明胶酶谱实验方法

明胶酶谱实验

72kD（MMP-2）和92kD（MMP-9）

抽提缓冲液：

10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,

150 mmol/L NaCl,

20 mmol/L CaCl2,

1μmol/L ZnSO4,

0.01% (v/v) Triton X-100,

（0.5% PMSF）。

10mmol/LPMSF 溶液：取PMSF 粉末17.4mg, 加异丙醇溶解, 定容至100ml，置-20℃备用。

注意：PMSF在临提取组织时再加入，使终浓度为0.5%，配制时不加，不然易失效。

先用新鲜肾组织，蛋白量尽量加至最大。如果按这个还做不出来，那就是你的实验技术问题了

明胶酶是锌依赖的蛋白酶. EDTA是金属离子络合剂.加了就把明胶酶的锌离子络合了，完全抑制MMP的活性。你加了这个我保证你一辈子也做不出来。

蛋白浓度一般是先摸索一个量。就是分别上10,20,30,40,50,60,70,80,90,100ug

跑一下电泳，先看结果。条带看不见的，或者太透明的，都不能选。就是要半明半暗的那种。看是哪个道分解的，我们就选其中几个量上样。

(1)、5%浓缩胶(现配现用)：

d3H2O 2.1ml

30%丙烯酰胺溶液0.5ml

1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml

10% SDS 30μl

10%过硫酸铵(AP) 30μl

TEMED 3μl

3ml (2)、10%分离胶(现配现用)：

d3H2O 2.1ml

30%丙烯酰胺溶液 2.31ml

1.5mol/l Tris-HCL(PH=8.8) 1.75ml

10% SDS 70μl

10%过硫酸铵(AP) 70μl

TEMED 5.6μl

1%明胶0.7ml

7ml (3)、4×上样缓冲液（4o C保存）：

0.32% Tris-HCL 6.4ml

4%SDS 8ml

50%甘油 3.2 ml

溴酚蓝0.024g

d3H2O 2.4ml

20ml

①wash buffer Ⅰ500ml

50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )

5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g

1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg

2.5% Triton X-100 12.5ml

②wash buffer Ⅱ500ml

50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )

5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g

1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg

③incubate buffer 500ml

50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH ) 50mM CaCl2 （110.99）0.2776g

1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg

1% Triton X-100 5.0ml

（五）注意事项

1）孵育时间可以根据情况而定，可以延长。

2）明胶应该现用现配。

3）用血清上样作为阳性对照。

明胶酶谱相关溶液及试剂的配制

(4)、5%浓缩胶(现配现用)：

d3H2O 2.1ml

30%丙烯酰胺溶液0.5ml

1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml

10% SDS 30μl

10%过硫酸铵(AP) 30μl

TEMED 3μl

3ml

(5)、10%分离胶(现配现用)：

d3H2O 2.1ml

30%丙烯酰胺溶液 2.31ml

1.5mol/l Tris-HCL(PH=8.8) 1.75ml

10% SDS 70μl

10%过硫酸铵(AP) 70μl

TEMED 5.6μl

1%明胶0.7ml

7ml

(6)、4×上样缓冲液（4o C保存）：

0.32% Tris-HCL 6.4ml

4%SDS 8ml

50%甘油 3.2 ml

溴酚蓝0.024g

d3H2O 2.4ml

20ml

(7)、5×Tris-甘氨酸电极缓冲液：三蒸水配制，其中含0.125mol/LTris-HCL、

1.25mol/L甘氨酸和0.5%SDS，完全溶解后调pH至8.3，室温保存，用时

稀释5倍。

(8)、洗脱液：三蒸水配制，其中含2.5% Triton X–100、50mmol/L Tris-HCL、

5mmol/L CaCl2和1μmol/L ZnCl2，完全溶解后调pH至7.6，室温保存。(9)、漂洗液：三蒸水配制，其中含50mmol/L Tris-HCL、5mmol/L CaCl2和

1μmol/L ZnCl2，完全溶解后调pH至7.6，室温保存。

(10)、孵育液：三蒸水配制，其中含50mmol/L Tris-HCL、5mmol/ CaCl2、1μmol/L

ZnCl2和0. 02% Brij-35，完全溶解后调pH至7.6，室温保存。

(11)、染色液：三蒸水配制，其中0.05% 考马斯亮兰R-250、30%甲醇和10%乙

酸，混匀后室温保存。

(12)、脱色液A、B、C：三蒸水配制，三种脱色液中甲醇浓度分别为30%、20%、

10 %，乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%，混匀后室温保存。

明胶酶谱法实验步骤

(1)、取6孔板中对数生长期的肿瘤细胞，用无血清RPMI1640培养基冲洗3次，

每孔中加入1ml无血清RPMI1640培养基，实验分组，加入干预因素，37o C、5%CO2恒温培养箱中培养24h。

(2)、将细胞培养上清液移入离心管中，4°C、2000rpm离心10min，取上清分装

后–80°C保存备用。

(3)、BCA法测定各样品蛋白浓度，根据不同浓度确定样品的上样体积，保证

各样品上样的蛋白质量相同，与4×上样缓冲液5ul混合，总体积不足20ul 用三蒸水补足（可以根据制胶时孔的大小决定上样总体积）。

(4)、配制分离胶和浓缩胶，制胶，等胶干之后，加入电泳缓冲液，使其溢满上

样孔。

(5)、20ul/孔上样，4°C、100V进行SDS-PAGE 电泳（我放在一个盆子里面，

周围覆冰），直至溴粉蓝跑至分离胶的底部。

(6)、电泳结束后，切取包括72KD和92KD合适大小的凝胶放置于洗脱液中振

荡洗脱4次（当然需要蛋白分子marker了啊），每次15min。

(7)、漂洗液中震荡漂洗2次，每次20min。

(8)、孵育液中，37°C水浴锅中孵育48h。

(9)、染色液中摇床上震荡染色3h。

(10)、将凝胶依次置于脱色液A、B、C中，在摇床上分别震荡脱色0.5 h、1 h、