血红蛋白的提取和分离 ppt课件

情境导引
为年老多病的人注射丙种 球蛋白，可以在一定程度上增强 其身体的抵抗力。在动物体内， 丙种球蛋白和许多蛋白质混合 在一起。要获得纯净的丙种球蛋 白制品，就必须进行提取和分离。 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差 异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分 子产生不同的迁移速度，从而实现了样品中各种 分子的分离。
课题3 血红蛋白的提取和分离
课标领航
1．概述凝胶色谱法、电泳法等分离大分子 的基本原理。 2．能根据凝胶色谱过程中的现象和结果， 评价实验操作的过程是否规范，分析实验结 果。 3．尝试对血液中血红蛋白的提取和分离， 体验从复杂的体系中提取生物大分子的基本 过程和方法。 【重点】 凝胶色谱法、电泳法基本原理。 【难点】 实验操作的过程及分析。
思考感悟 2．在血红蛋白释放过程中，加入蒸馏水和甲苯的 目的是什么？ 【提示】 (1)加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。 (2)细胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机 溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红 蛋白。
(3)分离血红蛋白溶液：把搅拌好的混合液离心后, 将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层,
3．纯化：通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的
杂质蛋白除去。操作如下： (1)凝胶色谱柱的制作。 (2)凝胶色谱柱的装填
①材料：本实验使用的是交联葡聚糖凝胶。 ②方法：凝胶用_蒸__馏__水__充分溶胀后，配成凝胶悬 浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。不能有__气__泡__存
在；不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现象。 (3)样品的加入和洗脱 ①a.准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上 的缓冲液缓慢下降到与__凝__胶__面__平齐，关闭出口。
电极移动。
3．作用：电泳利用了待分离样品中各种分子带电 性质的差异及分子本身的大小、形__状__的不同，使带 电分子产生不同的__迁__移__速__度____，从而实现样品中 各种分子的分离。 4．方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚 丙烯酰胺凝胶电泳。
四、实验操作 1．样品处理：通过_红__细__胞__的__洗__涤____、 _血__红__蛋__白__的__释__放_______、分离血红蛋白溶液等操作 收集血红蛋白溶液。 (1)红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。分离时采取 低速短时间离心，直至上清液中没有黄色，表明红 细胞已洗涤干净。
间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白： 离心速度过高和时间过长会使_白__细__胞__等一同沉淀， 达不到分离效果。
2．色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接 放在洗脱液中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶用 __沸__水__浴__加热，加速膨胀。 3．凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得 有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱 次序，降低分离效果。 4．蛋白质的分离：如果红色区带__均__匀__一__致__地 移动，说明色谱柱制作成功。
大小、形状不同
聚丙烯酰胺凝胶电泳 在凝胶中加入SDS，使 蛋白质解聚成单链，与
各种蛋白质形成蛋白 质—SDS复合物，使其 迁移速率完全取决于分
子的大小
例1 (2011年聊城高二检测)有关凝胶色谱法和电 泳法的说法正确的是( ) A．它们都是分离蛋白质的重要方法 B．它们的原理相同 C．使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不 需要 D．以上说法都正确 【尝试解答】 __A__
基础自主梳理
一、凝胶色谱法 1．概念：也称作分配色谱法，是根据_相__对__分__子___ 质量的大小分离蛋白质的有效方法。 2．原理 (1)由微小的多孔球体构成的凝胶，内部有许多贯 穿的通道。
(2)由相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对 分子质量_较__小__的蛋白质容易进入凝胶内部的通道， 路程较长，移动速度较慢，而相对分子质量较大的 蛋 白 质 无 法 进 入 凝 胶 内 部 的 通 道 ， 只 能凝在胶__外__部____ 移动，路程较短，移动速度较快，从而使相对分子 质量不同的蛋白质分子得以分离。 二、缓冲溶液 1．作用：在一定范围内，抵制外界的__酸__和__碱__对溶 液pH的影响，维持pH基本不变。
b．加样：用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到
色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面。 c．加样后：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内. ②洗脱：加入_磷__酸__缓__冲__液___，打开下端出口，进行
洗脱。 4．纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
五、操作提示 1．红细胞的洗涤：洗涤次数、离__心__速__度__与离心时
思考感悟 1．洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐 水？ 【提示】 生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定 而不至于破裂。在未洗净血浆中的杂质蛋白前， 红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质 血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。
(2)血红蛋白的释放：在蒸馏水和__甲__苯____的作 用下，红细胞破裂，
1．蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析
直径大小
运动方式 运动速度 运动路程
洗脱次序
相对分子质量大
相对分子质量小
大于凝胶颗粒空隙直 小于凝胶颗粒空隙直
径
径
垂直向下运动
无规则的扩散运动
较快
较慢
较短
较长
先从凝胶柱中洗脱出 来
后从凝柱中洗脱出来
2.电泳方法
琼脂糖凝胶电泳
由于琼脂糖本身不带电 荷，各种分子在电场中 迁移速率决定于所带电 荷性质的差异及分子的
于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的红色透
明液体。 2．粗分离：即透析 (1)方法：将血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋 放入一定量适宜浓度的_磷__酸__缓__冲__液__中，透析12 h. (2)目的：将样品中分子较小的杂质除去。 (3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分 子物质保留在袋内。
2．配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成， 通过调节缓冲剂的_使__用__比__例_就可以得到不同pH范
围内使用的缓冲液。
三、电泳 1．概念：指_带__电__粒__子_在电场的作用下发生迁移的
过程。 2．原理：在一定的pH下，多肽、核酸等生物大分
子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作 用下，这些带电分子会向着与其所带电荷_相__反__的