一个新的锌指蛋白基因ZNF333cDNA的分离及表达谱分析_田勇
水稻PHD锌指蛋白cDNA的克隆及其表达分析
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ｅ ｌ ｒ ａ ｍｅ ＲＴ Ｐ Ｒ ｈ ｗｅ ｈ ｔｔｅ Ｐ ｉ ｔ － Ｃ ｓ ｏ ｄｔ ａ ＨＤ－ ｎ ｅ ｒ ｔ ｉ ｓ ａｓ ｎ ｕ ｅ ｙ Ｃ ｍｅ ｉａ ￣． ｕ ｇ ｓｉ ｇ ｔｅ ｉ ｖ ｌｅ ｎ ｅ ｅ ｃ ａ — ｈ ｉ ｆ ｇ ｒ ｏ ｅｎ ｗａ ｌｏ ｉ ｄ ｃ ｄ ｂ ． ｄ ｎ ｌ ｓ ｇ ｅ ｔ ｎ ｏｖ ｍｅ ｔｉ ｄ ｆ ｎ ｅｒ ｃ ｐ ｎ ｈ ｎ ｅ
ｌ ｙＲＴ Ｐ ｆ ｄ ｂ － ＣＲ， ｈ ｏｒ ｓ ｎ ｎ ｍｉ ｏａ ｉ ｓｓ ｑ ｅ ｃ ｈ ｒ ｓ９ ． ３ ， ６． １ ， ４ ５ ％ ， ７ ０ ％ ， ７ ５ ％ ａ ｄ５ ． ８ ｈ － ｅ ｔ ｅ ｃ ｒ ｐ ｄ ｇ ａ ｎ ｃ ｄ ｅ ｕ ｎ ｅ ｓ ａｅ ８ ４ ％ ８ ０ ％ ５ ． ８ ｅｏ ｉ ５ ．２ ５ ．１ ｎ ５８ ％ ｏ
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｄ ｓｒ ｃ ：ｅ ＮＡ— Ｌ ａ ｐ ｌ ｄ ｔ ｓ ｌｙ ｔ ｅ ｄ ｆ ｒ ｎ ａｌ ｘ ｒ ｓｅ ｅ ｅ ｎ ｒｃ ｎ ｉ ｎ ｈ ｉ ３ ａ ａｎ ｔＣ ａ ｈ ｌｃ ｏ ｉ ＡＦ Ｐ Ｗ Ｓ ａ ｐｉ ｏ ｄ ｐ ａ ｈ ｅｅ ｔ ｌ ｅ ｐ ｅ ｓ ｄ ｇ ｎ ｓ ｉ ｉｅ Ｉ ｄ ｃ Ｍｉ ｇ ｕ ｇ ｉｓ ｎ ｐ ａ ｏ ｒｃｓ ｅ ｉ ｉ ｉ ｙ ａ ６
锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用
。 该项技术已经被成功用于动植物基
因改造实验中 , 研究者根据靶 DNA 序列设计特异性 的锌指蛋白 , 然后用锌指蛋白核酸酶 (Zinc finger
收稿日期 : 201007; 修回日期 : 20101107 基金项目 : 国家转基因重大专项与教育部创新团队项目 ( 编号： IRT0831)资助 作者简介 : 钟强 , 博士 , 研究方向：生物信息学。 E-mail: zqiang320@ 通讯作者 : 赵书红 , 教授 , 博士 , 研究方向：动物分子生物学与育种。 E-mail: shzhao@
HEREDITAS (ຫໍສະໝຸດ eijing) 2011 年 2 月 , 33(2): 123― 130 ISSN 0253-9772
综述
DOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.00123
锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用
钟强 , 赵书红
华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室 , 农业部猪遗传育种重点开放实验室 , 武汉 430070
Keywords: zinc finger domain; zinc finger protein; zinc finger nucleases; homologous recombination; gene targeting
锌指蛋白核酸酶是人工改造的蛋白 , 它利用了 锌指结构域对 DNA 序列的特异性识别来达到准确 定位靶点的目的 , 同时利用核酸酶的 DNA 水解活性 , 使靶 DNA 双链断裂 , 然后利用细胞的修复机制 , 引 入基因突变
摘要: 锌指蛋白核酸酶 (Zinc finger nucleases, ZFN) 因其能特异性识别并切割 DNA 序列以及可设计性 , 被
一个新的锌指蛋白基因ZNF333 cDNA的分离及表达谱分析
关键词 ： 锌指蛋白 ； 隆； Ｒ Ｂ 克 Ｋ Ａ
中 圈分 类 号 ： ７５ ７６ Ｑ ８ ；Ｑ ８ 文 献 标 识 码 ： Ａ
的锌指 蛋 白基 因 ， 国际人 类 基 因命 名委 员会 （ Ｇ Ｃ ＨＮ）
按 照 Ｓ Ｒ Ｅ Ｄ Ａ ｌ ｒｒ ｃｎｔ ｃｏ ｉ ＭＡ Ｔ Ｐ Ｒ ｅ Ｎ ｉ ａ ｏｓ ｕｔｎ Ｋｔ ｂ ｙ ｒ ｉ
（，ｎｅｈＬｂｒ ｏ ， ｎ ．Ｃ 说 明书 采 用 治疗 性人 Ｃ ｔ ａｏ ｔｒ Ｉｃ Ａ） ｌ ｅ ｏ ａ ｙ
收集人 外周 血 淋 巴细胞 ， ｔｚｌ ｇｎ（ ｒｍ ｇ ） 按 ｄ ｏ ａｅ ｔＰｏ ｅａ 试剂 盒说 明书提 取 Ｒ Ａ并逆 转 录合 成 ｅ Ｎ Ｎ Ｄ Ａ，分别 对 于信息 学 分 析 阳性 的基 因组 区段 设 计 引物 进 行 Ｐ Ｒ扩 增 ， 有 扩 增 阳 性 的 Ｐ Ｒ 产 物 均 使 用 Ａ Ｉ Ｃ 所 Ｃ Ｂ Ｐ ＩＭ ３ ７Ｄ Ａ 自动 测 序 仪 （ ｅ ｉ ｌ ｅ Ｉｃ 进 行 ＲＳ ７ Ｎ Ｐ ｒ ｎ Ｅｍ ｒ ｎ ） ｋ
Ｇ Ｇ Ｔ Ｔ Ａ Ｔ Ｇ Ｔ Ｔ ’ 。同时按 照说 明书 合 成 Ａ Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ Ｆ３ ）
田 勇 ，赵 红珊 ，陈冀榛 ，刘雅 萍，李 明月，橱 涛 ，罗会 元 ， 尚志 黄
（ 国 医 学科 学 院 中 国协 和 医科 大学 基 础 医 学研 究 所 医学 遗 传 宣 ，北 京 １００ ） 中 ００５
摘要： 本研究通过生 物信 息学 和 分子 生物 学 相结 台 的方 法成 功克 隆 了一 个新 的锌 指蛋 白基 因 Ｚ Ｆ ３ ｅＮ 。 Ｎ ３３ Ｄ Ａ
普通白菜C3H_类锌指蛋白基因家族鉴定及表达分析
Identification and Expression Analysis of C3H Zinc Finger Protein Gene Family in Brassica campestris ssp .chinensisTIAN Wen-jie 1，2，HOU Rui-ze 2，DU Ze-guang 2，LI Gai-zhen 2，HOU Lei-ping 2，LI Mei-lan 2*（1.Quwo Wisdom Vegetable Valley Development and Service Center of Shanxi Province ，Quwo 043400，China ；2.Shanxi Agricultural University ，Taigu 030801，China ）Abstract ：CCCH （C3H ）zinc finger protein is a protein that can recognize and bind RNA ，playing an impor-tant role in plant growth ，development ，and stress response.In order to understand the characteristics of the C3H zinc finger protein family in Brassica campestris ssp.chinensis ，by comparing the database of the C3H zinc finger protein members of Arabidopsis thaliana with B.campestris ssp.chinensis ，the members of the C3H zinc finger protein family in B.campestris ssp.chinensis were identified ，and their protein physicochemical properties ，phylogenetic evolution ，chromosome distribution ，and expression patterns at different stages of flower bud differentiation were analyzed.The results showed that a total of 84members of the C3H zinc finger protein family in B.campestris ssp.chinensis were identified ，named BrcC3H1-84according to their chromosomal order.These members were unevenly distributed on 10chromosomes ，with the highest distribution on chromosome 3，with15members.The analysis of protein physicochemical properties showed that the number of amino acids encoded by this family member was 156-1542，with a theoretical isoelectric point of 4.96-10.84.By constructing a phylo-genetic tree ，these family members could be divided into three subgroups ，with significant differences in genestructure and conserved motifs among each subgroup.Different C3H models may be important factors leadingto differences.The gene structure analysis showed thatmost BrcC3H members contain 1or 7CDS.By analyz-ing the expression patterns of BrcC3H members at dif ferent stages of flower bud differentiation of B.campestris ssp.chinensis through transcriptome data ，it was found that 21BrcC3H genes highly expressed during the摘要：植物CCCH （C3H ）锌指蛋白是一种可识别并结合RNA 的蛋白，在植物生长发育、胁迫响应中发挥重要作用。
一个新的水稻C2H2型锌指蛋白cDNA的克隆与序列分析
⼀个新的⽔稻C2H2型锌指蛋⽩cDNA的克隆与序列分析⼀个新的⽔稻C2H 2型锌指蛋⽩cD NA 的克隆与序列分析黄骥1,张红⽣13,曹雅君1,王东1,王建飞1,杨⾦⽔2(1南京农业⼤学作物遗传与种质创新国家重点实验室,江苏南京210095;2复旦⼤学遗传所,上海200433)中图分类号:S60314 ⽂献标识码:A ⽂章编号:1000Ο2030(2002)02Ο0110Ο03Cloning and sequence analysis of a ne w novel C2H 2zincfinger cD NA from rice (Oryza sativa L.)H UANGJi 1,ZH ANG H ong 2sheng 13,C AO Y a 2jun 1,W ANG Dong 1,W ANGJian 2fei 1,Y ANGJin 2shui 2(1.National K ey Lab of Crop G enetics and G erm plasm Enhancement ,Nanjing Agric Univ ,Nanjing 210095,China ; 2.Institute of G enetics ,Fudan Univ ,Shanghai 200433,China )锌指蛋⽩(zinc finger protein )是⼀类具有“⼿指状”结构域的转录因⼦,负责调控基因的表达。
锌指蛋⽩主要通过与核酸的相互作⽤,显⽰出不同的功能,如促进转录、抑制转录、单链DNA 结合、RNA 结合或RNA/DNA 双向结合[1]等。
Cys2/His2型锌指(也称TF ⅢA 型)是真核⽣物的转录因⼦中结构描述的最为清楚的转录因⼦,其锌指区为CX 2-4CX 3FX 5LX 2HX 3-5H 的结构[2]。
植物中⽬前已经克隆了⼀些C2H2型锌指蛋⽩基因,其中很多锌指区具有QA LGGH 的保守区,如与拟南芥花发育相关的S U2PERM AN [3],与⼩麦组蛋⽩H3与H4基因启动⼦区域专⼀性结合的WZF1[4],拟南芥和棉花中报道的耐盐锌指蛋⽩STZ [5]和CSTZ [6],⼤⾖中报道的冷诱导蛋⽩SC OF 21[7]等。
一种锌指蛋白基因的新用途[发明专利]
![一种锌指蛋白基因的新用途[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/7cb73aade45c3b3566ec8bc5.png)
专利名称：一种锌指蛋白基因的新用途专利类型：发明专利
发明人：谢旗,赖建彬,夏然
申请号：CN200810225513.7
申请日：20081103
公开号：CN101724634A
公开日：
20100609
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种锌指蛋白基因的新用途。
锌指蛋白基因即编码序列表中序列1所示蛋白的基因的新用途是在培育抗双生病毒植物中的应用。
培育抗双生病毒的植物的方法，是将植物中编码序列表中序列1所示蛋白的基因灭活，获得抗双生病毒的植物。
灭活该基因的突变体对病毒侵染的敏感性降低，对农业生产具有重要的意义。
申请人：中国科学院遗传与发育生物学研究所
地址：100080 北京市海淀区中关村南一条3号
国籍：CN
代理机构：北京纪凯知识产权代理有限公司
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一种寻找基因组中锌指蛋白靶标位点的新方法[发明专利]
![一种寻找基因组中锌指蛋白靶标位点的新方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/70f4803fc1c708a1294a447e.png)
专利名称：一种寻找基因组中锌指蛋白靶标位点的新方法专利类型：发明专利
发明人：王方海,程中山
申请号：CN201610014607.4
申请日：20160111
公开号：CN105701363A
公开日：
20160622
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种寻找基因组中锌指蛋白靶标位点的新方法。
本发明首先将能与锌指蛋白结合且结合率大于2的所有9个核苷酸序列建成一个库，然后设计一个程序在基因组中寻找在双链中间隔一段距离存在的一对与库中对应的9个核苷酸序列，即得到相应的锌指蛋白靶标位点。
与传统方法相比，以此方法构建的锌指蛋白不需要检测筛选就可直接应用，这样大大简化实验程序，节约成本，提高效率。
申请人：中山大学
地址：510275 广东省广州市海珠区新港西路135号
国籍：CN
代理机构：广州粤高专利商标代理有限公司
代理人：陈卫
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锌指蛋白结构域MIZ-1型包含蛋白基因研究进展
锌指蛋白结构域MIZ-1型包含蛋白基因研究进展李璐璐;孙勇虎;刘红【摘要】锌指蛋白结构域MIZ-1型包含蛋白基因是激活的STAT蛋白抑制剂基因家族中的一员,主要表达于原始T淋巴细胞和性腺等,对免疫系统及性腺的发育具有非常重要的作用.随着全基因组关联技术的应用,多项研究发现该基因与多种自身免疫性皮肤病、皮肤肿瘤及某些自身免疫性疾病的发病显著相关.本文针对MIZ-1型包含蛋白基因的结构、功能及与疾病的关系予以综述.【期刊名称】《中国麻风皮肤病杂志》【年(卷),期】2018(034)008【总页数】4页(P502-505)【关键词】ZMIZ1基因;自身免疫;性腺;肿瘤【作者】李璐璐;孙勇虎;刘红【作者单位】济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院,山东济南,250022;山东省皮肤病性病防治研究所,山东济南,250022;山东省皮肤病性病防治研究所,山东济南,250022;山东省皮肤病性病防治研究所,山东济南,250022【正文语种】中文锌指蛋白(zinc finger protein, ZFP)结构域由多个锌指(zinc finger，ZF)串联构成，可特异识别并结合DNA,介导蛋白质与核酸、小分子或其他蛋白质的特异性相互作用，在基因表达调控和细胞分化等方面起重要作用[1]。
编码ZFP的基因区域在真核生物基因组中分布最广，在人类基因组中有近1%的序列编码含有ZFP结构域。
ZMIZ1最早由Sun等[2]发现并命名，通过编码PIAS家族蛋白，调节多种转录调控因子的活性，包括雄激素受体(AR)[2]、Smad3/Smad4[3]、P53[4]等。
1 ZMIZ1的结构ZMIZ1基因位于染色体10q22.3上,共7546个碱基对，其中包括25个外显子(含21个编码外显子)，编码蛋白由1067个氨基酸组成[2]。
ZMIZ1基因编码ZMIZ1蛋白，包括一个位于中心区域的高度保守的MIZ锌指蛋白结构域，一个核定位信号区域(NLS)和两个富含辅氨酸的区域(Pro Rich)(图1)。
利用锌指基序的保守性从人脑组织分离新的C_2H_2型锌指蛋白基因表达序列
利用锌指基序的保守性从人脑组织分离新的C_2H_2型锌指蛋白基因表达序列孙喜元;余龙;吴国俊;范玉新;郑其平;胡培蓉;张民;江萤;刘澍;许月芳;赵寿元【期刊名称】《实验生物学报》【年(卷),期】1998(31)4【摘要】本文利用锌指基序的保守性设计引物,在低严谨条件下扩增人基因组总DNA,获得8个长度呈梯度的PCR扩增产物电泳条带。
取其中第2和第3电泳条带,回收DNA片段并将它们克隆,经测序和查新比较,共获得60个含有锌指蛋白基因基序的单一的序列,其中23个为新的锌指蛋白基因DNA片段。
以它们为探针,杂交筛选人脑组织cDNA文库,得到初筛cD-NA克隆44个。
对其中28个初筛cDNA克隆进行复筛之后,得到20个cDNA单克隆。
对这些阳性克隆进行测序,读出18个含有锌指蛋白基因基序的序列,国际联网查新之后,证明其中16个是新的锌指蛋白基因片段。
这些新的锌指蛋白基因片段为今后克隆有意义的全长锌指蛋白cDNA提供了重要的实验材料。
【总页数】6页(P377-382)【关键词】人;C2H2型锌指蛋白;基因;表达序列【作者】孙喜元;余龙;吴国俊;范玉新;郑其平;胡培蓉;张民;江萤;刘澍;许月芳;赵寿元【作者单位】遗传工程国家重点实验室,复旦大学遗传学研究所【正文语种】中文【中图分类】Q523;Q987【相关文献】1.一个新的锌指蛋白基因ZNF333 cDNA的分离及表达谱分析 [J], 田勇;赵红珊;陈冀榛;刘雅萍;李明月;杨涛;罗会元;黄尚志2.水稻单C_2H_2型锌指基因ZOS2-01的表达与功能分析 [J], 刁志娟;段远霖;赵粉;李生平;吴为人3.利用锌指基序的保守性从人脑组织分离新的C2H2型锌指蛋白基因表达… [J], 孙喜元;余龙4.一个新C_2H_2型锌指蛋白的功能的初步研究 [J], 吴海;戴建凉;吴超群;应康;谢毅;和桂芬;陈菊祥5.沙冬青GATA型锌指蛋白基因序列及表达分析 [J], 史军娜;刘美芹;师静;王艳萍;智冠华;陈玉珍;卢存福因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
植物ZnF-AN1家族的进化与表达分析及部分基因的功能初探的开题报告
植物ZnF-AN1家族的进化与表达分析及部分基因的
功能初探的开题报告
一、研究背景和意义
锌指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）是一类广泛存在于生物界各
种生物体中的蛋白质家族，具有多种生物学功能。
其中，植物中最为广
泛的族群便是ZnF-AN1家族。
已有研究表明，该家族基因在植物生长发育、激素信号转导、环境胁迫等各个方面都发挥了重要作用，但其调节
机理和功能仍需深入探究。
本研究旨在通过对植物ZnF-AN1家族的进化和表达分析，以及对部
分基因功能的初探，进一步揭示该家族基因在植物生长发育和环境适应
中的作用及其相关机制，为深入研究植物基因功能及植物优化育种提供
理论参考。
二、研究内容和方法
1. 分析植物ZnF-AN1家族基因在进化过程中的变化和特征。
通过对不同植物物种中的ZnF-AN1家族基因进行比较分析，探讨它们的起源、
进化过程和群体分化等变化特征。
2. 对不同生长阶段和组织中ZnF-AN1家族基因的表达模式进行分析。
采用定量PCR方法，检测植物不同阶段和组织中ZnF-AN1家族基因的表达水平，探讨其在植物生长发育过程中的作用。
3. 研究部分ZnF-AN1家族基因的功能。
通过构建基因克隆表达载体并通过遗传转化技术将其导入目标植物中，探索该家族基因的功能。
三、预期成果和意义
通过对植物ZnF-AN1家族基因的进化和表达分析以及功能初探，本
研究将揭示该家族基因在植物生长发育和环境适应中的作用及其调节机
制，对深入了解植物基因功能、发掘重要的生物信号调控因子以及植物的优化育种具有重要的理论和实际意义。
ZFN（锌指核酸酶）技术简介
ZFN（锌指核酸酶）1.什么是锌指核酸酶锌指核糖核酸酶（ZFNs）由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。
DNA 识别域是由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（Zinc-fingers）串联组成（一般 3-4 个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。
锌指蛋白源自转录调控因子家族（transcrip tion factor family），在真核生物中从酵母到人类广泛存在，形成alpha-beta-beta二级结构。
单个锌指的alpha螺旋插入DNA 双螺旋的大沟, 特异性识别DNA 序列上3个连续碱基, 并与之结合. 从A螺旋开始的- 1、2、3、6 相应位置的氨基酸残基与DNA 相互作用, 形成对位点识别的特异性。
图一锌指的空间结构现已公布的从自然界筛选的和人工突变的具有高特异性的锌指蛋白可以识别所有的GNN和ANN以及部分CNN和TNN三联体。
多个锌指蛋白可以串联起来形成一个锌指蛋白组识别一段特异的碱基序列，具有很强的特异性和可塑性，很适合用于设计锌指核酸酶（ZFNs）。
与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域(Kim et al., 1996)。
FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只在二聚体状态时才有酶切活性(Kim et al., 1994)，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时（6-8 bp），两个单体ZFN相互作用产生酶切功能。
从而达到DNA 定点剪切的目的。
图2 ZFNs识别结合特异序列示意图2.锌指核酸酶有什么用ZFNs有助于建立完整的基因knockout和knock-in体细胞，胚胎细胞，原代细胞系，从而使研究者能更精确鉴定基因的生物功能。
ZFN介导的基因组编辑，有望用于产生新的能更接近地模仿人类疾病的疾病动物模型，以及为新的药物化合物潜在毒性提供更多真实数据。
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收稿日期:2002-01-29 修回日期:2002-03-05基金项目:863项目(Z 19201204201)。
文章编号:100126325(2002)0320232204一个新的锌指蛋白基因ZN F 333cDNA 的分离及表达谱分析田 勇,赵红珊,陈冀榛,刘雅萍,李明月,杨 涛,罗会元,黄尚志(中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所医学遗传室,北京100005)摘要:本研究通过生物信息学和分子生物学相结合的方法成功克隆了一个新的锌指蛋白基因ZN F 333cDNA 。
ZN F 333基因包含14个外显子,编码665个氨基酸。
蛋白质N 端包含2个保守的K RAB 2A 盒,2个多态的K RAB 2B盒,而C 端包含10个重复的C 2H 2型锌指基序。
ZN F 333的表达在心脏组织中最高,在其他组织中也可检测到表达。
同时还发现该基因存在选择性剪切形式。
通过与人类基因组框架图的比较将ZN F 333定位在19p1311。
关键词:锌指蛋白;克隆;K RAB中图分类号:Q785;Q786 文献标识码:A 转录因子(transcriptional factor ,TF )在基因的表达与调控中起很重要的作用。
转录因子一般包括一个DNA 结合域和一个转录激活Π抑制域。
不同的转录因子由于所含的保守结构域不同而分为不同类别。
在哺乳细胞中,含K RAB (K ruppel 2ass ociated box )结构域的锌指蛋白基因是最常见的转录因子。
一些实验已经证明K RAB 结构域可以对基因的转录起抑制作用[1]。
K RAB 结构域由75个氨基酸组成,其中有45个氨基酸是必须的。
K RAB 结构域包括两个组成部分,K RAB 2A 盒和K RAB 2B 盒。
目前K RAB 锌指蛋白基因共分为三类,分别是K RAB 2A ,AB 和Ab ,其中b 表示高度多态性的B 盒[2]。
K RAB 锌指蛋白基因通常在细胞分化和发育中起重要作用,但目前为止对于K RAB 锌指蛋白的生理功能还缺乏足够了解[3]。
本研究利用生物信息学与分子生物学实验相结合的方法,成功地在19号染色体上分离了一个新的锌指蛋白基因,国际人类基因命名委员会(HG NC )正式将其命名为ZN F 333(G enBank 编号AF372702)。
1 材料与方法111 生物信息学利用人类基因组框架图所提供的19号染色体基因组序列进行基因及外显子结构的信息学分析(包括FGE NE ,FGE NES ,GE NESC AN ,G RAI L ,GE NEFI NDER ,H M MGE NE ,HEX ,FEX ,MZEF ,GE NE MARK,http :ΠΠw w w 1hgm p 1mrc 1ac 1uk ΠRegistered ΠWebapp Πnix Π),寻找共分析阳性的区域。
同时利用BLAST 程序(http :ΠΠw w w 1ncbi 1nlm 1nih 1g ov )检索对应的EST 数据库。
112 RNA 提取,RT 2PCR 和测序收集人外周血淋巴细胞,按trizol agent (Promega )试剂盒说明书提取RNA 并逆转录合成cDNA ,分别对于信息学分析阳性的基因组区段设计引物进行PCR 扩增,所有扩增阳性的PCR 产物均使用ABI PRIS M 377DNA 自动测序仪(Perkin E lmer Inc )进行测序。
113 5’RACE按照S MART PCR cDNA library construction K it(Clontech Laboratory ,Inc 1C A )说明书采用治疗性人流产胎儿的组织提取总RNA 并逆转录合成的cDNA 做为扩增模板。
基因特异性的引物使用G SP1(5’T CC ACTTTG T CCT CCTG AAG 3’)和G SP2(5’TTT 2G AGG T CT C AG T CGG TG TT 3’)。
同时按照说明书合成一新的通用引物(5’GG CTG CG AG AAG ACG AC A 3’)以达到PCR 最佳扩增效果。
获得单一条带后进行测序,结果用BLAST 程序进行分析。
114 N orthern B lot 分析提取ZN F 333I MAGE 克隆2782772(G enBank 编号AW157012)的质粒DNA ,使用限制性内切酶SacI 和XhoI 酶切3h ,然后对酶切产物进行1%琼脂糖电泳并回收纯化(Qiagen QI Aquick G el Extraction K it ),将其作为探针进行标记并杂交multiple tissue N orth 2ern blot (Clontech )。
杂交缓冲液使用Clontech 推荐的PerfectHyb plus hybridization bu ffer (Sigma )。
人β2actin 探针(Clontech 提供)也杂交到同一张膜上做为阳性对照。
2 结果211 生物信息学分析在19号染色体粘粒克隆LLN LF 2175G 11(G en 2Bank 编号AC008983)的序列中发现多个外显子预测强阳性的区域。
利用BLAST 分析EST 数据库的结果显示有对应的EST 序列位于同一该强阳性区域。
212 RT 2PCR 结果我们设计了跨越不同外显子的引物,PCR 结果显示所有设计的PCR 产物扩增均为阳性(表1)。
将所有PCR 产物测序的结果进一步证实了扩增的特异性。
213 5’RACE 结果通过巢式PCR 的扩增获得单一的条带。
测序结果通过生物信息学的分析证实该基因的转录起始位点位于AC008983的5737bp 处。
整个基因共包括14个外显子,覆盖了基因组序列约30kb 的范围,其中起始密码ATG 位于外显子2,终止密码T AA 位于外显子14,所有的剪切信号都符合AG 2G T 规则(表2)。
根据人类基因组序列框架图,将ZN F 333定位于19p1311。
同时,通过BLAST 分析,还发现了ZN F 333的一种选择性剪切形式,该剪切体在外显子7后面采用2个新的外显子8A 和9A ,从而取代了所有后面的外显子,其中终止密码T AG 位于外显子8A 。
表1 扩增ZN F 333外显子的引物序列及片段长度大小T able 1 Sequence of the primers used for the amplification of ZN F 333exons and size of the amplification productEx on F orward (5’to 3’) Reverse (5’to 3’) S ize (bp )1～10G CACGG TGGG AG TG TCTC TCCACTTTG TCCTCCTG AAG 63010～11CTGG CTTCAGG AGG ACAAAG CAG AGG CCAGG TTCCTG T AG 19112～13AACTG TG CAAACCCAATG C TTCACATCAATGG ACAGG ATCT 16314CCT AATTG TG CCCG AG AAAA CG T AGGG CTTCTCTCCTG TG 29614AG TG TGGG AAAACCTTCACG CTTG TG CACG TTCAG ATG AG 29914ACTTG CGG TCAGG TCTTG AG TCCCACATGGG TTCTTTTG T31514TCCCT ATT ACTG AACATTCAACCAAAGG TG T ACCCT AAG ATTT ATT AACG367表2 ZN F 333外显子和内含子的基因结构图T able 2 Exon 2I ntron structure of hum an ZN F 333and isoformsEx on S ize (bp )Acceptor site (intron 2EX ON )D onor site (EX ON 2intron )Intron S ize (bp )P osition of intron in AC008983(bp )150ΠG CGG CGTTG CAG Πgtgtggcccg 1123005787-9086244tttattgcag ΠGG AG AA G TCATG Πgtgaggaaac 215159131-106453124gctgttttag ΠG AATCC CCAGGG Πgtaagggctg 343210770-11201496tcatgtgcag ΠG AACTC G TG TTG Πgtgagtacca 4351311298-14810583ttcatttcag ΠCCTGGG CAAATG Πgtaagatgca 5577214894-206656117cttttgccag ΠGGG CCG TG CACG Πgtaagcctgg 6151520783-22297788ctctgtccag ΠGG ACTG ATTCTG Πgtgagtgagt 7a 114222386-235288A 49ttcttgacag ΠGG AACA TTTTTG Πgtaagtcttc 8a36123578-239399A 921cttcttgaag ΠCGGG T A TTT AT A Π1089tctcccctag ΠCTG TG C TCACAG Πgtaggtaaga 964131083-3172311127tgtgttttag ΠG AACCA CTG TGG Πgtaaggcagc 1075631851-326061295tcatgagcag ΠCTG ATC G TG CAG Πgtgagcccag 1156732702-332681377ttcatttcag ΠAACCTC AAAGGG Πgtaaggctca 1249333346-33839143666tcatcgacag ΠG AG CAACTTG TT Π214 N orthern B lot 分析结果对人体八种不同组织进行了ZN F 333表达的检测,结果发现ZN F 333在心脏的表达最高,在胎盘,肝脏,骨骼肌,肾脏和胰腺中也有表达。
而在成人脑和肺脏中未检测到相应的杂交信号。
ZN F 333的表达产物约416kb 。
同时还发现在心脏和其他组织中有较弱的长度为116kb 和3kb 带型,提示可能为选择性剪切的产物(图1)。
图1 ZN F 333mRNA 在不同组织中的 N orthern B lot 结果Fig 1 N orthern blot analysis of ZN F 333mRNA expression in different tissues11heart ;21brain ;31placenta ;41lung ;51liver ;61skeletal muscle ;71kidney ;81pancreas3 讨论本实验用生物信息学和分子生物学实验相结合的方法成功克隆了一个新的全长锌指蛋白ZN F 333cDNA 。