为10或11个碱基。

目前文献中报道的部分标准引物序列如下：
正向引物Forward primer 反向引物Reverse primer
me1:5′TGAGTCCAAACCGGATA-3′ em1:5′GACTGCGTACGAATTAAT-3′
me2:5′TGAGTCCAAACCGGAGC-3′ em2: 5′GACTGCGTACGAATTTGC-3′
me3:5′TGAGTCCAAACCGGAAT-3′ em3: 5′GACTGCGTACGAATTGAC-3′
me4:5′TGAGTCCAAACCGGACC-3′ em4: 5′GACTGCGTACGAATTTGA-3′
me5:5′TGAGTCCAAACCGGAAG-3′ em5: 5′GACTGCGTACGAATTAAC-3′
me6:5′TGAGTCCAAACCGGTAA-3′ em6: 5′GACTGCGTACGAATTGCA-3′
me7:5′TGAGTCCAAACCGGTCC-3′ em7: 5′GACTGCGTACGAATTCAA-3′
me8:5′TGAGTCCAAACCGGTGC-3′ em8: 5′GACTGCGTACGAATTCTG-3′
em9: 5′GACTGCGTACGAATTCGA-3′
em10: 5′GACTGCGTACGAATTCAG-3′
em11: 5′GACTGCGTACGAATTCCA-3′

实验表明，用单引物扩增只能扩增几条大约0.5~1kb的片段；使用较短引物，10碱基RAPD引物，以及含有SRAP引物核心序列的14－15碱基大小的引物，这些引物组合可得到多种扩增片段，但是扩增产物不稳定，特异性不强；20-22碱基引物放射自显影的结果背景太强；合适的引物大小在17－18碱基。

2.3 SRAP-PCR扩增

反应模板多数是基因组DNA，也可以是cDNA。在一个标准PCR反应体系中，0.2mmol/L dNTPs,1.5mmol/L Mgcl2,0.3μmol/L引物，1U Taq酶。SRAP-PCR反应采用复性变温法：开始94℃变性5min；反应前5个循环在94℃ 1min，35℃ 1 min，72℃ 1－2 min条件下运行

；之后30－35个循环复性温度提高到50℃，最后延伸5~7 min。
前5个循环复性温度设为35℃ ，主要是考虑到低的复性温度能确保两个引物与靶DNA部分配对；随后循环中复性温度升到50℃，可保证前5个循环的扩增产物可在余下循环中进行指数式扩增；如果复性温度在40个循环中都保持在35℃，扩增片段重复性将很低。

2.4扩增产物检测与片段测序

扩增产物在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，通常胶板35 cm×43cm，厚度0.8mm，每孔加样 8－20 微升，以保证单条带足够量回收。可使用同位素，也可采用银染技术；用2.0%的琼脂糖凝胶也可分析多态性，但分辨的条带较少。
对标记测序有可能获得更多的遗传信息。由于多数SRAP产生高强带，很少有重叠，而且引物较长，故比AFLP易测序。获得的SRAP标记差异片段，从胶上割下、回收后，用相应引物直接测序，必要时可采用克隆测序。

2.5 SRAP标记特征

由于在设计引物时正反引物分别是针对序列相对保守的编码区与变异大的内含子、启动子和间隔序列，因此，多数SRAP标记在基因组中分布是均匀的，通过利用RIL系构建的遗传连锁图也说明了这一点。同时发现在130个SRAP标记中，约20%为共显性，这种高频率的共显性则明显优于AFLP标记。
利用同一引物组合，从甘蓝类不同作物中（包括花椰菜、青花菜等）可获得多个SRAP标记。单个组合在每个个体中可检测到至少10条多态性谱带，其中一些为作物特异的；在不同的实验中多态性条带重复性极好。 SRAP标记测序显示多数标记为外显子区域。25条多态性带中16条（64%）序列GC含量超过35%，表明可能是外显子部分；Blast搜索表明60%条带与已知基因序列高度一致，这就确认了SRAP产生的多数标记包含了可译框中的外显子。测序还表明SRAP多态性产生于两个方面：由于小的插入与缺失导致片段大小改变，而产生共显性标记；核苷酸改变影响引物的结合位点，导致显性标记产生。

3. TRAP标记原理与方法

靶位区域扩增多态性 (target region amplified polymorphism，TRAP)也是一种新型的基于PCR标记，由美国农部北方作物科学实验室Hu与Vick于2003年提出。与SRAP、RAPD和AFLP等标记技术无须任何序列信息即可直接PCR扩增不同，TRAP技术是基于已知的cDNA 或EST序列信息。目前已获得许多物种基因组序列的丰富信息，包括人类、拟南芥，以及重要作物水稻和多种微生物的基因组序列草图绘制成功，有大量的EST序列可供使用，从而使得可以利用生物信息学工具和EST数据库信息产生出许多靶基因序列的TRAP多态性标记，而且极易将性状与标记相关联。
TRAP技术是从SRAP技术改进而来的。SRAP使用

两个任意引物；而TRAP是使用长度为16~20核苷的固定引物（fixed primer）与任意引物(arbitrary prime)，固定引物以公用数据库中的靶EST序列设计而来；任意引物与SRAP所用的一样，为一段以富含AT或GC为核心、可与内含子或外显子区配对的随机序列。固定引物的设计步骤为：从EST数据库中鉴别所需序列，再采用有关引物设计软件（如Primer3等） 设定核苷酸序列合理长度（18碱基）与最适、最大和最小Tm值（53、55、50℃），最后选定最适的引物; 任意引物设计完全同SRAP技术。TRAP-PCR反应条件与SRAP-PCR完全一致。每次TRAP-PCR反应在6.5%聚丙烯酰胺测序胶可产生50－900bp的片段30-50 个。

4 应 用

SRAP分子标记系统最早是在芸薹属作物开发出来。目前已在其他作物如马铃薯、水稻、生菜、油菜、大蒜、苹果、樱桃、柑橘与芹菜中也成功扩增。TRAP技术是在向日葵中开发的，目前已成功应用于其他作物如水稻、菜豆、大麦、小麦、甜菜。主要用于种质资源的鉴定评价、遗传图谱的构建、重要性状基因标记、gDNA与cDNA指纹分析乃至图位克隆等方面。

4.1种质资源的鉴定评价

由于在不同物种、不同个体间具有一定的多态性，SRAP技术也成功应用于种质鉴定与评价工作中。Ferriol等（2003）对甜瓜（Cucurbita pepo）的2个变种69份类型代表性材料遗传多样性进行了SRAP、AFLP标记与形态学分析，结果表明，与形态学变异及类型的进化历史一致性方面，SRAP标记提供的信息比AFLP标记更优良；11个SRAP引物组合获得88条可重复的条带，平均8条，其中64条（72.7%）为多态，大小在154-653bp 之间；测序发现多个标记序列与已知cDNA或EST高度同源。另外还利用SRAP标记对笋瓜（C.maxima）19 份种质及8份南瓜属材料遗传多样性进行分析，24个引物组合产生的114个标记中多态性占33%，虽然低于RAPD比例，但聚类分析与主坐标分析表明，SRAP标记分析可将材料按照使用类型（食用、饲用、观赏用）来分组。因此，在对育种目标性状的评价方面，明显优于RAPD标记。
野牛草（Buffalograss）生长缓慢、耐旱、耐瘠、抗虫，倍性多样，遗传基础广泛。Budak等利用SRAP标记分析了buffalograss的43个基因型遗传多样性，结果也表明SRAP是一个评价遗传多样性、品种鉴定和系统发生的有效工具。
向日葵属野生种在栽培品种遗传改良方面很有价值，对于重要病害，尤其是霜霉病是很好的抗源，但大部分野生种是多年生，从野生种中鉴定基因非常困难。Hu等设计了与向日葵EST数据库中编码富含亮氨酸重复（LRR）类似蛋白序列配对的固定引物，利用TRAP标记分析，对向日葵属16个野生种及其2个杂交种的遗传变异性进行评估

。结果表明TRAP标记可用于评估向日葵的遗传多样性，材料的聚类结果与经典分类相一致；其中一个TRAP引物结合到与抗病性有关的基因序列。表明TRAP技术将在种质基因型鉴别和重要目的农艺性状的基因标记方面存在广泛的应用前景。

4.2 遗传图谱构建

利用collard × cauliflower形成的RIL86个群体，构建了由130个SRAP、120个AFLP标记组成的遗传图谱。类似AFLP标记，SRAP均匀分布平衡在9个重要连锁群上。高频率共显性与在基因组中均匀分布的特性将使其优于AFLP标记而成为一个构建遗传图谱的良好标记体系。

4.3 绘制基因组转录图谱（transcriptome map）

转录图谱（transcriptome map）是进行比较基因组学研究极为有效手段。利用基于PCR的cDNA-SRAP分析来检测编码区的多态性将简便、高效、快捷。利用花椰菜DH植株与青花菜杂交产生的F2群体88个单株，使用48引物组合，从88个cDNA中检测到281个多态性cDNA -SRAP标记，平均每个引物对产生6个，21.1%为共显性；构建了由247个标记组成的转录图谱。利用这个图谱，成功进行了甘蓝类蔬菜作物与拟南芥基因组的基因排列与组成分析，发现这两类基因组的广泛同一性，在190个多态性cDNA-SRAP标记中，共有169个相似序列；这种同一性集中在某些染色体片段而非整个染色体上；甘蓝中大多数重复区段集中对应于拟南芥1号与5号染色体，而不是2号与4号染色体。

4.4 重要性状基因标记

重要农艺性状基因紧密连锁标记的获得，将可进行性状分子标记辅助选择，提高育种的选择效率与预见性，加快新品种的选育进程。常用的标记作图群体有F2、BC1、DH、RIL等，标记策略有BSA、NIL以及GRA等。BoGLS-ALK基因是十字花科中调节脂肪族芥子油糖苷脱饱和基因。利用RIL群体，采用SRAP技术，将该基因定位到连锁群L1，距显性标记SRAP133 1.4cM。
Li等于2003年在大白菜中也发现了一个与雄性不育基因有关的SRAP标记，在油菜中筛选到一个与Rf连锁的SRAP标记，在芹菜中获得一个与病毒抗性基因紧密连锁的SRAP标记。

4.5 SRAP标记测序与基因克隆

多数SRAP标记包含了可译框中的外显子，这为特定性状基因的分离克隆提供了极大方便。进一步测序与Blast分析发现，通过RIL群体获得BoGLS-ALK基因的显性标记SRAP133 与拟南芥中BAC克隆F4C21中一未知基因的可译框高度同源，该基因位于5号染色体上，此基因座已经定位了一个去饱和基因。据此推测标记SRAP133也在这个基因内部。
综合运用拟南芥相关基因序列信息，应用SRAP技术对青花菜BAC克隆测序，最终克隆了芥子油糖苷合成途径中一关键基因BoGLS-ELONG。
Li等利用SRAP技术获得一个与BoGLS-ALK基因共分离

的标记，再用此标记序列来筛选青花菜BAC文库的一个BAC克隆，成功分离到BoGLS-ALK基因；并通过遗传转化导入拟南芥，进行了该基因的功能分析。同时正在从结球白菜的花粉母细胞、减数分裂期的花蕾分离出mRNA，进行cDNA的SRAP指纹图谱分析，以期克隆一些特异表达的基因，并初步获得PMC特异表达的基因。