RNAi和siRNA转染 ppt课件
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细胞转染PPT课件
蛋白转染
Adherent cell lines
3T3 L1 A549 BHK-21 CaSki CHO CV-1 HEK-293
60-80% 80% 30-40% 80-90% 80-90% 50% 45-55%
HeLa HepaRG MCF-7 MLE-15 NIH-3T3 RAW 264.7 Si Ha
• Release
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技术原理
蛋白转染
PULSin™: cationic amphiphilic-based formulation
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操作步骤
蛋白转染
For 24-well plate:
细胞融合度：70-80%
1 稀释蛋白：1µg of protein/100µl Hepes 2 加 4 µl PULSin™ 3 孵育 15 min
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-
-
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细胞转染难易比较
体外转染
Adherent > Suspension
Problem: Membrane
E.g.:
THP1, Jurkat…
Fast dividing cell > non dividing cell
Problem: Access to the nucleus
E.g.:
k562gapdh788thp1gapdh818sirna转染转染第32页共73页原代细胞的高效沉默24wellplatebrancheddnaassay20406080100120nmsirnaconcentrationsirnagapdhsirnamm20406080100120nmsirnaconcentrationsirnagapdhsirnamm96人原代肝实质细胞人原代纤维原细胞82sirna转染转染第33页共73页interferin优势低浓度sirna甚至pmol级别就能达到高效的基因沉默在反向操作转染中的效率高sirna转染转染第34页共73页sirna转染竞争对手lipofectamine2000invitrogenolgofectamineinvitrogenhiperfectqiagensilentfectbioradlargestsirnatransfectionmarketdangerousoutsiderhiperfectsirna转染转染第35页共73页nterferinvslipofectamine2000interferinlipofectamine2000sirna浓度nmsirna降低成本20100nmsirna40nm血清和抗生素不受血清和抗生素影响不能加入抗生素基因沉默效率90以上操作即用型简单需稀释复杂细胞毒性无细胞毒性细胞毒性大sirnareagentwell24well06pmol13ul1050pmol0515ul价格第36页共73页nterferinvsoligofectamineinterferinoligofectaminesirna浓度nmsirna100nmsirna血清和抗生素不受血清和抗生素影响不能加入抗生素基因沉默效率90以上一般操作即用型简单需稀释复杂细胞毒性无细胞毒性细胞毒性大sirnareagentwell24well06pmol13ul60pmol3ul价格第37页共73页nterferinvshiperfectsilentfectinterferinhiperfectsilentfectsirna浓度nmsirna5nmsirna10nmsirna细胞融合度305050805090基因沉默效率高见表见表见表细胞毒性无细胞毒性细胞毒性较小细胞毒性大sirnareagentwell24well06pmol84ng13ul375ng3ul价格
RFect siRNA淋巴细胞转染
RFect siRNA淋巴细胞转染产品描述RFect siRNA转染试剂是专为将RNAi双链(siRNA)转染真核细胞而设计的新一代动物源性游离脂质转染试剂。
RFect由不同的脂质组成，在大多数细胞系中表现优异，但也存在一定的差异。
无论血清存在与否，SiRNA-RFect复合物可直接添加到培养基中的细胞中。
转染后无需去除复合物或改变/添加培养基，但复合物可在4-6小时后去除。
RFect siRNA转染试剂的优点转染效率高90%或更多的速度和明显的基因击倒效果(如。
在A549细胞中，Lamin A/C基因敲除效率达95%以上)。
最小的细胞毒性(少于10%的细胞转染后死亡率),以减少非特异性作用和细胞压力。
需要低浓度的siRNA获得高水平的可拆卸的。
广泛的转染细胞:我们可以获得理想的大多数附着细胞系转染结果。
储存、稳定、特殊处理RFect核转染试剂在室温下稳定运输和长期储存(12个月)在4°C。
RFect siRNA转染试剂仅供研究使用。
转染的重要指南转染过程中不要向培养基中添加抗生素，因为这可能导致细胞死亡。
以10nm siRNA为起始点，虽然siRNA浓度可以远低于10nm。
正向转染和反向转染协议可用于大多数细胞株。
协议:向前转染使用以下步骤将siRNA以24孔的形式转染到细胞中。
有关其他格式，请参见放大或缩小转染。
优化转染如优化转染中所述，特别是在首次转染细胞株时。
所有数量和体积均按每口井计算。
答:板细胞在转染前的一天,500μl板细胞生长介质没有抗生素,这样细胞将30 - 50%时汇合的转染。
B.准备siRNA-RFect复合物1. 稀释6 pmol siRNA 50μl没有血清的培养基。
2. 稀释2μl RFect 50μl没有血清的培养基。
轻轻搅拌，室温下孵育5分钟。
注意:在25分钟内进行第3步。
3.5分钟后孵化,结合稀释的稀释siRNA RFect(总量= 100μl)。
轻轻搅拌，室温下孵育20分钟。
软骨细胞 siRNA转染原理及转染试剂的选择
软骨细胞 siRNA转染原理及转染试剂的选择RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近年来生命科学领域最为重大的发现之一。
它是指小分子双链RNA可以特异性地降解同源mRNA,从而抑制或关闭特定基因表达的现象。
人们只要知道了某种疾病的致病基因，就可以设计出针对该基因mRNA的小分子干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA），抑制或封闭该致病基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。
siRNA是目前最为热门的生命科学研究领域，也是未来最有发展前途的新药开发领域。
除此之外，siRNA技术还可以广泛应用于农业、林业、畜牧业和渔业等多种领域，进行良种培育、良种筛选和疾病治疗等。
siRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。
其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。
化学转染能否成功的关键在于转染试剂的选择，目前常用的转染试剂有RFect系列转染试剂、Lipo2000、RNAiMAX等。
如何选择合适的转染试剂，一般可从以下几个方面考虑：一、对siRNA有较高的转染效率。
转染效率的确定，常用的是使用荧光定量PCR、荧光显微镜和流式细胞仪检测的方法。
金标准无疑是检测目标基因的mRNA 水平，因为转染试剂不仅要把siRNA转染进入细胞，还应及时把转入细胞的siRNA 释放出来，发挥抑制基因表达的作用。
通过荧光显微镜判断转染效率至少存在两方面的问题：1、荧光显微镜看到的荧光点可能是非特异吸附的结果；2、有些转染试剂能够将siRNA转染入细胞，但不能充分释放，导致基因抑制效率并不高。
因而，判断转染试剂转染效率的金标准应该是荧光定量检测mRNA水平，仅靠观察荧光显微镜判断转染效率、选择转染试剂往往会导致误判，影响实验的进展。
目前国内应用最广的转染试剂有RFect系列转染试剂、Lipo2000、RNAiMAX等，其中，Lipo2000、RNAiMAX为国外知名品牌，RFect转染试剂虽在国内生产，但实际上是在美国研发成功，拥有国际发明专利。
siRNA和RNAi(PPT课件)
基因沉默
转基因沉默分为转录水平的基因沉默 (Transcriptional Gene Silencing, TGS) 和转录 后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS)两种：
2006年诺贝尔生理学或医学奖颁发给2位美国科 学家：Andrew Z.Fire和Craig C．Mello，以表 彰其在RNA干扰——双链RNA引发的基因沉默领 域所做出的杰出贡献。
此后dsRNA介导的RNAi现象陆续发现于真菌、 果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多 种真核生物中，并逐渐证实植物中的转录后基因 沉默（posttranscriptional gene silencing， PTGS）、共抑制（cosuppression）及RNA介导 的病毒抗性、真菌的抑制（quelling）现象均属 于RNAi在不同物种的表现形式。
RNAi的发现简史 RNAi的作用机制和特征 siRNA的制备方法 siRNA的设计原则 RNAi的应用 RNAi实验举例
RNAi是与靶基因序列同源的双链RNA (dsRNA)所诱导的一种特异性基因沉默现象。 它是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、 抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制， 具有重大生物学意义。
mRNA
正义RNA
无抑制（污染
） （反向互补）反义RNA 抑制微弱 双链RNA 抑制强烈
蛋白质
Negative contrபைடு நூலகம்l
uninjected
antisense RNA
injected dsRNA
Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos. (A) Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.)
RNAi技术专题讲座PPT
直接制备19-23bp左右的siRNAs，将siRNAs转入哺乳动 物细胞(线路2，红色)
或是将短发夹结构RNA(shRNAs)的DNA表达载体转入 细胞，表达产生shRNA，经过Dicer切割后得到 siRNA(线路3，黄色)
最后siRNAs和其他元件组合成为RNA诱导的沉默复合 物RISCs，在siRNA指引下识别对应的mRNA序列并降解 mRNA，从而使特定基因表达沉默
达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的 dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量） 就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的 方式进行的；
❖④RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限， 在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至 整个有机体以及可遗传等特点；
❖⑤dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也 在细胞内被Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA，并 由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的 dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰， 而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡 ；
RNAi技术机制路线图
siRNA诱导的基因沉默
病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随 机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行 转录时，常产生一些dsRNA。 宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应， 作用机制 其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具 有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp）， 即siRNA。 siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链 和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包 括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导 的沉默复合物（RNA-induced silencing complex， RISC)。
或是将短发夹结构RNA(shRNAs)的DNA表达载体转入 细胞，表达产生shRNA，经过Dicer切割后得到 siRNA(线路3，黄色)
最后siRNAs和其他元件组合成为RNA诱导的沉默复合 物RISCs，在siRNA指引下识别对应的mRNA序列并降解 mRNA，从而使特定基因表达沉默
达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的 dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量） 就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的 方式进行的；
❖④RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限， 在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至 整个有机体以及可遗传等特点；
❖⑤dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也 在细胞内被Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA，并 由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的 dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰， 而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡 ；
RNAi技术机制路线图
siRNA诱导的基因沉默
病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随 机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行 转录时，常产生一些dsRNA。 宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应， 作用机制 其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具 有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp）， 即siRNA。 siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链 和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包 括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导 的沉默复合物（RNA-induced silencing complex， RISC)。
RNAi、miRNA及siRNA的区别和联系
用siRNA进行transient transfection不稳定，几代细胞以后，症状就会消失，所以在转染几天（１－３）后要立刻抽提蛋白，进行分析用质粒中的shRNA进行转染，如果质粒含有抗生素位点，可以进行筛选，获得较稳定的细胞株系，但需要时间较长用病毒中的shRNA进行感染（infection），抗生素筛选后，可以获得很稳定细胞株系瞬时RNAi短时转染是一种常见的简单生物手段，这种手段能够将外源性的siRNA或是能够编码siRNA 的质粒通过非病毒感染的方式导入细胞中。
转染的细胞通常在细胞质膜表面有一个短时小孔或者一个“洞”，这些特殊的孔结够能够让基因物质通过细胞膜进入细胞质中。
转染过程中可以借助磷酸钙与形成极小的磷酸钙复合物沉淀黏附在细胞膜表面，而借助内吞作用加速基因物质进入细胞质。
或者也可以通过借助带正电荷的阳离子脂质体形成脂质体包含物体，然后经过内吞作用进入细胞质中。
.不过上述的这些转染技术所产生的沉默作用持续时间较短，因为所诱导的siRNA不能够进行自身复制而且会因为细胞的分化而被稀释或降解。
转染的外源DNA由于不能够插入核内基因组通常会在细胞经历有丝分裂过程中丢失。
一旦所转染的细胞中siRNA消失后，靶基因功能又重新恢复到转染前水平。
采用转染技术来产生基因沉默通常要在４８－７２小时才能达到高沉默率，而且根据不同转染效率也只能维持２４－９６小时。
因此，siRNA转染可作为短期分析基因功能的有效工具，而且可以方便快速去验证针对靶基因所设的siRNA 干扰效率。
当前，由于siRNA转染技术易于制备、随时可用以及很短的操作时间等特点主要用于短时基因沉默。
长久RNAi由于表型改变通常和基因型改变在时间上不同步，许多分析试验就要求长时间对靶基因的沉默。
siRNA转染直接产生的沉默由于其短时性就不能用于长时间的实验研究，人工合成siRNA的转染手段由于其不稳定性和低转染效率不能广泛运用于其他类型细胞。
RNAi技术及其应用 PPT课件
包含两种主要的组成成分，即决定干扰特异性的 小RNA和发挥抑制作用的Argonaute蛋白。
根据RISC复合物中Argonaute蛋白的天然活性以及 小RNA与
其靶标mRNA之间互补程度的不同，RISC复合物 与靶标mRNA结合后会发挥几种不同的作用，它 可以控制mRNA的稳定性和蛋白质合成、维持基
值得一提的是，这是第一
项使用受体介导递送方式的siRNA临床试验，该 产品被连接有转铁蛋白的环糊精颗粒包裹。这样， 药物就只会被细胞表面表达有转铁蛋白受体的细
胞摄取，而转铁蛋白受体在肿瘤
细胞表面表达量就非常高。
Acuity制药公司与Merck公司旗下的 SirnaTherapeutics公司合作进行的临床药物试验成
内源性siRNA（esiRNA）。 不过，这些小RNA子都有一个共同的特征，那就 是它们都能与Argonaute蛋白相结合，从而发挥它
们的靶向作用。
简述
小RNA分子的形成过程以及RNA沉默的机制 a、能够形成dsRNA结构或者发夹结构的天然转录 产物是形成小RNA分子的前体物质。这些双链结
构的RNA分子经由疗技术，却已经以一种 前所未有的速度迈进了临床试验阶段。下面，我
们将介绍几种已经进入临床试验阶段的人体疾病 RNAi疗法。 第一个被
siRNA治疗指南批准获得临床研究新药 （investigationalnewdrug，IND）资格，并且进入
了临床试验的就是Bevasiranib，它是美国Ac
为两大类：
一是小干扰RNA（siRNA），它是细胞为了应对病
毒感染或者其它人工导入分子而剪切外源性长 dsRNA前体而生成；二是miRNA，它由细胞运用
其自身基因组编码的茎
环结构加工而来。借助高通量测序技术，人们发 现了好几种内源性小RNA，包括最近发现的PIWI 相互作用RNA（PIWI-interactingRNA,piRNA）和
RNAi和siRNA转染
02
rnai和sirna的转染方法
化学转染法
总结词
利用化学合成的高分子物质，将RNAi或 siRNA包裹并导入细胞内。
VS
详细描述
化学转染法是一种常用的转染方法，通过 使用脂质体、聚合物等化学物质将RNAi 或siRNA包裹，然后通过细胞膜的被动吸 附或内吞作用进入细胞。这种方法具有较 高的转染效率和灵活性，适用于多种细胞 类型。
药物研发
rnai和sirna技术可以用于药物研发过程中靶点的筛选和验 证，通过沉默或激活特定基因，评估其对疾病的影响，为 药物研发提供重要的理论依据。
rnai和sirna技术还可以用于研究药物的作用机制，通过干 扰或激活特定基因的表达，探究药物对疾病的治疗作用及 其作用途径。
rnai和sirna技术在药物研发中有助于加速新药的研发进程， 提高药物研发的成功率和降低研发成本。
未来展望
新型载体研发
通过研发新型载体，提高RNAi和siRNA的 转染效率和特异性，降低脱靶效应和免疫反 应。
优化设计策略
改进RNAi和siRNA的设计策略，提高其与靶标RNA 的结合能力和稳定性。
临床试验进展
随着RNAi和siRNA在临床试验中的不断应 用，将进一步了解其在治疗各种疾病中的潜 力和安全性问题。
数据整理与结论
对实验数据进行整理分析 ，得出结论，并撰写实验 报告。
感谢您的观看
THANKS
物理转染法
总结词
利用物理手段，如电穿孔、基因枪等，将 RNAi或siRNA直接导入细胞内。
详细描述
物理转染法是一种直接将RNAi或siRNA导 入细胞的方法，通过电穿孔或基因枪等技术， 使细胞膜产生瞬时孔洞，RNAi或siRNA通 过这些孔洞进入细胞。这种方法具有较高的 转染效率和特异性，但操作较为复杂。
《RNA转录》课件
RNA转录的步骤
1
初始转录复合物的形成
转录因子与RNDNA，并启动RNA合成。
RNA聚合酶沿DNA链合成RNA，DNA则
被“解旋”为两条单链。
3
终止RNA合成
当RNA聚合酶到达终止密码子时停止合
RNA合成的后处理
4
成，RNA与DNA分离。
在RNA转录终止后，需要对RNA进行加 工修饰，例如剪切、添附等。
《RNA转录》PPT课件
RNA转录是基因表达的关键过程，本课程将深入讲解RNA转录的特性、步骤、 调控以及对生命活动意义等方面，希望大家能够从中受益。
什么是RNA转录？
RNA转录的定义
RNA转录是将DNA序列转录成RNA序列的过程。
RNA转录与DNA复制之间的区别
RNA转录只转录一段DNA序列，产生一个RNA 序列，而DNA复制则将整个基因组复制一遍。
RNA剪切
2
磷酸酯等，增加分子稳定性和功能性。
某些RNA分子需要经过剪切才能成为成熟
的RNA，可将不需要的片段剪切掉。
3
RNA添附
某些RNA还可以加上化学基团，如3'端的 poly(A)尾和5'端的cap，增强RNA稳定性 和翻译效率。
RNA转录的意义
对生命活动的重要性
RNA转录是维持生命活动的关键过程，调节基因的表达和信号传递。
相关疾病的研究
RNA转录异常与许多疾病的发生和发展密切相关，如肿瘤、神经系统疾病等。
结束语
通过本课程的介绍，希望大家能对RNA转录的基本原理、步骤、调控和意义 等方面有更为深入的了解。RNA转录是生命活动不可或缺的一部分，学习和 研究RNA转录有助于更好地理解生命的奥秘。
RNA转录的调控
RNAi和siRNA转染-新版.pptx
5
(2) SIRNA途径
小干扰RNA，长21-23bp，双链。 作用机制：双链的siRNA解链并装配入RNA介 导的沉默复合物(RISC)，siRNA的反义链引导 RISC与mRNA分子互补结合，并降解mRNA， 最终导致特定基因表达的抑制。
5
(3) SHRNA表达载体途径
shRNA（short hairpin RNA）表达载体在细 胞内表达shRNA后，在Dicer作用下形成siRNA 分子，导致RNAi的发生。可能具有细胞毒性。
5
1.需要短期抑制还是长效抑制?
1周以内，采用siRNA较好，无需构建载体，节省 时间，还可以采用2次转染的方法，延长RNAi作 用的时间到2周。
2周以上长效RNAi实验，采用shRNA表达载体较 好，效应持续时间长。
5
2. 采用SIRNA进行实验的途径
(1) 化学合成：首选的siRNA制备方法，最快、最 方便，成本高，适用于长期使用特定siRNA
5
1.RNAI的概念
RNA干扰(RNA interference)是双链RNA （dsRNA)特异性地结合到与之序列互补的 mRNA上，导致mRNA降解，从而介导的转录 水平基因表达抑制。
5
2006年度诺贝尔生理学或医学奖共同授予安德 鲁·菲尔和克雷格·梅洛，他们发现了“RNA干扰机 制—双链RNA沉默基因”。
阳性对照siRNA在RNAi实验初期或在新的转染 体系进行RNAi实验时很重要，容易被忽视，缺 乏阳性对照siRNA，实验出问题无法找原因， 耽误时间。
5
(4) SIRNA荧光标记的问题
采用荧光标记的siRNA可以用来确定转染效率 和优化转染条件，这种方法操作快速，实验费 用也不高，但由于荧光标记的siRNA摄入与 siRNA导致的抑制效果时常会出现不相关性， 这种情况在某些细胞系和应用某些转染试剂时， 如脂质体时更为严重。因此在应用脂质体转染 试剂优化转染条件时，不推荐使用荧光标记的 siRNA。
(2) SIRNA途径
小干扰RNA，长21-23bp，双链。 作用机制：双链的siRNA解链并装配入RNA介 导的沉默复合物(RISC)，siRNA的反义链引导 RISC与mRNA分子互补结合，并降解mRNA， 最终导致特定基因表达的抑制。
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(3) SHRNA表达载体途径
shRNA（short hairpin RNA）表达载体在细 胞内表达shRNA后，在Dicer作用下形成siRNA 分子，导致RNAi的发生。可能具有细胞毒性。
5
1.需要短期抑制还是长效抑制?
1周以内，采用siRNA较好，无需构建载体，节省 时间，还可以采用2次转染的方法，延长RNAi作 用的时间到2周。
2周以上长效RNAi实验，采用shRNA表达载体较 好，效应持续时间长。
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2. 采用SIRNA进行实验的途径
(1) 化学合成：首选的siRNA制备方法，最快、最 方便，成本高，适用于长期使用特定siRNA
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1.RNAI的概念
RNA干扰(RNA interference)是双链RNA （dsRNA)特异性地结合到与之序列互补的 mRNA上，导致mRNA降解，从而介导的转录 水平基因表达抑制。
5
2006年度诺贝尔生理学或医学奖共同授予安德 鲁·菲尔和克雷格·梅洛，他们发现了“RNA干扰机 制—双链RNA沉默基因”。
阳性对照siRNA在RNAi实验初期或在新的转染 体系进行RNAi实验时很重要，容易被忽视，缺 乏阳性对照siRNA，实验出问题无法找原因， 耽误时间。
5
(4) SIRNA荧光标记的问题
采用荧光标记的siRNA可以用来确定转染效率 和优化转染条件，这种方法操作快速，实验费 用也不高，但由于荧光标记的siRNA摄入与 siRNA导致的抑制效果时常会出现不相关性， 这种情况在某些细胞系和应用某些转染试剂时， 如脂质体时更为严重。因此在应用脂质体转染 试剂优化转染条件时，不推荐使用荧光标记的 siRNA。
《RNA转录》PPT课件
（充当SSB）
精选课件ppt
18
由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点
➢ 有义DNA链结合位点（ β’亚基提供） ➢ DNA/RNA杂交链结合位点（β亚基提供） ➢ 双链DNA解链位点（前端 α亚基提供） ➢ 单链DNA重旋位点（后端α亚基提供） ➢ σ因子作用位点
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19
E. coli RNA polymerase
I site（initiation site . Rifs）: 该位点专一性地结合
ATP或者GTP （需要高浓度的ATP或GTP） E site（elongation site RifR）:对NTP非专一性地结
（4） β’ 因子
合（催化作用和Editing功能）
• 参与RNA非模板链（sense strand）的结合
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13
（2） 核心酶 （Core Enzyme） • 作用于转录的延伸过程（终止） • 依靠静电引力与DNA模板结合（蛋白质中碱性 基团与DNA的磷酸根之 间） • 非专一性的结合（与DNA的序列无关） • 结合常数：1011／mol • 半衰期：60秒
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14
（3）全酶的组装过程
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6
RNA 的转录包括 promotion. elongation. terminaton
三过程
从启动子 (promoter)到终止子(terminator)称为转录单 位 (transcription unit) (转录起始点)
原核生物的转录单位多为 polycistron in operon,真 核生物中的 转录单位多为monocistron, No operon
-GalactosidasePermease Transacetylase 10
RNi技术原理及应用PPT课件
3.siRNA扩增阶段
• RNA依赖性的RNA聚合酶
(RNA dependent RNA Polymerase, RdRp)
• siRNA可作为引物，以mRNA为模板，在 RdRP作用下合成出mRNA的互补链，它在 Dicer酶的作用下也被裂解成新生的siRNA。 通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA 大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。
• RNAi技术不破坏基因的完整性，可以先将特定基 因的表达封闭，然后再激活
• 可以同时封闭基因家族或具有高度相似性的一组 基因，从而解决由于多个基因的功能沉余造成的 难于检测到单个基因突变表型的问题
Table4.RNAi research on functional genes in insects
RNAi作用机制
外源dsRNA 病毒dsRNA 其他dsRNA
dsRNA
Dicer
双链siRNA
P
特异性蛋白结合形成RISC
siRNA解链
RDRP
靶序列识别
mRNA
以siRNA为引物，RDRP催化合成新的dsRNA siRNA
核酸酶降解mRNA
2.4miRNA介导的RNAi
• MicroRNAs( miRNAs)是一种大小约为21-25 个碱基的非编码单链小分子RNA，是具有 发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA 前体(pre-miRNA)经过Dicer酶加工后生成 (Lee Y,2003)。
Methods
Injection
Injection
Effects
Disorder in the insect cuticle, no expansion of the larval trachea epithelial wall, and other larval abnormalities
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RNAI和 SIRNA转染
1
ppt课件
内容
第一部分 RNAi实验基本概念 第二部分 RNAi实验具体设计 第三部分 siRNA转染过程相关问题及解答
2
ppt课件
第一部分 RNAI实验基本概念
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ppt课件
主要内容
1.RNAi的概念 2.RNAi的启动途径 3.非哺乳动物系统的RNAi实验 4.哺乳动物系统的RNAi实验 5.RNAi效应表现
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ppt课件
1.RNAI的概念
RNA干扰(RNA interference)是双链RNA （dsRNA)特异性地结合到与之序列互补的 mRNA上，导致mRNA降解，从而介导的转录 水平基因表达抑制。
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ppt课件
2006年度诺贝尔生理学或医学奖共同授予安德 鲁·菲尔和克雷格·梅洛，他们发现了“RNA干扰机 制—双链RNA沉默基因”。
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ppt课件
1.需要短期抑制还是长效抑制?
1周以内，采用siRNA较好，无需构建载体，节省 时间，还可以采用2次转染的方法，延长RNAi作 用的时间到2周。
2周以上长效RNAi实验，采用shRNA表达载体较 好，效应持续时间长。
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2. 采用SIRNA进行实验的途径
(1) 化学合成：首选的siRNA制备方法，最快、最 方便，成本高，适用于长期使用特定siRNA
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5.RNAI效应表现
RNAi效应导致的靶基因下调可在mRNA水平和 蛋白水平表现，也可能会在细胞形态等生理学 方面表现。
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第二部分 哺乳动物系统的RNAI实验设计
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主要内容
1. 需要短期抑制还是长效抑制? 2. 采用siRNA进行实验的途径 3. 构建shRNA表达载体进行实Байду номын сангаас 4. siRNA设计需要注意的问题 5. 脱靶效应 6. 转染是RNAi实验的瓶颈
需要构建相关质粒 可利用载体上的抗生素等标记筛选，做长效表 达 不能做荧光标记，无法直观知道转染效率
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4.SIRNA设计需要注意的问题
(1) siRNA序列设计 (2) 阴性对照的作用 (3) 阳性对照的重要性 (4) siRNA荧光标记的问题
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(1) SIRNA的设计
理想的siRNA序列是特异性强，抑制效率高。 可通过检索相关基因的文献报道序列，或者通过 在线设计软件进行，一些技术力量较强的化学合 成公司可提供免费设计。 如果有可能，多设计几条siRNA 序列，以筛选最 特异、最有效的siRNA序列。
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5.RNAI OFF-TARGET(脱靶效应)
(1) 什么是RNAi Off-target(脱靶效应)? (2) 脱靶效应如何检测？ (3) siRNA浓度是否和脱靶效应相关？ (4) 转染试剂是否也会造成脱靶效应？ (5) 如何避免脱靶效应？
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(2) SIRNA途径
小干扰RNA，长21-23bp，双链。 作用机制：双链的siRNA解链并装配入RNA介 导的沉默复合物(RISC)，siRNA的反义链引导 RISC与mRNA分子互补结合，并降解mRNA， 最终导致特定基因表达的抑制。
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(3) SHRNA表达载体途径
shRNA（short hairpin RNA）表达载体在细 胞内表达shRNA后，在Dicer作用下形成siRNA 分子，导致RNAi的发生。可能具有细胞毒性。
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2.RNAI的启动途径
(1) dsRNA途径 (2) siRNA途径 (3) shRNA表达载体途径
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(1) DSRNA途径
dsRNA:在非哺乳动物系统中，大于30bp的长 双链RNA(dsRNA)进入细胞后，经过胞质内双 链特异性核酸酶Dicer水解成21-23bp的siRNA， 进一步导致RNAi的发生。 但在绝大多数哺乳动物系统中，超过30bp的 dsRNA会引起细胞潜在的抗病毒机制（干扰素 效应）降解dsRNA。
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(2) 阴性对照SIRNA的作用
阴性对照siRNA通常在进入细胞后不会引起任 何基因表达的改变，从而反映出小分子RNA片 段进入细胞后对基因表达的非特异影响。
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(3) 阳性对照SIRNA的重要性
阳性对照siRNA采用确认有效的siRNA，针对 某些较容易检测基因，如甘油醛－3-磷酸脱氢 酶（GAPDH）基因；
用于确认RNAi实验过程的有效性，包括转染条 件、检测方法是否可行等；
阳性对照siRNA在RNAi实验初期或在新的转染 体系进行RNAi实验时很重要，容易被忽视，缺 乏阳性对照siRNA，实验出问题无法找原因， 耽误时间。
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(4) SIRNA荧光标记的问题
采用荧光标记的siRNA可以用来确定转染效率 和优化转染条件，这种方法操作快速，实验费 用也不高，但由于荧光标记的siRNA摄入与 siRNA导致的抑制效果时常会出现不相关性， 这种情况在某些细胞系和应用某些转染试剂时， 如脂质体时更为严重。因此在应用脂质体转染 试剂优化转染条件时，不推荐使用荧光标记的 siRNA。
(2) 体外转录：费时，成本低，所需有效浓度低， 适用于大量筛选siRNA Silencer® siRNA Construction Kit （ThermoFisher） (3) Dicer/RNaseⅢ酶解非哺乳动物系统的RNAi
三种方法均可做荧光标记，可及时得知转染效率 17
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3.构建SHRNA表达载体进行实验
shRNA可能通过 竞争Exportin-5 造成致命毒性
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3.非哺乳动物系统的RNAI实验
如线虫、果蝇等不涉及抗病毒免疫应答反应， 可通过与靶基因序列互补的长链dsRNA（通常 >200bp）介导RNAi的发生 。 长链dsRNA通常可以通过体外转录获得。
长链dsRNA进入细胞后可被Dicer酶水解为多个 混合的siRNA，敲除效果更好。
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4.哺乳动物系统的RNAI实验
通过转染siRNA：通常在3-7天可以维持较高的基 因表达抑制效应，效应期的长短主要取决于细胞 的增殖速度和siRNA的有效性。大部分RNAi实验 可以在此时间段获得结果，而且可以通过再次转 染获得超过1周的基因表达抑制时间。 通过转染shRNA表达载体，可以获得超过2周的 基因表达抑制时间，在长效RNAi实验时，选择 shRNA表达载体较为合适。
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内容
第一部分 RNAi实验基本概念 第二部分 RNAi实验具体设计 第三部分 siRNA转染过程相关问题及解答
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第一部分 RNAI实验基本概念
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主要内容
1.RNAi的概念 2.RNAi的启动途径 3.非哺乳动物系统的RNAi实验 4.哺乳动物系统的RNAi实验 5.RNAi效应表现
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1.RNAI的概念
RNA干扰(RNA interference)是双链RNA （dsRNA)特异性地结合到与之序列互补的 mRNA上，导致mRNA降解，从而介导的转录 水平基因表达抑制。
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2006年度诺贝尔生理学或医学奖共同授予安德 鲁·菲尔和克雷格·梅洛，他们发现了“RNA干扰机 制—双链RNA沉默基因”。
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1.需要短期抑制还是长效抑制?
1周以内，采用siRNA较好，无需构建载体，节省 时间，还可以采用2次转染的方法，延长RNAi作 用的时间到2周。
2周以上长效RNAi实验，采用shRNA表达载体较 好，效应持续时间长。
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2. 采用SIRNA进行实验的途径
(1) 化学合成：首选的siRNA制备方法，最快、最 方便，成本高，适用于长期使用特定siRNA
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5.RNAI效应表现
RNAi效应导致的靶基因下调可在mRNA水平和 蛋白水平表现，也可能会在细胞形态等生理学 方面表现。
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第二部分 哺乳动物系统的RNAI实验设计
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主要内容
1. 需要短期抑制还是长效抑制? 2. 采用siRNA进行实验的途径 3. 构建shRNA表达载体进行实Байду номын сангаас 4. siRNA设计需要注意的问题 5. 脱靶效应 6. 转染是RNAi实验的瓶颈
需要构建相关质粒 可利用载体上的抗生素等标记筛选，做长效表 达 不能做荧光标记，无法直观知道转染效率
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4.SIRNA设计需要注意的问题
(1) siRNA序列设计 (2) 阴性对照的作用 (3) 阳性对照的重要性 (4) siRNA荧光标记的问题
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(1) SIRNA的设计
理想的siRNA序列是特异性强，抑制效率高。 可通过检索相关基因的文献报道序列，或者通过 在线设计软件进行，一些技术力量较强的化学合 成公司可提供免费设计。 如果有可能，多设计几条siRNA 序列，以筛选最 特异、最有效的siRNA序列。
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5.RNAI OFF-TARGET(脱靶效应)
(1) 什么是RNAi Off-target(脱靶效应)? (2) 脱靶效应如何检测？ (3) siRNA浓度是否和脱靶效应相关？ (4) 转染试剂是否也会造成脱靶效应？ (5) 如何避免脱靶效应？
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(2) SIRNA途径
小干扰RNA，长21-23bp，双链。 作用机制：双链的siRNA解链并装配入RNA介 导的沉默复合物(RISC)，siRNA的反义链引导 RISC与mRNA分子互补结合，并降解mRNA， 最终导致特定基因表达的抑制。
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(3) SHRNA表达载体途径
shRNA（short hairpin RNA）表达载体在细 胞内表达shRNA后，在Dicer作用下形成siRNA 分子，导致RNAi的发生。可能具有细胞毒性。
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2.RNAI的启动途径
(1) dsRNA途径 (2) siRNA途径 (3) shRNA表达载体途径
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(1) DSRNA途径
dsRNA:在非哺乳动物系统中，大于30bp的长 双链RNA(dsRNA)进入细胞后，经过胞质内双 链特异性核酸酶Dicer水解成21-23bp的siRNA， 进一步导致RNAi的发生。 但在绝大多数哺乳动物系统中，超过30bp的 dsRNA会引起细胞潜在的抗病毒机制（干扰素 效应）降解dsRNA。
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(2) 阴性对照SIRNA的作用
阴性对照siRNA通常在进入细胞后不会引起任 何基因表达的改变，从而反映出小分子RNA片 段进入细胞后对基因表达的非特异影响。
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(3) 阳性对照SIRNA的重要性
阳性对照siRNA采用确认有效的siRNA，针对 某些较容易检测基因，如甘油醛－3-磷酸脱氢 酶（GAPDH）基因；
用于确认RNAi实验过程的有效性，包括转染条 件、检测方法是否可行等；
阳性对照siRNA在RNAi实验初期或在新的转染 体系进行RNAi实验时很重要，容易被忽视，缺 乏阳性对照siRNA，实验出问题无法找原因， 耽误时间。
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(4) SIRNA荧光标记的问题
采用荧光标记的siRNA可以用来确定转染效率 和优化转染条件，这种方法操作快速，实验费 用也不高，但由于荧光标记的siRNA摄入与 siRNA导致的抑制效果时常会出现不相关性， 这种情况在某些细胞系和应用某些转染试剂时， 如脂质体时更为严重。因此在应用脂质体转染 试剂优化转染条件时，不推荐使用荧光标记的 siRNA。
(2) 体外转录：费时，成本低，所需有效浓度低， 适用于大量筛选siRNA Silencer® siRNA Construction Kit （ThermoFisher） (3) Dicer/RNaseⅢ酶解非哺乳动物系统的RNAi
三种方法均可做荧光标记，可及时得知转染效率 17
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3.构建SHRNA表达载体进行实验
shRNA可能通过 竞争Exportin-5 造成致命毒性
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3.非哺乳动物系统的RNAI实验
如线虫、果蝇等不涉及抗病毒免疫应答反应， 可通过与靶基因序列互补的长链dsRNA（通常 >200bp）介导RNAi的发生 。 长链dsRNA通常可以通过体外转录获得。
长链dsRNA进入细胞后可被Dicer酶水解为多个 混合的siRNA，敲除效果更好。
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4.哺乳动物系统的RNAI实验
通过转染siRNA：通常在3-7天可以维持较高的基 因表达抑制效应，效应期的长短主要取决于细胞 的增殖速度和siRNA的有效性。大部分RNAi实验 可以在此时间段获得结果，而且可以通过再次转 染获得超过1周的基因表达抑制时间。 通过转染shRNA表达载体，可以获得超过2周的 基因表达抑制时间，在长效RNAi实验时，选择 shRNA表达载体较为合适。