血红蛋白的提取和分离(经典)
血红蛋白的分离和提取
血红蛋白的分离和提取血红蛋白是一种存在于红细胞中的重要蛋白质，它负责运输氧气到身体的各个部位。
对于血红蛋白的分离和提取，无论是在医学研究、疾病诊断还是生物技术领域，都具有重要的意义。
要进行血红蛋白的分离和提取，首先需要了解它的基本性质。
血红蛋白由珠蛋白和血红素组成，相对分子质量约为 64500，等电点在 7 左右。
准备工作是必不可少的。
我们需要新鲜的血液样本，通常可以从健康的志愿者或者实验动物身上获取。
采集到血液后，要尽快进行处理，以防止血红蛋白的变性和降解。
第一步是红细胞的分离。
将采集到的血液加入抗凝剂，如肝素或柠檬酸钠，然后通过离心的方法，将红细胞从血浆中分离出来。
离心的速度和时间需要根据具体情况进行调整，一般来说，以较低的转速离心一段时间，就可以使红细胞沉淀在离心管的底部。
得到红细胞后，接下来就是裂解红细胞以释放出血红蛋白。
常用的方法是低渗裂解法，将红细胞置于低渗溶液中，如蒸馏水，红细胞会因为吸水而膨胀破裂，释放出其中的内容物，包括血红蛋白。
然后是去除杂质。
裂解后的溶液中含有大量的其他细胞成分和杂质，需要通过过滤、离心等方法进行去除。
例如，可以再次离心，使较大的细胞碎片沉淀下来，然后取上清液。
接下来就是血红蛋白的初步分离。
常用的方法有盐析法。
向溶液中逐渐加入适量的中性盐，如硫酸铵，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度会逐渐降低而沉淀出来。
不同的蛋白质在不同的盐浓度下沉淀，通过控制盐的浓度，可以初步分离出血红蛋白。
经过初步分离后，还需要进一步的纯化。
层析法是常用的手段之一。
比如凝胶过滤层析，根据蛋白质分子大小的不同进行分离；离子交换层析，依据蛋白质的带电性质差异来分离。
在分离和提取的过程中，要始终注意保持适当的温度、pH 值等条件。
温度过高或过低、pH 值不适宜都可能导致血红蛋白的变性和失活。
另外，实验过程中的操作要规范、细致，尽量减少人为因素造成的误差和损失。
例如，在转移溶液时要避免洒出，使用的仪器要经过严格的清洗和消毒。
课题3_血红蛋白的提取和分离(正式)
装配好的凝胶柱
2.3 样品的加样和洗脱
A、调节缓冲液面 B、滴加透析样品 C、样品渗入凝胶床 D、洗脱
E、收集 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时， 用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连 续收集。
实验结果
实验结果与分析 1.样品的处理
血液离心后分层
成功！
失败原因：
1.洗涤次数过少，未能除去血浆蛋白。
透析目的是：除去样品中分子量较小的杂质。
说明：透析袋是一种半透膜，能使小分子自由进出，而大 分 子不能通过。
实验操作
（一）样品处理
（二）.凝胶色谱操作
2.1 凝胶色谱柱的制作
完成！
取胶皮盖
打孔
安装玻璃管 安装尼龙网 安装100目尼龙纱
组装
2.2 凝胶色谱柱的装填
材料：交联葡聚糖凝胶（G-75） 装填方法：
由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支 与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可 以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖， 观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色 谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体 以消除气泡，消除不了时要重新装柱。
92.0 87.7 81.5 73.5 62.5 51.0
61.0 72.0 81.0 87.0 91.5 94.7
39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.3
调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同 pH范围内使用的缓冲液。
（三）电 泳
1、概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2、原理：
电泳：
剥胶、染色及脱色
凝胶板剥离：电泳结束后，撬开玻璃板， 将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加染色液 染色，然后用脱色液脱色。
血红蛋白的提取和分离教案
血红蛋白的提取和分离教案教案一: 血红蛋白的提取和分离教学目标:- 理解血红蛋白的结构和功能。
- 学习血红蛋白的提取和分离方法。
- 掌握实验室中分离血红蛋白的步骤和操作技巧。
教学步骤:引入活动:在开始实验之前，首先向学生介绍血红蛋白的结构和功能，以及为什么需要提取和分离血红蛋白。
1. 血红蛋白的提取:a. 实验材料准备:- 鲜血样本- 磷酸缓冲溶液（pH 7.4）- 离心管- 离心机- 冷藏器b. 实验步骤:1) 将鲜血样本取出，用磷酸缓冲溶液稀释。
2) 将稀释后的样本置于离心管中，离心10分钟。
3) 将离心后的上清液转移至新的离心管中，置于冷藏器中。
2. 血红蛋白的分离:a. 实验材料准备:- 血红蛋白样本- 离心管- pH 4.7缓冲溶液- pH 5.2缓冲溶液- pH 6.0缓冲溶液- pH 7.0缓冲溶液b. 实验步骤:1) 将血红蛋白样本转移到离心管中。
2) 分别加入pH 4.7、pH 5.2、pH 6.0和pH 7.0缓冲溶液，使其达到不同的酸碱度。
3) 转动离心管，使其充分混合。
4) 将混合溶液置于冰箱中冷藏一段时间。
5) 通过离心，收集上层液体，然后分别加入酸、碱溶液，使其达到酸碱中和。
6) 重复以上步骤，直到获得纯净的血红蛋白。
实验注意事项:- 实验过程中要注意安全，佩戴实验室衣物和手套。
- 实验器材要严密封闭，避免反应物外泄。
- 实验后要彻底清理实验场地。
教学总结:通过本次实验，学生可以了解血红蛋白的结构和功能，并掌握了提取和分离血红蛋白的方法。
同时，学生也了解了实验室实验的注意事项和操作技巧。
血红蛋白提取和分离的四步
血红蛋白提取和分离的四步血红蛋白是存在于人类血液中的一种重要蛋白质，它承担着将氧气从肺部输送到身体各个组织和器官的重要功能。
因此，对血红蛋白的提取和分离具有重要的生物学意义和医学应用前景。
接下来将介绍血红蛋白提取和分离的四个步骤。
第一步：血样采集首先需要采集含有血红蛋白的血样。
一般来说，静脉采血是最常用的方法。
在采集血样之前，需要确保采血器具干净无菌，以避免外部微生物的污染。
同时，还要确保采集到的血样足够新鲜，以保证血红蛋白的活性和稳定性。
第二步：红细胞裂解将采集到的血样进行红细胞裂解，将红细胞膜破坏，释放血红蛋白。
一般可以使用生理盐水等溶液进行红细胞裂解。
在裂解的过程中，需要注意温度和pH值的控制，以确保血红蛋白的完整性和稳定性。
第三步：血红蛋白提取在红细胞裂解后，血液中的血红蛋白被释放出来，需要进行进一步的提取。
常用的提取方法包括离心、凝胶过滤、离子交换层析等。
通过这些方法，可以将血红蛋白从其他蛋白质和杂质中分离出来，得到比较纯净的血红蛋白样品。
第四步：血红蛋白分离最后一步是对提取到的血红蛋白进行分离。
根据血红蛋白的性质和不同的应用需求，可以选择不同的分离方法。
例如，可以利用凝胶电泳、高效液相色谱等技术对血红蛋白进行分离和纯化。
通过这些方法，可以得到高纯度的血红蛋白样品，为后续的研究和应用提供基础。
通过以上四个步骤，我们可以完成血红蛋白的提取和分离工作。
这些工作不仅有助于深入了解血红蛋白的生物学功能和结构特性，还为相关疾病的诊断和治疗提供了重要的基础。
希望在未来的研究中，可以进一步完善血红蛋白提取和分离的技术，为人类健康事业做出更大的贡献。
血红蛋白的分离和提取
血红蛋白的分离和提取在探索血红蛋白的分离和提取时，我们仿佛打开了一扇通往生命奥秘的大门。
血红蛋白，这个在我们体内默默工作的英雄，负责运送氧气，维持生命的火焰。
今天，我们就来深入探讨一下，如何从头到尾把它分离出来。
首先，了解血红蛋白的基本结构很重要。
它由四个亚基构成，每个亚基里都有一个铁离子，正是这个小小的铁离子让血红蛋白有了“吸氧”的能力。
嘿，想想看，这铁可是血液的灵魂。
我们提取它的第一步就是要把这些亚基给分开。
通常，我们使用盐析法。
这是一种古老却有效的方法。
简单来说，就是用不同浓度的盐水，使血液中的蛋白质沉淀下来。
盐的浓度高了，蛋白质就沉底了。
这个过程像是在筛选出珍珠，越是纯粹的成分，越容易浮出水面。
接下来，我们要进行离心。
听起来挺高大上的，其实就是把样品放进一个高速旋转的机器里。
你可以想象一下，像个旋转的过山车。
这样，重的成分会被甩到底部，而轻的成分则会悬浮在上面。
经过几轮离心，我们就能获得较为纯净的血红蛋白。
这一步确实需要耐心，毕竟急于求成可不行。
接着，我们还可以使用层析法。
这种方法就像在看一场精彩的魔术表演。
通过使用不同的色谱柱，血红蛋白会被分成不同的成分，层层剥离，最终呈现出它的真面目。
我们可以使用亲和层析或者离子交换层析，具体选择哪种方法，得看实际情况和目标而定。
无论怎样，成功提取的瞬间总是令人兴奋。
之后，我们必须验证提取的血红蛋白是否有效。
通常，我们会用紫外光谱法来测量它的吸收光谱，确保其波长符合标准。
这可不是马虎的事，稍有不慎，可能会错失重要的实验数据。
检查后，如果一切正常，那就可以进行后续的研究或应用了。
在这个过程中，温度和pH值的控制同样至关重要。
想想看，如果温度过高，蛋白质就会变性，失去活性。
这就像一朵美丽的花，失去了阳光和水分，最终枯萎。
保持适宜的环境条件，才能让我们的血红蛋白焕发活力。
总结来说，血红蛋白的分离和提取是一门复杂却充满乐趣的科学。
每一个环节都需要细致入微的操作，绝不能掉以轻心。
【高中生物】高中生物知识点：血红蛋白的提取和分离
【高中生物】高中生物知识点：血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离：1、实验原理蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。
（1）凝胶色谱法（分配色谱法）：①原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
②凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
③分离过程：混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
④作用：分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。
（2）缓冲溶液①原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3?NaHCO3， NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。
②缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。
(3）凝胶电泳法：①原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。
②分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
③分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质?SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
2、实验步骤（1）样品处理① 红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。
②血红蛋白的释放在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。
注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。
加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。
血红蛋白的提取与分离
②血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶
色谱分离时可以通过观察颜色来判断
什么时候应该收集洗脱液。这使血红
蛋白的分离过程非常直观，大大简化
了实验操作。
•1.洗涤目的：去 红细胞的洗涤 杂蛋白 除 ，利于后 或血浆蛋白 2.洗涤方法 续步骤的分离纯化。
采用低速短时间离心，如 500 用 胶头吸管 r／min,离心 2 min，然后
离 心 管 中 ， 以 2000 r ／
min的速度离心10min后，
可以明显看到试管中的溶
液分为4层：
高速长时间离心
第4层：红细胞破碎物沉淀 层（暗红色）
用 滤纸 过滤除去脂溶性 沉淀层，于 分液 漏斗中
静置片刻后，分出下层 的 红色 透明液体。
粗分离
--透析（去除分子质量较
小
的杂质）
取1mL的血红蛋白溶液装入 透 （pH为7.0 ）透析12 h。
A. 它们都是分离蛋白质的重要方法 B. 它们的原理相同不同
)
C. 使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要 都需要使用缓冲溶液维持PH D. 以上说法都正确
实验步骤
蛋白质的提取和分离一般分为四步：
样品处理
红细胞的洗涤 血红蛋白的释放 分离血红蛋白溶液
透析—去除样品中分子量较小的杂质
粗分离
纯化 用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质
合物，SDS所带负电荷的量大大超过蛋白质分子原有的
电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使电泳
迁移率完全由蛋白质分子的大小决定。
例题5.下列各项中不属于电泳使样品中各分子分离的
原因的是( D )
A.分子带电性质的差异
B.分子的大小 C.分子的形状 D.分子的变性温度
血红蛋白的提取与分离
解决方案：开发新 型分离纯化技术， 提高分离纯度和收 率，降低成本
发展趋势：利用基 因工程技术改造血 红蛋白，提高其稳 定性和功能性
未来展望：血红蛋白 提取与分离技术将更 加成熟和高效，为生 物医学领域的发展提 供有力支持
技术改进：不断优 化提取和分离技术， 提高血红蛋白的纯 度和产量。
新技术的应用：利用 新兴技术如基因工程、 蛋白质工程等，实现 血红蛋白的定向生产 和分离纯化。
高效液相色谱法：结合了经典液相色谱和气相色谱的原理，利用吸附、分配、离子交换等原理进行分离
分离纯化的目的：去除杂质，获得高纯度的血红蛋白
分离纯化的原理：利用不同物质在介质中的溶解度、吸附性、渗透压等性质进行分离
分离纯化的方法：包括沉淀法、色谱法、电泳法等 分离纯化的流程：包括粗分离、纯化、精制等步骤
添加标题
血红蛋白的分离纯化：通过分 离纯化技术，可以从生物样本 中提取出高纯度的血红蛋白， 用于生物医学研究和治疗。
添加标题
血红蛋白在药物输送方面的应用： 血红蛋白可以作为药物输送载体， 将药物输送到病变部位，提高药 物的疗效并降低副作用。
添加标题
血红蛋白在血液替代品方面的应 用：血红蛋白可以作为血液替代 品，用于输血治疗，缓解血液短 缺问题，并避免异体输血可能引 发的免疫反应。
血红蛋白在医疗领域的应用：血红蛋白具有携氧能力，可用于治疗某些缺氧性疾病， 如贫血和心脑血管疾病。
血红蛋白在生物工程领域的应用：血红蛋白可作为生物催化剂，用于加速化学反应， 具有高效、环保的优点。
血红蛋白在食品工业领域的应用：血红蛋白可用于生产新型食品，如血红蛋白饮料、 血红蛋白面包等，具有营养价值和保健功能。
拓展应用领域：不 仅局限于医学领域 ，还将应用于生物 工程、制药等领域 。
人教版高中生物选修1教学案：专题五 课题3 血红蛋白的提取和分离 含答案(1)
课题3血红蛋白的提取和分离1．凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法，相对分子质量大的先洗脱出来，相对分子质量小的后洗脱出来。
2．在电泳中，待分离样品中分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状都会影响分子的迁移速度。
3．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率完全取决于分子的大小。
4．蛋白质提取和分离的一般步骤是：样品处理及粗分离、纯化和纯度鉴定。
5．透析法可除去相对分子质量较小的杂质。
6．在对蛋白质进行纯度鉴定时，使用最多的方法是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
一、蛋白质分离的原理和方法1.分离原理依据蛋白质各种特性的差异分离蛋白质，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等。
2.凝胶色谱法(1)概念：也称为分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
(2)凝胶：微小的多孔球体，大多数由多糖类化合物构成，内部有许多贯穿的通道。
(3)原理：[填表]蛋白质类型能否进入凝胶内部移动路程移动速度相对分子质量较小能较长较慢相对分子质量较大不能较短较快3．缓冲溶液(1)作用：在一定范围内，抑制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。
(2)配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。
4．电泳(1)概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
(2)原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。
②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
④方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
二、血红蛋白提取和分离的实验操作[填图]1．凝胶色谱法中移动速度快的是()A．相对分子质量大的B．相对分子质量小的C．溶解度高的D．溶解度低的[解析]选A凝胶色谱法是根据相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。
血红蛋白的提取和分离
本课题学习要点和难点
体验从复杂体系中提取生物大分子旳基本过 程和措施，并了解色谱法、电泳法等分离生 物大分子旳基本原理。
3、课题要点：凝胶色谱法旳原理和措施 4、课题难点：
①样品旳预处理 ②色谱柱填料旳处理和色谱柱旳装填。
2023年4月14日宣告人类基因组序列图完毕，这标志着进入了后基因组和蛋 白质组时代
2、你装填旳凝胶色谱柱是否有气泡产生？你旳色谱 柱装填得成功吗？你是怎样判断旳？
因为凝胶是一种半透明旳介质，所以能够在凝胶柱旁放一支与 凝胶柱垂直旳日光灯，检验凝胶是否装填得均匀。另外，还能够 加入大分子旳有色物质，例如蓝色葡聚糖—2023或红色葡聚糖， 观察色带移动旳情况。假如色带均匀、狭窄、平整，阐明凝胶色 谱柱旳性能良好。假如色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体 以消除气泡，消除不了时要重新装柱。
血红蛋白的提取和分 离
本课题学习目的
体验从复杂体系中提取生物大分子旳基本过 程和措施，并了解色谱法、电泳法等分离生 物大分子旳基本原理。
1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④ 它们在血红蛋白旳提取中分别起到什么作用。
2. 主要原理：
①凝胶色谱法分离蛋白质旳原理
②电泳法分离样品旳原理
③缓冲溶液旳构成和作用机理
④洗脱：小心加入pH=7.0 旳20mmol/l旳磷酸缓冲液到合 适高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
⑤搜集：待红色旳蛋白质接近色谱柱底端时，用试管搜集流 出液，每5ml搜集一试管，连续搜集。（在分离过程中，假如 红色区带均匀一致旳移动，阐明色谱柱制作成功）
⑥注意：正确旳加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、 贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁围绕移动。
装配好旳凝胶柱
血红蛋白的提取和分离
⾎红蛋⽩的提取和分离⾎红蛋⽩的提取与分离蛋⽩质的分离和提取的原理是什么？根据蛋⽩质各种特性的差异，如分⼦的形状和⼤⼩、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附的性质和对其他分⼦的亲和⼒等等，可以⽤来分离不同蛋⽩质。
【基础知识】㈠凝胶⾊谱法（分配⾊谱法）：1、概念：根据被分离蛋⽩质的，利⽤具有⽹状结构的凝胶的分⼦筛选作⽤，来分离蛋⽩质的有效⽅法。
2、原理：当不同的蛋⽩质通过凝胶时，相对的蛋⽩质容易进⼊凝胶内部的通道，路程，移动速度，⽽的蛋⽩质⽆法进⼊凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速，相对分⼦质量不同的蛋⽩质因此得以分离。
3、具体过程：A. 的蛋⽩质由于作⽤进⼊凝胶颗粒内部⽽被滞留；的蛋⽩质被排阻在凝胶颗粒外⾯，在了⾥之间迅速通过。
B.（1）混合物上柱；（2）洗脱开始，的蛋⽩质扩散进⼊凝胶颗粒内；的蛋⽩质被排阻于凝胶颗粒之外；（3）的蛋⽩质被滞留；的蛋⽩质被向下移动。
（4）不同的蛋⽩质分⼦完全分开；（5）的蛋⽩质⾏程较短，已从中洗脱出来，的蛋⽩质还在⾏进中。
㈡缓冲溶液：1、概念：在⼀定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH 发⽣明显变化的作⽤叫做缓冲作⽤，具有缓冲作⽤的溶液叫做缓冲溶液。
2、作⽤：能够抵制的对溶液的的影响，维持PH 基本不变。
3、缓冲溶液的配制通常由种缓冲剂溶解于⽔中配制⽽成。
调节缓冲剂的就可以制得使⽤的缓冲液㈢电泳：1、概念：指发⽣迁移的过程。
颗（2）（3）（4）（5） A2、原理：许多重要的⽣物⼤分⼦，如等都具有在下，这些基团会带上。
在电场的作⽤下，这些带电分⼦会向着与其移动。
电泳利⽤了待分离样品中各种分⼦以及分⼦本⾝、的不同使带电分⼦产⽣不同的，从⽽实现样品中各种分⼦的分离。
3、分类：电泳电泳。
测定（蛋⽩质相对分⼦质量）通常⽤⼗⼆烷基硫酸钠（SDS ）—聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋⽩质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分⼦的⼤⼩等因素。
为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加⼊。
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凝胶内部的通道 路程较长 移动速度较慢
相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程
凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示
二、缓冲溶液
1.作用: 在一定范围内，能够抵制 外界的酸和碱 对溶
液PH值的影响，维持PH 基本 不变。 调节缓冲剂 使用比例 的就可以制得在不同PH范围内使 用的缓冲液。 磷酸缓冲液 3.提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________ , 其目的是: 利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科 学研究(活性)
3.样品的加入和洗脱
1.调液面 2.加样 3.再调液面 4.洗脱 5.收集
缓冲液 凝胶
记
①调整缓冲液面：与凝胶面平齐
②滴加透析样品：加到色谱柱的（ 顶端 ）
③样品渗入凝胶床：（ 样品完全进凝胶层）
④再调整缓冲液面洗脱：
⑤收集：待（ 红色的蛋白质 ）接近色谱柱底 端时收集
色谱柱制作成功的标志： 红色区带均匀一致的移动
H
C COOH
C C OH H N R2
R3
二肽
H2O H2O
氨基酸的结合方式:脱水缩合
H O H NH2 C C N 肽键 R1 H O H C C N 肽键 R2 H C R3 COOH
三 肽
二肽
H2O H2O
• 以此类推，由多个氨基酸分子缩合而成的含有多个 肽键的化合物，叫多肽（链状）。肽链盘曲，折叠， 形成有一定空间结构的蛋白质分子。
（1）凝胶色谱柱的制作
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两 端需用砂纸磨平。
②底塞的制作： 打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。
凝胶色谱柱的制作
（2）凝胶色谱柱的装填
①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。
②凝胶的前处理：配臵凝胶悬浮液：计算并称取一定 量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成 凝胶悬浮液。 ③凝胶色谱柱的装填方法： A、固定：将色谱柱装臵固定在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之 间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为 气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效 果。
4、纯度鉴定（电泳）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质 的鉴定。 1、垂直板电泳装置
2、稳流稳压电泳仪； 3、微量进样器（可用微量移液器代替）
（1）、 胶板的制备： ①.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干 ②.把玻璃板在灌胶支架上固定好
聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图
（A为正面，B为剖面） 1：样品胶pH6.7 2：浓缩胶pH6.7 3：分离胶pH8.9 4：电极缓冲液pH8.3 10
①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先 处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。 ②测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳， 这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所 带电荷的性质和分子的大小、形状。
体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了 解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。
1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。 2、主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理 ②电泳法分离样品的原理 ③缓冲溶液的组成和作用机理 3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点： ①样品的处理 ②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。
磁力搅拌器
搅拌器转子
搅拌器正在工作
（3）分离血红蛋白溶液：
用滤纸过滤，除去 脂溶性沉淀层，于 分液漏斗中静置片 刻后，分出下层的 红色透明液体。
试管中溶液层次
甲苯层（无色透明） 白色薄层固体 红色透明液体
杂质沉淀层（暗红色）
柜式离心机
2.粗分离----透析（去除分子量较小的杂质）
（1）用 透析
方法进行粗分离，透析袋由半透膜制 成， 玻璃纸、肠衣、膀胱膜 常用 。将透析袋放入 溶液中进行透析。 磷酸缓冲
（2）透析的原理是 透析袋能使小分子自由进出，而将 大分子保留在袋内 （3）透析的目的是
去除样品中分子量较小的杂质
。
透析过程动画演示
3、纯化（凝胶色谱）---去除相对分子量 较大的杂质蛋白
（2）释放血红蛋白
思考：
1. 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了 哪些物质？ 2. 为了加速释放过程，采取了什么措施？ （使用磁力搅拌器充分搅拌） 目的分析： 使红细胞大量吸水胀裂 1. 蒸馏水的作用是______________________________。 溶解红细胞的细胞膜 2. 加入甲苯的作用是____________________________。 加速红细胞的破裂 3. 充分搅拌的目的是____________________________。
②加透析样品
注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。 2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。
材料：交联葡聚糖凝胶G-75 20mmol/L磷酸缓冲液 “G”表示什么？75代表什么？ 步骤 ① 固定色谱柱 ② 计算称量凝胶 ③ ④ ⑤ 配制悬浮液 装填悬浮液 洗涤平衡 操作要求 色谱柱垂直固定在支架上 根据色谱柱体积计算凝胶用量 凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀 一次性缓慢倒入；轻轻敲打 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h
琼脂糖凝胶电泳示意图
电泳槽
迷你双垂直电泳槽
卧式电泳槽
等电聚焦多用电泳槽
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SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
（1）、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于
它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。 （2）、SDS能与各种蛋白质形成蛋白原有电荷 量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳 分子的大小 迁移率完全取决于（ ）。
教材P70：为什么凝胶的装填要紧密、
均匀？
如果装填不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形 成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品 分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液中蛋白 质的洗脱次序，影响分离的效果。
装配好的凝胶柱
(3）样品加入与洗脱
①加样前 打开下端出口，使柱内凝 缓冲液 胶面上的（ ）缓慢下 降到与（ 凝胶面）平齐， 关闭出口
11、相关计算
①氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不 存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨 基，另一端只有一个羧基（不计R基上的氨基和 羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨 基和羧基都是一个
②若有个n氨基酸分子缩和成m条肽链,则可形成 n-m n-m ________个肽键,脱去______个水分子，至有氨基 m 和 羧基各 ____个
思考1 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质 的何种作用，作用结果是什么被破坏？
变性、变性、空间结构
思考2 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞 核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。
本课题学习目标
实验操作
（一）蛋白质提取和分离步骤 红细胞的洗涤 样品处理 血红蛋白的释放 分离血红蛋白溶液 粗分离： 透析—去除样品中分子量较小的杂质 纯化：用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的
杂质
纯度鉴定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （二）操作过程
1. 用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞 提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA 的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋 白含量丰富，便于提取血红蛋白。 2. 血液有哪些成分？ 水 分 血红蛋白 血浆 其他物质： 血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等 血细 胞 白细胞 血小板 红细胞
③蛋白质可以含有一条或n条肽链、肽链通过化 学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结 构
④关于蛋白质相对分子量的计算： n 个氨基酸形 成m条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a,那么 由此形成的蛋白质的相对分子量为______________
n · - (n - m) · a 18
血红蛋白
一、基本概念及原理
1、凝胶色谱法
凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根 据分子量的大小分离蛋白质的方法之一，又 称分子筛层析 。 凝胶实际上是一些微小的多孔球体，例 如：浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙 烯酰胺、葡聚糖凝胶等
原理： 当不同的蛋白质通过凝胶时
相对分子质量较小 容易进入 相对分子质量较大 无法进入凝胶 内部的通道 只能在凝胶外部移动 路程较短 移动速度较快
2.配制: 通常由 1~2 种缓冲剂 溶解于水中配制而成。
思考：说出人体血液中缓冲对。 NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3
三、 电泳---血红蛋白的分离鉴定方法
1.概念： 带电粒子在 电场作用下发生 迁移 的过程。 2.原理： 许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都
具有 可解离 的基团，在一定的PH下，这些基团会带 上 正电 或 负电 。在电场的作用下，这些带电分子 会向着的与其所带电荷相反 的电极移动。电泳利用 了待分离样品中各种分子 带电性质的差异 以及分子 本身的 大小、 形状的不同，使带电分子产生不同 的 迁移速度 ，从而实现样品中各种分子的分离。
一、基础知识 (一）蛋白质 1、含量 占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的 有机物 2、组成元素 C、H、O、N 3、相对分子质量
高分子化合物
4、基本组成单位 氨基酸 5、氨基酸通式 H R
C NH2
COOH
写出氨基酸脱水缩合形成二肽示意图
6、氨基酸连接方式
脱水缩合