血红蛋白的提取和分离 ppt课件

3．纯化：通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的
杂质蛋白除去。操作如下： (1)凝胶色谱柱的制作。 (2)凝胶色谱柱的装填
①材料：本实验使用的是交联葡聚糖凝胶。 ②方法：凝胶用_蒸__馏__水__充分溶胀后，配成凝胶悬 浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。不能有__气__泡__存
在；不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现象。 (3)样品的加入和洗脱 ①a.准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上 的缓冲液缓慢下降到与__凝__胶__面__平齐，关闭出口。
2．配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成， 通过调节缓冲剂的_使__用__比__例_就可以得到不同pH范
围内使用的缓冲液。
三、电泳 1．概念：指_带__电__粒__子_在电场的作用下发生迁移的
过程。 2．原理：在一定的pH下，多肽、核酸等生物大分
子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作 用下，这些带电分子会向着与其所带电荷_相__反__的
b．加样：用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到
色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面。 c．加样后：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内. ②洗脱：加入_磷__酸__缓__冲__液___，打开下端出口，进行
洗脱。 4．纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
五、操作提示 1．红细胞的洗涤：洗涤次数、离__心__速__度__与离心时
基础自主梳理
一、凝胶色谱法 1．概念：也称作分配色谱法，是根据_相__对__分__子___ 质量的大小分离蛋白质的有效方法。 2．原理 (1)由微小的多孔球体构成的凝胶，内部有许多贯 穿的通道。
(2)由相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对 分子质量_较__小__的蛋白质容易进入凝胶内部的通道， 路程较长，移动速度较慢，而相对分子质量较大的 蛋 白 质 无 法 进 入 凝 胶 内 部 的 通 道 ， 只 能凝在胶__外__部____ 移动，路程较短，移动速度较快，从而使相对分子 质量不同的蛋白质分子得以分离。 二、缓冲溶液 1．作用：在一定范围内，抵制外界的__酸__和__碱__对溶 液pH的影响，维持pH基本不变。
间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白： 离心速度过高和时间过长会使_白__细__胞__等一同沉淀， 达不到分离效果。
2．色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接 放在洗脱液中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶用 __沸__水__浴__加热，加速膨胀。 3．凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得 有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱 次序，降低分离效果。 4．蛋白质的分离：如果红色区带__均__匀__一__致__地 移动，说明色谱柱制作成功。
思考感悟 1．洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐 水？ 【提示】 生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定 而不至于破裂。在未洗净血浆中的杂质蛋白前， 红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质 血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。
wk.baidu.com
(2)血红蛋白的释放：在蒸馏水和__甲__苯____的作 用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。
电极移动。
3．作用：电泳利用了待分离样品中各种分子带电 性质的差异及分子本身的大小、形__状__的不同，使带 电分子产生不同的__迁__移__速__度____，从而实现样品中 各种分子的分离。 4．方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚 丙烯酰胺凝胶电泳。
四、实验操作 1．样品处理：通过_红__细__胞__的__洗__涤____、 _血__红__蛋__白__的__释__放_______、分离血红蛋白溶液等操作 收集血红蛋白溶液。 (1)红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。分离时采取 低速短时间离心，直至上清液中没有黄色，表明红 细胞已洗涤干净。
核心要点突破
解读实验原理
1．蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析
直径大小
运动方式 运动速度 运动路程
洗脱次序
相对分子质量大
相对分子质量小
大于凝胶颗粒空隙直 小于凝胶颗粒空隙直
径
径
垂直向下运动
无规则的扩散运动
较快
较慢
较短
较长
先从凝胶柱中洗脱出 来
后从凝柱中洗脱出来
2.电泳方法
琼脂糖凝胶电泳
由于琼脂糖本身不带电 荷，各种分子在电场中 迁移速率决定于所带电 荷性质的差异及分子的
大小、形状不同
聚丙烯酰胺凝胶电泳 在凝胶中加入SDS，使 蛋白质解聚成单链，与
各种蛋白质形成蛋白 质—SDS复合物，使其 迁移速率完全取决于分
子的大小
例1 (2011年聊城高二检测)有关凝胶色谱法和电 泳法的说法正确的是( ) A．它们都是分离蛋白质的重要方法 B．它们的原理相同 C．使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不 需要 D．以上说法都正确 【尝试解答】 __A__
课题3 血红蛋白的提取和分离
课标领航
1．概述凝胶色谱法、电泳法等分离大分子 的基本原理。 2．能根据凝胶色谱过程中的现象和结果， 评价实验操作的过程是否规范，分析实验结 果。 3．尝试对血液中血红蛋白的提取和分离， 体验从复杂的体系中提取生物大分子的基本 过程和方法。 【重点】 凝胶色谱法、电泳法基本原理。 【难点】 实验操作的过程及分析。
于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的红色透
明液体。 2．粗分离：即透析 (1)方法：将血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋 放入一定量适宜浓度的_磷__酸__缓__冲__液__中，透析12 h. (2)目的：将样品中分子较小的杂质除去。 (3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分 子物质保留在袋内。
思考感悟 2．在血红蛋白释放过程中，加入蒸馏水和甲苯的 目的是什么？ 【提示】 (1)加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。 (2)细胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机 溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红 蛋白。
(3)分离血红蛋白溶液：把搅拌好的混合液离心后, 将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层,
情境导引
为年老多病的人注射丙种 球蛋白，可以在一定程度上增强 其身体的抵抗力。在动物体内， 丙种球蛋白和许多蛋白质混合 在一起。要获得纯净的丙种球蛋 白制品，就必须进行提取和分离。 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差 异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分 子产生不同的迁移速度，从而实现了样品中各种 分子的分离。