明胶酶谱分析法

明胶酶谱分析法

一。用品

1.细胞培养或者提取组织

2.试剂的配制

（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶）

A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大下确定配制胶的量）10% SDS聚丙烯酰胺凝胶5ml（包括）

ddH2o 1.5ml 15ml

30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）1.65ml 4.95ml

1.5mol/l Tris（PH 8.8）1.25ml 3.75ml

10% SDS 50ul 150 ul

10%过硫酸铵50ul 150 ul TEMED 4ul 12 ul

1%明胶0.5ml 1.5 ml

B.浓缩胶的配制

浓缩胶3ml

ddH2o 2.1ml 6.3ml

30%储备胶0.5ml 1.5ml

1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.38ml 1.14ml

10% SDS 30ul 90 ul

10%过硫酸铵30ul 90 ul

TEMED 3ul 9 ul

（3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液

0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）

（4）4 ×上样缓冲液

0.32% Tris-HCL 6.4ml

4%SDS（PH7.2）8ml

16%甘油3.2 ml

溴酚蓝0.024g

ddH2o 2.4ml

(5) 洗脱液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，1μmol/L ZnCl2，pH7. 6

漂洗液；50mmol/L Tris -HCl，5mmol/L CaCl2，1μmol/L ZnCl2，pH7. 6 （7）孵育液：50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 1μmol/L ZnCl2, 0. 02% Brij-35 ,pH7.6

（8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝R-250，30%甲醇，10%乙酸

（9）脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%

二：步骤

1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。

2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。

3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。与4×上样缓冲液（4%SDS，0.25 mmol/L Tris-HCl，40%甘油，0.1% 溴酚蓝）按照1∶3混合。

4.配制分离胶和浓缩胶，15ul/孔上样（根据表达强忍和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v恒压跑至分离胶和浓缩胶交界处改为90毫安恒流，直至溴酚蓝跑出胶外。

5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，1μmol/L ZnCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次45分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 1μmol/L ZnCl2, 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃孵育18h。

6.孵育结束后经染色液(0.05% Coomassic 亮蓝、30%甲醇、10%乙酸) 染色3h,及脱色液A、B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%) 分别脱色0.5、1、2h后，显示出MMP-2（72KD）和MMP -9（92 KD）为位于蓝色背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。

注意事项：

1．制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。

2．明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。