肺炎克雷伯氏菌特异性抗原的筛选与鉴定
肺炎克雷伯杆菌噬菌体的分离鉴定和生物学特性的研究
图1 肺炎克雷伯杆菌噬菌体 图2 肺炎克雷伯杆菌噬菌体 K1 BP108 图3 噬菌体 K1 BP 基因组酶切电泳
K1 BP108 噬斑
电镜照片( × 100 k)
2. 5 噬菌体 K1 B5 h 后 ,宿主菌被 充分裂解 ,培养液变得澄清 ,计数各测定管中的噬菌 体滴度 ,结果见表 2 。根据表实验结果 ,当 MOI = 0. 1
24 h ,此步为混合扩增培养 。10 000 × g 离心 4 min , 取上清用 0. 22 μ m 滤膜滤过除菌 ( 或取上清 56 ℃ 加
热 1 h) 。取 16 支 10 ml 试管 ,加入 0. 3 ml 处理后的 溶液 ,每管再分别加入 0. 3 ml 新鲜培养的宿主菌悬 液 ,震荡混匀 ,室温静置 15 min , 使噬菌体充分吸附 宿主菌 。再加入 50 ℃ 左右溶化 0. 7 %的 LB 培养基 3
BamH Ⅰ、 EcoR Ⅰ 和 Hind Ⅲ 的酶切位点 ,故所分离到
的噬菌体的基因组为双链 DNA 。从凝胶电泳分析 出噬菌体 K1BP108 基因组大小在 25 - 30 kb 之间左 右 。在噬菌体的分类中 ,除了根据基因分型外 ,噬菌 体的大小和形态也是分类的依据 。本项研究在多次 纯化后 ,将噬菌体进行电镜观察 。从电镜照片中发 现 ,肺炎克雷伯杆菌噬菌体的形态呈复合对称形 ,即 分为头部和尾部 , 头部呈球形 , 尾部呈丝状 , 故属于 有尾噬菌体 。一般来说裂解性噬菌体大都呈复合对 称形 ,即由头部和尾部组成 。头部是衣壳蛋白和核 酸组成 ,尾部则是附着宿主菌的器官 。 感染复数是为研究病毒感染与产出之间量的关 系而提出的一个重要生物学指标 。不同噬菌体的最 佳感染复数不同 , 确定一种噬菌体的最佳感染复数 对噬菌体颗粒的分离纯化 、 结构蛋白的制备 、 基因组 的提取以及噬菌体展示技术等研究都有重要的指导 意义 [8 ] 。在本项研究中 , 宿主菌即肺炎克雷伯杆菌 的数量为 108 CFU/ ml , 而噬菌体的数量则从 104 到
青岛地区兔肺炎克雷伯氏菌分离鉴定
［］唐 毅，张芬 ，孙翰 昌等 ．白鲢肺 炎 克雷 伯 氏菌 的分离 鉴定 ［ ．西南 ２ Ｊ 】 大学 学报 ．０７ ２ （）７ —６ ２ ０． ９６：３７ ．
［］陶锦 华 ， 康然 ， 平等 ． 龟肺 炎克 雷伯 氏菌 感染 的诊 断与 防治 ３ 李 韦 石
【］叶 应妩 ，王毓 三 ． 国 临床检 验 操 作规 程［ ． ４ １ 全 Ｍ】 第 版．南 京 ：东南
大学 出版 社． ９ ７ １９ ．
敏纸 片判 断标准 》 。此 次分离 出 的肺 炎克雷 伯 氏菌对诺 氟沙 星等 药物高 度敏感 ，对 强力霉素 等 中度 敏感 ，对 头 孢拉定等耐药 ，具体结果见表２ 。
１ 自ＯＭＥ Ｊ ！ ＝ ｉ ｊ ＧＡ公 司 。
１ 药敏 试验 ． ７
取普通 肉汤２ ｈ ４ 纯培养物 ｌ 均匀涂布于 ｍｌ
营养 琼脂平皿上 ，贴上 药敏纸片 ，置于３ ℃温 箱培养２ ｈ ７ ４
后观察试验结果 。
２ 结果 取 病死兔病 变组织 ，无 菌操作划线
１ 病原分 离培 养 ． ２
２４ 动 物 试 验 结 果 ．
普 通 肉汤 培 养 物 接 种 小 鼠后 ， 试 验
大 肠 杆 菌 ， 发 病 初 期 临 场 症 状 与 大 肠 杆 菌 病 较 接 近 ，但
组 ４ 小 鼠２ ｈ 只 ４ 内全 部 死 亡 ， 对 照 组 小 鼠全 部 健 活 。 死 亡
用 药后病情 没有 改善 ，发病 率和死亡 率升 高 ，临 床症状 也发生 变化 ，加大用 药量也 无 明显改善 。说 明此 次肺 炎 克雷伯 氏菌 发病是 由于气候 变化 、仔兔 体质较 弱及其 他 疾病等 因素 引起 的，同 时因该菌 具有较 强的耐 药性 ，用 药后仔兔 肠道 内菌群 失调 ，也是爆 本发病 的一个 主要 原
【精品】肺炎克雷伯氏菌的药敏试验
【关键字】精品深圳动物园15株肺炎克雷伯氏菌耐药性的检测动物医学院动物医学唐春成（指导老师：杨光友教授）摘要：目的：了解深圳动物园黑猩猩等10种灵长动物肺炎克雷伯氏菌的耐药特性及趋势，指导临床合理用药。
方法：用K-B纸片扩散法做药物敏感试验。
结果：检测的15株肺炎克雷伯氏菌对21种抗生素的药敏结果显示，对萘啶酸、氨苄西林、羧苄西林和四环素的耐药率最高，均为100%；其次为磺胺甲基异恶唑、头孢唑啉（先锋霉素V）、多西环素和多粘菌素B，其耐药率分别是93.33%、87.78%、80%和80%；对环丙沙星、阿奇霉素、诺氟沙星、头孢呋新、加替沙星、奈替米星和磷霉素的耐药率分别是73.33%、73.33%、60%、60%、53.33%、53.33%和53.33%；对头孢西林和呋喃妥因的耐药率均为40%；对头孢噻肟、亚胺硫霉素和阿米卡星的耐药率分别为33.33%、26.67%和20% ；菌株对拉氧头孢钠的耐药率为0 。
结论：该地区肺炎克雷伯氏菌所引起的疾病治疗的首选药氧头孢烯类，其次可合理选用第三代头孢菌素、氨基糖甙类、碳青霉烯类、呋喃类药。
关键词：肺炎克雷伯氏菌；耐药性；检测Resistance testing of 15 bahts Klebsiella Pneumoniae in Shenzhen zooTang Chuncheng Veterinary，Grade2006Directed by Yang Guangyou（professor）Abstract：Objective: To understand the Shenzhen Zoo chimpanzees and other 9 primates Klebsiella pneumoniae‘s resistance characteristics and trends to guide clinical use of drugs. Meth od: K-B disk diffusion method to do drug susceptibility testing. Results: The detection of 15 bahts Klebsiella pneumoniae to 21 antibiotics showed that the resistance rate of Nalidixic acid, Ampicillin, Carbenicillin and Tetracycline are the highest are 100%；This was followed by SMZ-TMP, cefazolin (Vanguard ADM V), doxycycline, polymyxin B, that drug resistance rate was 93.33%,87.78%,80%,80%; to ciprofloxacin, azithromycin , norfloxacin, cefuroxime, gatifloxacin, netilmicin, fosfomycin the resistance rate was 73.33%,73.33%,60%,60%,53.33%,53.33% and 53.33%;Resistance rates of xilin of cephalosporins, nitrofurantoin were 40%; And resistance rates right cefotaxime, imipenem, amikacin were 33.33%, 26.67%, 20%; Fortunately,0 is the resistance rate of strain to Latamoxef sodium. Conclusion: The Klebsiella pneumoniae in diseases caused by treatment of first choice for drug oxacephems, followed by the selection of the third generation can be reasonably cephalosporins, aminoglycosides, carbapenems, furan, amide alcoholsmedicine.Key words: Klebsiella pneumoniae; resistance; detect肺炎克雷伯氏菌属于革兰氏阴性肠杆菌科(Enterobacteraceae)克雷伯菌属(klebsiella)。
ESBLs检测的筛选与确证试验
肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌中
ESBLs检测的筛选与确证试验
ESBLs是英文Extended-Spectrum β-lactamase的缩写，中文意思是超广谱β-内酰胺酶，它是当前抗生素出现的新的耐药趋势之一。
目前大肠埃希氏菌（大肠杆菌）、肺炎克雷伯氏菌是最常见的产ESBLs菌株的细菌，其次，阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、弗劳地枸橼酸菌、铜绿假单孢菌也可出现产ESBLs菌株的细菌。
脚注:
头孢他啶/克拉维酸(30/10μg)纸片与头孢噻肟/克拉维酸（30/10μg）纸片的制备：使用克拉维酸1000μg/ml的原液（新鲜制备或者从－70℃冰冻中取出已分装在小瓶中的），把10μl的克拉维酸加到头孢他啶（30μg）和头孢噻肟（30μg）的纸片上。
在纸片贴于平板之前1个小时内，用微量加样器把10μl原液加到头孢他啶和头孢噻肟纸片上，允许有30
分钟的时间以利于克拉维酸的吸收和纸片在贴之前保持足够的干燥。
制备完成后立即使用纸片，否则丢弃；不能保存。
（1）CAZ CAZ/棒酸，CTX CTX/棒酸。
一种大于5MM，另一种小于5MM或相等，可确认为ESBL阳性。
（2）加棒酸的药片抑菌圈直径反而小于不加的，可能是片间差异，应认为ESBL阴性。
MCDA-LFB检测肺炎克雷伯菌的最佳扩增温度、最佳扩增时间选择及评估
MCDA -LFB 检测肺炎克雷伯菌的最佳扩增温度、最佳扩增时间选择及评估韩文雅，程雪琴，刘群翔，王骁，肖传勇，王梅芳十堰市太和医院呼吸与危重症医学科，湖北十堰442000摘要：目的 筛选多交叉置换扩增技术（MCDA ）结合纳米生物传感条（LFB ）检测肺炎克雷伯菌的最佳扩增温度、最佳扩增时间，并对MCDA -LFB 法检测肺炎克雷伯菌的效果进行评估。
方法 根据肺炎克雷伯菌特异的保守基因rcsA 的核苷酸序列，采用Primer Premier Version 5.0软件设计一套特异性MCDA 引物，其中交叉引物CP1和扩增引物C1分别标记异硫氰酸荧光素（FITC ）和地高辛（Dig ），建立25 µL 的MCDA 反应体系。
将温度按60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃、66 ℃、67 ℃依次递增，分别扩增1 h ，然后85 ℃加热5 min 后终止反应，使用实时浊度仪观察DNA 浓度曲线，绘制MCDA 扩增反应动力学图，确定最佳扩增温度。
在筛选出的最佳扩增温度下，选择10 min 、20 min 、30 min 和40 min 4个时间点分别对10 ng /µL 、100 pg /µL 、10 pg /µL 、1 pg /µL 、100 fg /µL 、10 fg /µL 和1 fg /µL 的肺炎克雷伯菌DNA 进行MCDA 扩增，使用LFB 进行检测，根据LFB 检测结果确定最佳扩增时间。
使用MCDA -LFB 法检测36株肺炎克雷伯菌和18株非肺炎克雷伯菌，使用临床分离培养法和MCDA -LFB 法检测呼吸道感染患者的42份痰液样本和3份健康对照痰液样本，观察MCDA -LFB 法检测肺炎克雷伯菌的灵敏度、特异度。
将肺炎克雷伯菌ATCC700603标准株基因组DNA 分别稀释至10 ng /µL 、100 pg /µL 、10 pg /µL 、1 pg /µL 、100 fg /µL 、10 fg /µL 和1 fg /µL ，使用MCDA -LFB 法检测，依据结果是否阳性判定检测下限。
羊源肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定
表 １ 药敏 试 验 结 果
注 ：“＋，，表 示 阳性 ；“一”表 示 阴性 。 ２．３ 分 离茵 １６Ｓ ｒＲＮＡ 扩 增 和 测序 分析 该 分 离 株 经 ＰＣＲ 扩 增 、电 泳 ，得 到 了 相 应 的 目 的 片 段 （图 １）。将 ＰＣＲ 扩 增 株 的 测 序 结 果 进 行 分 析 ．得 到 了长 为 １４３８ ｂｐ的 片段 ，命 名 为
关 键 词 ：肺 炎 克 雷伯 氏 茵 ；分 离；１６Ｓ ｒＫＮＡ
克 雷 伯 氏 菌 属 为 肠 杆 菌科 的成 员 ，有 肺 炎 克雷 伯 氏菌 、产 酸 克 雷 伯 氏菌 、植 生 克 雷 伯 氏菌 和土 生 克 雷伯 氏 菌 这 ４个 种 ｆ１】。肺 炎 克 雷 伯 氏 菌 （Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）是 一 种 条 件 性 致 病 菌 ．可 引 起 肺 炎 、子 宫 炎 、腹 泻 等 疾 病田。 随着 养殖 规模 的 不 断 增 大 ，由 肺 炎 克 雷 伯 氏菌 引起 的疾 病 致 死 率 较 高 ．它 不 仅 给 养 殖 行 业 造 成 巨大 的 经 济 损 失 ．也 严 重 危 害 人 类 的 健 康 。
１．６ 药 敏 试 验 采 用 纸 片琼 脂 扩 散 的方 法 进行 药敏 试 验 ，药 敏 纸 片 购 自杭 州 滨 和 微 生 物 试 剂 有 限 公 司 ．按 照 该 公 司 试 验 标 准 进行 操 作 ，然 后 放 置 在 ３７℃恒 温 箱 培 养 １２ ２４ｈ后 ，观 察抑 菌 圈情 况 。 ２结 果 ２．１细 菌 分 离和鉴 定 将 肺 组 织划 线 接 种 于麦 康 凯 平 板上 ，置 于 ３７℃培 养 ２４ｈ后 ， 菌 生 长 良好 ．菌 落颜 色 为 红 色 。 菌 落 有 点 黏 稠 ，挑 取 单 个 菌 落 时 具 有 拉 丝现 象 ．经 镜 检 为革 兰 氏 阴性 、短 杆 菌 。 ２．２细 茵 生 化 鉴 定 分 离 株 的 生 化 特 性 结 果 Ｖ—Ｐ试 验 、枸 橼 酸 盐 、葡 萄 糖 、乳 糖 、尿 素 酶 试 验 均 为 阳性 ：吲 哚 、甲 基 红 和 明胶 水 解 试 验 为 阴性
克雷伯菌属的鉴定
克雷伯菌属的鉴定1、标本要求：1.1 尽量用药前采集标本。
1.2 痰液：病人清晨咳痰于无菌、防漏小塑料盒内，切勿唾液送检。
1.3 尿液：病人留取12h尿液，送检。
1.4 粪便：病人留取粪便5 10g，送检。
1.5 脑脊液及其它无菌体液：用无菌瓶直接送检。
血标本不要冷冻。
1.6 不可接受的标本：干的拭子、蜡盒、未消毒容器、留取24h后的尿或痰、破裂的瓶子、标本泄漏、标本无标签。
2、仪器35℃孵箱、普通光学显微镜3、试剂羊血平皿、巧克力平皿、麦康凯平皿、葡萄糖蛋白胨水、葡萄糖酸盐培养管、氨基酸脱羧培养管、糖醇发酵管、VP试剂、湖南长沙天地人肠杆菌鉴定板。
4、试验方法及原理：4.1 甲基红试验方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，孵育过夜，加甲基红试剂1～2滴，观察结果。
结果：红色为阳性，桔黄色为阴性。
4.2 吲哚（靛基质）试验方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，孵育过夜（一般为24－48h），加靛基质（对位二甲基苯甲醛）试剂1～2滴，观察结果。
结果：两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。
4.3 氨基酸脱羧试验方法：取待检菌接种于氨基酸脱羧培养管和对照管中，封石腊油，35℃培养过夜，观察结果。
结果：培养管变紫色为阳性，黄色为阴性。
对照管应保持黄色。
注意点：（1）．培养管的pH值很重要。
（2）．加封石腊油造成厌氧环境。
因为在厌氧情况下氨基酸脱羧生成的胺才稳定。
（3）．对照管如不呈黄色，则氨基酸脱羧酶试验不能作出判定。
4.4 VP试验方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，于35℃培养24－48h后加入VP试剂甲液（6％α－奈酚酒精溶液）和乙液（40％KOH溶液），振摇，然后观察。
结果观察：在数分钟内出现红色为阳性，如无红色出现且于35℃4h后仍如故者即为阴性。
4.5 葡萄糖酸盐试验方法：大量接种待检菌于葡萄糖酸盐培养管中，35℃孵育过夜或至48h，加班氏试剂，水浴中煮沸 lOmin,观察结果。
肺炎克雷伯实验报告
一、实验目的1. 学习细菌分离与鉴定的基本原理和方法。
2. 掌握肺炎克雷伯菌的分离纯化技术。
3. 培养对肺炎克雷伯菌的观察和识别能力。
二、实验原理肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一种常见的革兰氏阴性杆菌，广泛存在于人体肠道、呼吸道等部位。
它可引起肺炎、尿路感染、脑膜炎等疾病。
本实验通过分离纯化肺炎克雷伯菌，并进行鉴定，以了解其生物学特性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 肺炎克雷伯菌标准菌株- 临床样本（如痰液、尿液等）- 琼脂平板、麦康凯琼脂平板、血琼脂平板- 碱性蛋白胨水、营养肉汤、营养琼脂- 生理盐水、无菌棉签、镊子、剪刀、移液器等- 显微镜、酒精灯、高压蒸汽灭菌器等2. 实验仪器：- 恒温培养箱- 紫外线灯- 离心机- 紫外线消毒柜四、实验方法1. 样本处理- 取适量临床样本（如痰液、尿液等），加入生理盐水稀释。
- 用无菌棉签将样本均匀涂布于麦康凯琼脂平板上。
- 将平板置于37℃恒温培养箱中培养18-24小时。
2. 分离纯化- 观察平板上生长的菌落，挑选单菌落接种于血琼脂平板上。
- 将血琼脂平板置于37℃恒温培养箱中培养24小时。
3. 鉴定- 观察菌落特征，如形状、大小、颜色等。
- 对疑似肺炎克雷伯菌的菌落进行以下鉴定实验：a. 观察菌落形态，是否为革兰氏阴性杆菌。
b. 进行氧化酶试验，观察菌落是否产生颜色变化。
c. 进行麦康凯试验，观察菌落是否产生红色变化。
d. 进行脲酶试验，观察菌落是否产生氨气味。
e. 进行DNA-DNA杂交试验，与肺炎克雷伯菌标准菌株进行比对。
4. 结果记录与分析- 记录实验过程中观察到的菌落特征和鉴定实验结果。
- 对实验结果进行分析，判断分离纯化的菌株是否为肺炎克雷伯菌。
五、实验结果与分析1. 样本处理在麦康凯琼脂平板上，观察到红色菌落生长，说明样本中可能含有肺炎克雷伯菌。
2. 分离纯化在血琼脂平板上，观察到革兰氏阴性杆菌菌落生长，疑似肺炎克雷伯菌。
和田地区羊源肺炎克雷伯菌的分离及生物学特征鉴定
肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia ，KP ）属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae ），为革兰氏阴性杆菌，广泛分布于人和动物肠道以及自然环境中［1］，肺炎克雷伯菌作为仅次于大肠杆菌的人畜共患条件致病菌，可引起人和动物伤口感染、肺炎、脑膜炎、泌尿系统发炎［2，3］。
关于肺炎克雷伯菌感染鸡［4］、牛［5，6］、犬［7］、水貂［8］、大熊猫［9］等动物有较多的报道，均造成一定经济损失，因此及时了解动物感染肺炎克雷伯菌的血清型、携带毒力基因及耐药情况，对治疗及预防肺炎克雷伯菌具有重要意义。
羊养殖业是和田地区的主要支柱产业，随着规模化养殖的不断发展，由肺炎克雷伯菌引起的羊呼吸道疾病时有发生，试验从和田地区某规模化养殖场采集25份具有呼吸道症状病死羊胸腔积液及肺脏组织，进行细菌分离培养，通过革兰氏染色、生化试验、16S rRNA 基因扩增、溶血酵素（khe ）基因检测鉴定方法确定肺炎克雷伯菌，采用荚膜血清学检测、毒力基因检测、小鼠致病性试验评估分离株危害，进行药敏试验了解耐药情况，以期为和田地区防控肺炎克雷伯菌提供理论支持。
1材料与方法1.1材料1.1.1病料采集从和田地区某规模化养殖场采集25份具有呼吸道症状病死羊胸腔积液及肺脏组织，将样本进行编号，置于-20℃保存。
1.1.2试验动物40只昆明小白鼠，小鼠体重均在25g 左右。
1.1.3主要试剂普通琼脂、营养肉汤、麦康凯肌酮醇阿东醇羧苄青霉素琼脂（MIAC ）均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；核酸染料、PCR Mix 均购自北京全式金生物技术有限公司；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.1.4药敏纸片药敏纸片批号为20200919，由杭州天和微生物试剂有限公司生产。
1.2方法1.2.1细菌的分离与纯化将25份病死羊胸腔积液及肺脏组织样本划线接种于MIAC 选择性培养基，置于37℃恒温培养箱中培养12~24h ，挑取紫红色、有沉淀环的单菌落接种于麦康凯培养基上，置于收稿日期：2023-02-10作者简介：郭良帅（1998-），男，河南南阳人，在读硕士研究生，研究方向为动物群发性疾病防控，（电话）157****2394（电子信箱）*****************。
微生物肺炎克雷伯
固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过微火三次（手指触摸反面不烫手为宜）疑菌落涂在干净的玻片上自然晾干，用结晶紫（1液）覆盖细菌初染1min，清水冲洗干净玻片再滴加革兰染液（2液）媒染1min，清水冲去表面的染液，用95﹪乙醇（3液）脱洗约30s（以乙醇不再有颜色为好），最后用稀释的复红（4液）复染30s。自然晾干后在显微镜下观察形态。
定科：氧化酶试验（-）、IMViC（- - ++） 定属：KIA（AA+ -）、MIU（- - +）、
O/F（F）、鸟氨酸脱羧酶试验（-）
01
02
I（吲哚）：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚，与对甲基氨基苯甲醛结合，生成红色化合物玫瑰吲哚。主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。 M（甲基红）：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解为甲酸、乙酸等酸性物质，不再继续分解，故培养基pH在4.5以下，加入甲基红指示剂后呈紫红色（阳性）。有些细菌将分解葡萄糖产生的酸进一步转化为醇酮等非酸性物质，使培养基pH在6.2以上，加入甲基红试剂成橘黄色（阴性）。一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。 Vi：某些细菌分解葡萄糖生成丙酮酸，丙酮酸可进一步脱羧生成乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境下被氧化成二乙酰，后者与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基起作用，生成红色胍缩二乙酰，为VP试验阳性。若培养基中胍基含量少，加入少量含胍基的化合物如肌酸肌酐，可加速其反应。一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。 C（枸橼酸盐）枸橼酸盐培养基中不含任何糖类，枸橼酸盐为唯一碳源，磷酸二氢铵为唯一氮源。如果细菌能利用铵盐作为唯一氮源，并能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，在枸橼酸盐培养基上生长，并分解枸橼酸盐为碳酸盐，使培养基变碱，指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色，为枸橼酸盐利用实验阳性。若细菌不能利用枸橼酸盐为碳源，则细菌不能生长，培养基不变色。 back
一种检测牛源肺炎克雷伯菌特异性引物及其方法和应用[发明专利]
![一种检测牛源肺炎克雷伯菌特异性引物及其方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/43d090ea7e192279168884868762caaedd33baae.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910637634.0(22)申请日 2019.07.15(71)申请人 四川农业大学地址 611130 四川省成都市温江区惠民路211号(72)发明人 左之才 张玉龙 才冬杰 苟丽萍 王之盛 谢跃 邹华围 马志宇 叶刚 余树民 钟志军 胡延春 沈留红 (74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理有限公司 11246代理人 张鹏(51)Int.Cl.C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/10(2006.01)C12N 15/11(2006.01)C12R 1/22(2006.01) (54)发明名称一种检测牛源肺炎克雷伯菌特异性引物及其方法和应用(57)摘要本发明公开了一种检测牛源肺炎克雷伯菌特异性引物及其方法和应用，所述的特异性引物如SEQ ID NO.1～2所示，通过提取待测样品基因组DNA，使用上述引物进行PCR扩增，凝胶电泳检测，于凝胶成像系统下拍照检测，存在204bp的DNA特异性条带，则确定样品中含有肺炎克雷伯菌。
采用本发明的检测方法检测肺炎克雷伯菌所需时间短、特异性强、灵敏度较高。
本发明避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、准确性低、检出率低等缺点。
权利要求书1页 说明书4页序列表1页 附图2页CN 110184372 A 2019.08.30C N 110184372A1.一种检测牛源肺炎克雷伯菌特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物如SEQ ID NO.1～2所示。
2.一种检测牛源肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取待测样品基因组DNA；2)使用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；3)凝胶电泳检测，于凝胶成像系统下拍照检测，存在204bp的DNA特异性条带，则确定样品中含有肺炎克雷伯菌。
3.根据权利要求2所述的一种检测牛源肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于，所述的样品基因组利用一管式通用样品DNA抽提试剂盒提取。
新生仔猪感染肺炎克雷伯氏菌的检验报告
可以明显提高畜禽体内T 细胞的含量,增强细胞免疫的效果。
3中草药的优势中草药不仅具有抗菌、抗感染、保健的作用,其中还包含有多种营养物质如蛋白质、氨基酸、糖类、维生素等各种微量元素以及大量的有机酸、植物碱、生物酶、挥发油等多种促进生长的活性物质。
相比抗生素等其他化学合成药物来说,中草药具有纯天然,无污染,毒副作用小以及机体内残留少的优点。
并且随着社会的发展,人们对食品的品质、无公害绿色环保的要求也越来越高。
所以在畜禽养殖方面,改用中草药代替化学药品是符合时代要求的。
同时,中草药还具有来源广泛、价格低廉的显著优势。
并且经过临床实践,中草药在治疗畜禽疾病方面也显现出了明显的治疗及预防效果。
4中草药在兽医临床应用上的展望随着全球对食品安全、绿色养殖、人类健康的话题日益关注,促使研究者们投入更多的精力来提出治疗畜禽类疾病的安全方案。
中草药具有来源广泛、价格低廉、成分天然、机体服用后副作用少、残留少的特点,其治疗疾病的前景越来越被科学家看好。
同时国家加大了中医药的研发力度,对中医药的发展也将投入更多的资金。
如何将现代科技与中草药的研究更加完美的结合,如何促进中草药在兽用药方面实现新的突破与进展,成为了中医药工作者以及兽医工作者所要面临的新挑战。
收稿日期:2016-01-25基金项目:浙江省病理生理学技术研究重点实验室人才引进基金资助项目(F01691134200);宁波大学科研基金项目(XKL14D2106;XYL14021)作者简介:朱彦华(1975-),女,黑龙江绥化人,主管检验技师,主要从事医学检验工作,(电话)138********(电子信箱)942852086@;通信作者,魏华,女,博士,主要从事人与动物病原生物学研究。
宁波大学医学院临床病理学科病理学与病原生物学实验室发现17只新生仔猪在出生2周内死亡,随机选取4只死亡仔猪进行解剖检查以及病原菌的分离与鉴定,在死亡仔猪器官中均分离到肺炎克雷伯氏菌,现将病原菌的分离检验过程报告如下。
肺炎克雷伯氏菌特异性抗原的筛选与鉴定
肺炎克雷伯氏菌特异性抗原的筛选与鉴定李挺;张丽芳;刘星;刘先菊;刘江宁;李万波;林树柱【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2010(020)007【摘要】目的寻找肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)血清学检测用特异性抗原.方法双向电泳分离K.pneumoniae总蛋白,通过免疫印迹(Western blotting)与常见病原菌的多抗反应筛选特异性抗原蛋白,原核表达该蛋白并用ELISA法验证.结果获得K. pneumoniae的双向电泳图谱.寻找Western blotting 中与尼pneumoniae自身多抗反应而不与与其它病原菌多抗反应的蛋白,质谱鉴定为酸性磷酸酶(Acid phosphatase,GI:238894261).经表达纯化并以酶联免疫吸附试验(ELISA)验证,证明该蛋白作为包被抗原的灵敏度高,特异性强.结论K.pneumoniae酸性磷酸酶是适用于该菌感染检测特异性抗原蛋白.【总页数】6页(P21-26)【作者】李挺;张丽芳;刘星;刘先菊;刘江宁;李万波;林树柱【作者单位】北京协和医学院中国医学科学院实验动物研究所,国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室,北京,100021;北京协和医学院中国医学科学院实验动物研究所,国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室,北京,100021;北京协和医学院中国医学科学院实验动物研究所,国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室,北京,100021;北京协和医学院中国医学科学院实验动物研究所,国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室,北京,100021;北京协和医学院中国医学科学院实验动物研究所,国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室,北京,100021;北京协和医学院中国医学科学院实验动物研究所,国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室,北京,100021;北京协和医学院中国医学科学院实验动物研究所,国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室,北京,100021【正文语种】中文【中图分类】Q939.91【相关文献】1.肺炎克雷伯氏菌VBNC状态转化突变株的筛选与特性研究 [J], 沈菊;胡章立;黎双飞2.猴B病毒囊膜蛋白gB特异性抗原表位的筛选与表达鉴定 [J], 张小飞;叶华虎;赵彦斌;王冬平;赵洪卫;白杰英3.合成2,3-丁二醇的肺炎克雷伯氏菌菌株的筛选及改造 [J], 郭睿;曹春振;李娜;葛菁萍4.貂源肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定 [J], 许皓;刘建荣;王力欣;栾杨;任飞;王峥;丁尚红5.猪囊尾蚴特异性抗原的筛选、鉴定和生物信息学分析 [J], 方文;包怀恩;肖靓靓;牟荣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
鲤鱼肺炎克雷伯氏菌分离与鉴定
鲤鱼肺炎克雷伯氏菌分离与鉴定卢玉婷;郑丹丹;胡扬扬;张雅斌;张培军;李月红;冷东泽【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2014(000)009【摘要】初步了解肺炎克雷伯氏菌在鲤鱼鱼体中的发病机制并筛选防治药物，为预防和治疗该病提供准确实验数据。
对发病鲤鱼进行细菌分离纯化，通过革兰氏染色反应，生理生化反应测定单菌落特性，进行细菌回归试验和药敏试验。
对注射菌液后发病的鱼进行细菌再分离，得到革兰氏阴性菌，并且与七叶苷及其它17种指标反应呈阳性，与戊二酰-甘氨酸-精氨酸-AMC及其它11种指标反应呈阴性，注射该菌液48 h后鱼体出现与疑似病例相同病症。
分离得到的细菌，按《伯杰氏细菌鉴定手册》进行鉴定，确定为肺炎克雷伯氏菌。
药敏试验结果表明该菌对亚胺培南等6种药物高度敏感。
本试验首次从鲤鱼体内分离出肺炎克雷伯氏菌，并得到6种高度敏感的药物，同时阐明了肺炎克雷伯氏菌在鲤鱼中发病症状。
%This experiment was to study the characteristics and types of the pathogenic bacteria in the sick carp, which could preliminarily understand the pathogenesis and the screening of drug about Klebsiella pneumoniae in carp . This experiment first separated and purified single colonies from the onset of carp and the bacteria were done the Gram stain experiment. With various physiological and biochemical reacting, the experiment determined characteristics of the single colony bacterial and then did the regression experiment. Followed by drug sensitivity test,the experiment would separate the bacteria from fish who had injected bacteria liquid. Theresult was that this bacteria were gram negative . The purified bacteria were reacted with esculin and other 17 kinds of indexs, and they were positive reaction;while they were negative reaction with Glutary-Glycine-Arginine-AMC and other 11 kinds of indexs. The regression experiment proved that the fish injected the bacteria liquid and appeared thesame disease. The results of drug sensitivity test was that the bacteria were highly sensitive to Imipenem and other 6 kinds ofdrugs.Then physicochemical properties of the bacteria isolated from bacteria experi ment were the same. According to Berger’ s Bacterial Identification Manual, the bacteria were Klebsiella pneumoniae. Summarize the above results, we conclude that this test determined that the bacterium was Klebsiella pneumoniae, as well as drug sensitivity identified some kinds of drugs which were highly sensitive to the bacterium. This study provides the reliable theory basis and data for the treatment and prevention of the carp’ s diseases caused by bacteria.【总页数】5页(P9-13)【作者】卢玉婷;郑丹丹;胡扬扬;张雅斌;张培军;李月红;冷东泽【作者单位】吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118;吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118;吉林省水产科学研究院，长春130000;吉林省卫生监测检验中心，长春130000;吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118【正文语种】中文【中图分类】S852.61【相关文献】1.蟒蛇肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定 [J], 郭桂英;李祥;黎丹;廖承红;杨诺;曾纪峰;郑继平;张立领;余集楠2.一株可降解孔雀石绿的肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定 [J], 李媛;张立强3.羊源肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定 [J], 谢宇舟;吴翠兰;李军;陶立;李常挺;彭昊;马春霞;潘艳4.流产奶牛胎儿肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定 [J], 叶勇刚;廖党金;张明国;康润民;肖璐;谢晶;曹冶;张涛5.貂源肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定 [J], 许皓;刘建荣;王力欣;栾杨;任飞;王峥;丁尚红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌基因检测流程
耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌基因检测流程下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by the editor. I hope that after you download them, they can help yousolve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts,other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）是一种对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的细菌，近年来在医院感染中逐渐成为一个严重问题。
肺炎克雷伯杆菌的分离鉴定及超广谱β内酰胺酶的检测
肺炎克雷伯杆菌的分离鉴定及超广谱β-内酰胺酶的检测【摘要】目的在肺炎克雷伯杆菌进行分离鉴定的基础上，探讨该菌产生超广谱β-内酰胺酶的情况，为临床合理用药提供依据。
方法用肠杆菌科细菌生化编码鉴定管对分离后103株肺炎克雷伯杆菌进行鉴定，采用头孢噻肟和头孢噻肟/棒酸、头孢他啶和头孢他啶/棒酸检测超广谱β-内酰胺酶。
结果在103株肺炎克雷伯杆菌中，26株检测出超广谱β-内酰胺酶，检出率达25.2%。
结论该地区产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯杆菌分离率较高。
【关键词】肺炎克雷伯杆菌；超广谱β-内酰胺酶Isolation and identification of Klebsiella pneumoniae from infectious specimens and detection of extended-spectrum β-lactamase producing strains【Abstract】 Objective To investigate the production of extended-spectrum β-lactamase (ESBL) in Klebsiella pneumoniae. Methods One hundred and three strains of Klebsiella pneumoniae were identified by Enterobacteriaceae biological chemistry kit，ESBL-producing strains were examined by cefotaxime、cefotaxime/clavulanate,cetazidine、cetazidine/clavulanate. Results 26 strains of ESBL production were found, the resistant rate of Klebsiella pneumoniae reached as high as 25.2%.Conclusion The isolation rate of ESBL producingKlebsiella pneumoniae is significantly high.【Key words】Klebsiella pneumoniae; super-extended-spectrum β-lactamase肺炎克雷伯杆菌是医院内感染和社区感染的重要病原菌［1］。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
（ 京 协 和 医 学 院 中 国 医学 科 学 院 实 验 动 物研 究所 ， 北 国家 中 医药 管 理 局 人 类 疾 病 动 物模 型 三 级 实 验 室 ， 京 北 １０ ２ ） ０ ０ １
身 多抗 反 应 而 不 与 与 其 它 病 原 菌 多抗 反 应 的 蛋 白 ， 谱 鉴 定 为 酸 性 磷 酸 酶 （ ｃ ｈｓｈｔｓ ， Ｉ ２ ８ ９ ２ １ 。经 质 Ａ ｉ ｐ ｏｐ ａ ｅ Ｇ ： ３ ８４ ６ ） ｄ ａ 表 达 纯 化 并 以酶 联 免 疫 吸 附 试 验 （ ＬＳ 验 证 ， 明 该 蛋 白 作 为 包 被 抗 原 的 灵 敏 度 高 ， 异 性 强 。结 论 Ｅ ＩＡ） 证 特 ｐ ｅｍ ｎａ 酸 性 磷 酸 酶 是 适 用 于该 菌感 染 检 测 特 异性 抗 原 蛋 白 。 ｎｕ ｏｉｅ
ｐ ｕｍｏ ｉ ｅ ｂ ｔｕｎ ｅ ｃｔｄ ｔ ｏｈｅ ｎｅ ｎ ａ ｕ ｒ ａ ｅ ｏ ｔ ｒｐＡｂ ｎ ｓ ｉ Ｗ ｅ ｔｒ ｏｔｎｇ ｗａ ｉ ｎｉ ｅ ｂ ｓ ｓ ｃｒ ｍｅｒ ｏ ｅ ｃｄ ｐｈ ｓ ｈａａ ｅ ｓｅｎ ｂｌｔｉ ｓ ｄｅ ｔｆ ｄ ｙ ｍａ ｓ ｐｅ ｔｏ ｔ ｔ ｂ ａ ｉ ｏ ｐ ｔｓ ｉ ｙ
ａｎｉ ｏ ｉ ｓｏ ｏ ｔｂ ｄ ｅ ｆｃ ｍｍｏ ａ ｈ ｇ ｎｃ ｂ ｃｅ ｉ ｙ ｗｅ ｔ ｒ ｏｔｎ ｎ ｐ ｔ ｏ ｅ ｉ ａ ｔｒａ ｂ ｓｅ ｎ ｂｌｔｉｇ． Ｔｈ ｓ ｅ ｉ ｃ ｎｉ ｅ ｓ ｓ ｌｃ ｅ ｅ ｐ ｃｆ ａ ｔｇ ｎ ｗａ ｅｅ ｔｄ， ｅ ｐ ｅ ｓ ｄ ｉ ｉ ｘ ｒ ｓ ｅ ｎ Ｅ．ｃ ｌ ｎｄ ｏ ｉａ
Ｌ ｉｇ ＩＴ ｎ ，ＺＨＡＮＧ Ｌ— ｎ ，ＬＵ Ｘｉｇ Ｉ ａ － ｉｆ ｇ Ｉ ｎ ，Ｌ Ｕ Ｘｉｎｊ ａ ｕ，Ｌ Ｕ Ｊａ ｇｎｎ Ｉ ｉｎ —ｉｇ，Ｌ ｎ ｂ ＩＷａ —ｏ，Ｌ Ｎ Ｓ ｕｚ ｕ Ｉ ｈ ・ｈ
（ ｅ ａ ｏａ ｒ ｏ ｕ ｎＤ ｓａｅ ｎ ｌ ｄ ｌ Ｓａ ｄ ｉｉ ｒｔ ｎｏ ｒｄｔ ｎ ｌ ｈｎ ｓ ｄ ｉｅ ｎｔ ｕ ｆ Ｋ ｙＬ ｂ ｒｔ ｙ ｆ ｍａ ｉ ｓｓＡ ｉ ｅ ， ｔｔ Ａ ｍ ｎｓ ａ ｏ ｆ ａ ｉｏ ａ Ｃ ｉ ｅＭｅ ｉ ｎ ，Ｉｓ ｔｔ ｏ ｏ Ｈ ｅ ｍａ Ｍｏ ｅ ｔ ｉ Ｔ ｉ ｅ ｃ ｉ ｅ Ｌ ｂ ｒｔ ｎｍ ｌ ｃ ｎ ｅ ，Ｐ ｋｎ ｎｏ ｅ ｉ ｌ ｏ ｅｅ（ Ｕ ）ａ ｄＣ ｉｅｅＡ ａ ｅ ｙ ｏ Ｍｅ ｉａ ａ ｏａ ｒ Ａ ｉ ａ Ｓ ｉ ｃ ｓ ｅ ｉ Ｕ ｉ Ｍ ｄｃ ｌ ｇ Ｐ ＭＣ ｎ ｈ ｓ ｃ ｄ ｍ ｆ ｄｃｌ ｏ ｙ ｅ ｇ ｎ ａＣ ｌ ｎ Ｓ ｉ ｃ ｓ（ Ａ ） Ｂ ｉ ｎ ０ ０ １ ｈｎ ） ｃ ｎ ｅ Ｃ ＭＳ ， ｅ ｉｇ１ ０ ２ ，Ｃ ｉ ｅ ｊ ａ
２１ ０ ０年 ７月
中 国 比 较 医 学 杂 志
ＣＨＩ ＮＥＳ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＯＭＰ ＥＪ ＡＲＡＴ ＶＥ ＭＥＤＩ ＮＥ Ｉ ＣＩ
Ｊｌ ｕ ｙ，２ ０ ０１
Ｖ０ ＿ ０ Ｎ ． ｌ２ ｏ ７
第２ ０卷
第 ７期
肺炎克雷伯 氏菌特异性抗原 的筛选 与鉴定
【 关键词 】 小 鼠； 检测 ； 特异性抗原 ； 双向电泳 ； 免疫 印迹 ；酶联免疫吸附试验 （ ＬＳ Ｅ ＩＡ）
【 中图分 类号】Ｑ ３ ． １ ９ ９ ９
【 文献标识码】Ａ
【 文章编号】１７ —８６ ２ １ ）７０ ２ －６ ６ห้องสมุดไป่ตู้１７ ５ （０ ０ ０ －０ １ ０
Ｉ ｅ ｉ ｃ ｔｏ ｆ Ｓ ｃ ｆｃ Ｄｉ ｇ ｓｉ ｄ ｎｔｆ ａ ｉ ｎ ｏ ｐｅ ｉ ａ ｎｏ ｔｃ Ａｎｔｇ ｎ ｆ ｒ Ｋｌ ｂ ｉ ｌ ｉ ｉ ｉ ｅ ｏ ｅ ｓ ｅ ｌ ｐｎｅ ｍ ｏ ｉ ｅ ａ ｕ ｎａ
Ｍ ｅｈ ｄ Ｔ ｔｌｐｏｅｎ ｏ ｔｏ ｓ ｏａ ｒｔｉ ｆ Ｋ．ｐ ｅ ｍｏ ｉｅｗａ ｅ ａａｅ ｙｔ —ｉ ｎｉｎｅｅ ｔ ｐ ｏｅｉ（ ＤＥ），ｒａｔ ｇｗｔ ｏｙ ｌｎ ｌ ｎ ｕ ｎａ ｓｓｐ ｒｔｄｂ ｗｏｄｍｅ ｓｏ ｌｃｒ ｈ ｒｓｓ ２ ｏ ｅ ｃｉ ｉ ｐ ｌｃｏ ａ ｎ ｈ
【 摘要 】 目的
寻找肺 炎克雷伯 氏菌 （ ｌ ｓ ｌ ｎｕ ｎ ｅ 血清学检测用特异性抗原 。方法 Ｋｅ ｉｌ ｐ ｅｍｏｉ ） ｂ ｅａ ａ
双 向电泳分离
Ｋ ｐ ｅｍ ｎａ ． ｎｕ ｏ ｉ ｅ总蛋 白 ， 过 免 疫 印迹 （ ｓ ｒ ｌｔｎ ） 常 见 病 原 菌 的 多 抗 反 应 筛 选 特 异 性 抗 原 蛋 白 ， 核 表 达该 通 Ｗｅｔ ｎｂｏ ｉｇ 与 ｅ ｔ 原 蛋 白并 用 Ｅ ＩＡ法 验 证 。结 果 ＬＳ 获 得 Ｋ ｎｕ ｏ ｉ 的 双 向 电泳 图谱 。寻 找 Ｗｅｔｒ ｂｏ ｉｇ中与 Ｋ ｐ ｅｍｏｉ ．ｐ ｅｍ ｎａ ｅ ｓ ｎ ｌｔ ｅ ｔｎ ． ｎｕ ｎａ ｅ自
【 ｂ ｔ ｃ】 ｏ ｊｃｉｅ Ｔ ｉ ｏｅ ｎｖｌ ｎｉ ｎ ｆ ｌ ｓ ｌ ｎｕ ｏｉｅｆ ｓ ｂｉ ｉｇｓｒｌｇ ａ ａｓｙ． Ａ ｓ ａｔ ｂｅｔ ｏｄｓ ｖｒ ｏｅ ａｔ ｅ ｓｏ ｅ ｉｌ ｐ ｅｍ ｎａ ｏ ｅｔ ｌｈｎ ｅｏ ｉ ｌ ｓ ｓ ｒ ｖ ｃ ｇ Ｋ ｂ ｅａ ｒ ａ ｓ ｏ ｃ ａ
ｔ ｅ ｖ ｌ ａ ｅ ｙ ＥＬＩ ｈ ｎ ｅ ａｕ ｔ ｄ ｂ ＳＡ． Ｒｅ ｕｌｓ ２ＤＥ ｍａ ｆ ｓ ｔ ｐｏ
ｐｎ ｕ ｎｉｅ ｗａ ｂ ａ ｎ ｄ．Ｔｈ ｒ ｔｉ ｐｏ ｈａ ｅ ｃｅ ｏｐＡｂ ｆＫ． ｅ ｍｏ ａ ｓｏ ｔ ｉ ｅ ｅ ｐ ｏｅｎ ｓ ｔｔ ｔｒ ａ ｔｄ ｔ ｓｏ