氯化镉对小鼠胚胎神经干细胞迁移的影响

Faculty of Preventive Medicine，Bengbu Medical College，Bengbu 233030，China
Abstract： Objective To investigate the effects of cadmium chloride on cytoactive and immigration of mouse neural stem cell （ mNSC） ． Methods MTT assay was used to detect cytoactive at 24 hours． The immigration of mNSC was determined by immunofluorescence staining． Ｒesults Compared with control，CdCl2 treatment at 10. 0 μmol / L for 24 h resulted in a decrease in cellular viability （ 70. 08 ± 6. 21 ） % （ P ＜ 0. 05 ） ． Compared with control，Aa / Ab and Dm / Db display decreasing tendency in a dosedependent manner（ rs Aa/Ab = － 0. 90，rs Dm/Db = － 0. 90，P ＜ 0. 05） after CdCl2 treatment at 0. 1 － 10. 0 μmol / L for 24 h． Conclusion Cadmium chloride treatment inhibits immigration of mNSC，and shows negative effect on cell viability． Meanwhile，the effect of cadmium chloride on immigration is more obvious than cell viability at the same concentration for same treatment time．
1 安徽医科大学卫生毒理学系 2 安徽省亳州市人民医院
镉 是 一 种 应 用 广 泛 的 重 金 属 元 素，随 着 工 业 的 快 速 发 展 ，镉 的 使 用 量 和 释 放 量 增 加 ，镉 污 染已从职业环境向日常生活环境扩展。人体主 要 通 过 食 物 、饮 水 、吸 烟 和 吸 入 含 镉 粉 尘 等 途 径 接触镉，它 甚 至 能 分 泌 至 乳 汁 中 进 而 影 响 婴 幼 儿［1］。 经 常 地 暴 露 可 以 导 致 镉 在 体 内 过 度 蓄 积
关键词： 氯化镉 神经干细胞 细胞迁移
中图分类号： Ｒ994. 6 Q132. 7
文献标志码： A
Effect of cadmium chloride on immigration of mouse neural stem cell
ZHANG Yuyuan，WANG Qunan，CHAI Xiaoyu，SHEN Zhongzhou，GAO Liuwei
1 材料与方法 1. 1 主要试剂
氯化镉（ CdCl2 ，纯度 99% ） 购于 Fluka 公司； 四噻氮唑盐（ MTT） 、表皮生长因子（ EGF） 、多聚L-赖氨 酸 （ PLL） 、肝 素、谷 氨 酰 胺、腐 胺、DNase Ⅰ、孕酮、4-羟乙基哌嗪乙磺酸 （ HEPES） 均购于 Sigma 公司； DMEM / F12 培养基、DMEM 培养基、 B27 购于 Gibco 公司； Neurobasal、碱性成纤维生长 因子 （ bFGF） 和 TrypLETM express 购 于 Invitrogen 公司； 一抗 anti-nestin、二抗 Cy3 标记羊抗鼠购自 Chemicon 公司。 1. 2 小鼠胚胎神经干细胞的分离和培养
蚌埠医学院预防医学系，蚌埠 233030
摘要： 目的 探讨氯化镉对小鼠胚胎神经干细胞（ mNSC） 细胞活性和迁移能力 的影响。 方 法 建 立 小 鼠 神 经 干 细 胞 体 外 模 型，以 0、0. 1、0. 3、1. 0、3. 0 和 10. 0 μmol / L 的氯化镉作用于小鼠胚胎神经干细胞 24 h，噻唑蓝（ MTT） 比色法测定细 胞活力； 免疫荧光细胞化学法分析细胞迁移。结果 10. 0 μmol / L 的 CdCl2 作用 24 h 后细胞存活率（ 70. 08 ± 6. 21） % 显著低于正常对照组（ P ＜ 0. 05） ； 在设定剂量下，氯 化镉作用神经干细胞 24 h 后，Aa / Ab 和 Dm / Db 呈下降趋势，存在剂量依赖性（ rs Aa/Ab = － 0. 90，rs Dm/Db = － 0. 90，P ＜ 0. 05） 。结论 氯化镉对神经干细胞的迁移和活力均 有影响，且在同一浓度和相同作用时间下对神经干细胞的迁移影响大于对细胞活力 的影响。
PLL 处理过的 96 孔细胞培养板。待细胞贴壁后
加入不同剂量氯化镉染毒 24 h，4% 多聚甲醛固定
15 min，0. 3% TritonX-100 的 5% 羊血清湿盒内封
闭通透 1 h（ 室温） ，一抗 anti-nestin（ 1 ∶ 200） 孵育
约 15 h，二抗羊抗鼠 Cy3（ 1∶ 200） 湿盒内室温避光
细胞存活率
=
A加药 A空白
－ －
A无细胞孔 A无细胞孔
× 100%
Hale Waihona Puke 1. 5 神经球迁移镜下观察待大多数神经球直径小于 150 μm
时进行迁移实验。转移悬浮细胞至适当大小试
管，用预热的 PBS 洗后静置 5 min，吸弃上清，加入
2 ml 干细胞分化培养基重悬神经球，稀释神经球
至适当密度，以≤5 个神经球 /50 μl 密度接种于
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卫生研究
第 44 卷
图 1 迁移前干细胞标志物 Nestin 表达情况 Figure 1 The expression of stem cell marker Nestin before migration（ × 200）
注： （ 1） 与空白对照组比较，P ＜ 0. 05 图 2 不同浓度氯化镉作用 24 h 对 mNSC 存活率的影响 Figure 2 The effects of different concentrations CdCl2
氯化镉用 0. 9% NS 溶解，以 0、0. 1、0. 3、1. 0、 3. 0 和 10. 0 μmol / L 剂量对小鼠神经干细胞作用 24 h，所有实验均设立培养基对照。 1. 4 MTT 比色法检测细胞存活率
参照 Tada 测定细胞活性的改良法［9］，细胞接 种于 96 孔板，加入目标浓度的氯化镉，孵育 24 h 后，弃去培养液，在各孔中加入 50 μl 1 mg / ml 的 MTT，继续孵育 4 h 后加入 DMSO 终止反应溶解 MTT，波长 570 nm 处测量各孔 A 值，取平均值，计 算存活率。试验重复 3 次。
细胞经免疫荧光标记后，用 Olympus IX71 和
Olympus DPCam Camera Capture Support 系统捕获
图像。Image J （ http： / / rsbweb． nih． gov / ij ） 测量分
析。实验所得数据以均数 ± 标准差（ x珋± s） 表示，各
组均数比较采用单因素方差分析，如各组间差异有
第1 期
张玉媛，等 . 氯化镉对小鼠胚胎神经干细胞迁移的影响
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而引发一 系 列 毒 性 损 伤，镉 对 于 神 经 系 统 也 有 一 定 的 影 响［2-3］，对 生 长 发 育 期 的 大 脑 具 有 一 定 的毒性［4-5］。
神经干细胞具有持续增殖、迁移、分化成为神 经元和胶质细胞的能力，在外源化学物存在的条 件下观察神经干细胞增殖、迁移、分化等的改变可 以作为神经发育毒物的检测方法［6-7］。镉能抑制 神经干细胞向星形胶质细胞的分化，这种作用可 能导致大脑发育早期阶段的星形胶质细胞数目减 少，进而影响到神经元的正常发育和神经系统微 环境的稳定［8］。 为 进 一 步 了 解 镉 的 神 经 发 育 毒 性作用机制，本实验拟采用小鼠胚胎大脑皮层神 经干细胞（ mNSC） 作为研究材料，观察氯化镉对 神经干细胞迁移的影响。
统计学意义，两两比较采用 Q 检验，相关性分析采
用 Spearman 相关，SPSS 16. 0 进行统计学分析。
2 结果 2. 1 神经干细胞标志蛋白 Nestin 表达
神经球细胞中间丝蛋白 Nestin 是鉴定神经干 细胞的标志 物［10］，神 经 球 在 迁 移 前，经 免 疫 荧 光 细胞化学染色发现，Nestin 表达呈阳性反应，如图 1 所示，说明实验所用细胞为神经干细胞［11］。 2. 2 氯化镉对 mNSC 存活的影响
第 44 卷 第 1 期 106 2015 年 1 月
卫生研究 JOUＲNAL OF HYGIENE ＲESEAＲCH
文章编号： 1000-8020（ 2015） 01-0106-04
Vol． 44 No． 1 Jan． 2015
·实验研究·
氯化镉对小鼠胚胎神经干细胞迁移的影响
张玉媛 王取南1 柴小玉2 沈忠周 高刘伟
孵育 3 h，DAPI （ 1 μg / ml ） 避 光 复 染 核 15 min。
Olympus IX71 荧光倒置显微镜和 Olympus DPCam
Camera Capture Support 捕获图像，试验重复 3 次，
每组随机选取 10 个形态完整的神经球。
1. 6 图像获取及测量及数据处理
考虑到神经球大小不同会影响其迁移能力， 本实验用迁移后面积与神经球面积比值（ Aa / Ab） 和最长迁移距离与迁移前球径之比 （ Dm / Db） 来 反映镉对 神 经 干 细 胞 迁 移 能 力 的 影 响［11］。 由 表 1 和图 3 可 见，Aa / Ab、Dm / Db 在 染 毒 剂 量 低 于 0. 3 μmol / L 时逐渐增加，然后逐渐下降，存在剂