转思路迪博客：慢病毒载体发展

转思路迪博客：慢病毒载体发展和“简单型”逆转录病毒载体的设计类似，对慢病毒载体的改造也是基于将其病毒基因组分成三个载体分别表达包膜蛋白，病毒包装蛋白和外源表达载体。

当使用慢病毒载体用于临床基因治疗时，有些系统甚至使用4或者5质粒系统以降低产生复制性病毒(RCR, replicative-competent retrovirus)的可能性从而增加体内使用的安全性。

与“简单型”逆转录病毒不同的是，慢病毒由于存在辅助蛋白和调控蛋白，其载体改造涉及更多的对这些反式作用因子的去除以及相应的顺式作用元件的改造。

第一代慢病毒载体使用三质粒系统，将包膜蛋白单独置于一个质粒中表达，包装载体含有除包膜蛋白编码基因的全病毒基因组，使用CMV启动基因表达，并用人胰岛素基因的polyA替代3’LTR作为加尾信号，同时将外源插入片段以及所有相关顺式作用元件(包装信号y，LTRs，RRE和引发结合位点(PBS, primer binding site))置于外源表达载体中。

第二代慢病毒载体去除了辅助蛋白编码基因Vif，Vpr，Vpu和Nef，以减少产生RCR的风险。

第三代慢病毒载体则去除了对Tat和Rev蛋白因子的依赖作用。

通过将5’LTR中的U3区替换成CMV，可以消除对Tat的依赖；通过对gag-pol编码基因的密码子进行优化，可以解除对Rev的依赖。

许多顺式作用元件(DNA序列)对病毒的包装效率影响也很大，比如cPPT和来源于Igk的MAR (matrix attachment region)，以及WPRE(土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件)，其可以有效帮助mRNA的polyA加尾效率。

同时通过失活3’LTR区的U3区，可以减少病毒载体整合后对宿主整合位点附近基因的表达干扰，而且还可以有助于引入诱导表达或者组织特异性表达系统。

包膜蛋白表达载体：慢病毒载体改造中一个重大突破是将慢病毒自身的包膜蛋白替换成其它病毒的包膜蛋白，尤其是VSV-G。

VSV-G包膜蛋白赋予慢病毒载体三个非常重要的特性：1)，稳定慢病毒载体颗粒，使得其可以承受超离心的剪切力，因此可以进行浓缩，从而可以获得超高滴度(1011IU/ml)以用于体内实验(动物实验和基因治疗)；2)，其受体为细胞膜上的磷脂酰丝氨酸分子，因此极大拓展慢病毒载体的侵染谱系；3)，介导慢病毒载体进入胞吞途径，从而使得整个侵染整合过程减少了对慢病毒自身辅助蛋白的依赖。

当然，VSV-G蛋白也有一些缺点：1)，用于动物体内实验时，有报道出现针对VSV-G蛋白的补体和抗体介导的免疫反应从而阻碍慢病毒载体的功能发挥；2)，体内少数组织，比如气管上皮细胞的顶端面缺乏VSV-G受体，因此携有VSV-G的慢病毒载体在体内对其侵染性极低。

通过使用埃博拉病毒的包膜蛋白可以解决这个问题，从而使得囊性纤维化疾病的基因治疗(其主要靶底是气管组织)成为可能。

因此，显然为了进一步拓展慢病毒载体的侵染范围，需要开发和优化更多的包膜蛋白。

包装因子表达载体：去除辅助蛋白因子包装因子表达载体表达除包膜蛋白外的所有包装和侵染必须的反式作用因子。

为避免将此类序列包装入假病毒颗粒(慢病毒载体)，因此包装因子表达载体上缺乏顺式包装信号y和LTR序列，然而仍然保留Rev响应元件(RRE，Rev response element)序列和剪切供体位点。

使用其它启动子，比如CMV或者RSV启动子，以及胰岛素基因的polyA加尾信号序列替代LTR的对应序列，可以使得转录产物更加稳定，表达效率更高。

和“简单型”逆转录病毒载体不同的是，除Gag，Pol和Env之外，慢病毒还表达有其它6个蛋白因子，包括Vpu、Vpr、Vif、Nef辅助蛋白和Tat、Rev调节蛋白。

这些蛋白是HIV-1在体内实现高速复制所必须的因子，同时还决定了HIV的病原性。

某些感染HIV的病人其存活期非常长，是因为其感染的HIV属于缺乏这一类辅助蛋白的病毒株。

而且，HIV的体外复制可以不需要Vpu、Vpr、Vif、Nef辅助蛋白的参与。

因此，研究人员通过去除这些辅助蛋白，可以达到即提高安全性又不影响病毒体外辅助的目的。

第一代慢病毒载体仍然含有这些辅助蛋白编码基因。

第二代慢病毒载体去除了所有4个辅助蛋白编码基因，但仍然保留有Tat和Rev基因。

第三代慢病毒载体去除了Tag基因，并将Gag-Pol和Rev分在两个质粒载体中表达。

这些改造，极大降低了重组产生复制性病毒(RCR,Replication-competent retroviruse)的概率。

而且即使产生了复制性病毒，也不含有病原性的辅助蛋白因子，因此其致病性概率极大降低。

同时，这些改造并不影响慢病毒载体的包装滴度，也没有干扰其侵染特性。

极少数情况下，在使用非慢病毒自身包膜蛋白的情况下，去除辅助蛋白会降低其侵染效率，比如在缺乏辅助蛋白的情况下使用非VSV-G包膜蛋白会使得其侵染非活化人淋巴细胞的能力大大降低，通过使用VSV-G包膜蛋白可以解决这类问题。

改造Gag-Pol密码子偏好性HIV基因组中含有大量的AU序列，使得其密码子使用有高度偏向性，且转录产物极不稳定，从而降低Gag-Pol 的翻译效率，并使得其表达高度依赖Rev蛋白。

同时对其gag-pol编码基因的密码子进行人源化改造，可以使得其在哺乳动物细胞中的表达效率大大增加，而且使得其表达可以不依赖于Rev蛋白，因此可以去除RRE序列。

因为人源化后的gag-pol基因序列以及不含有RRE序列，这进一步极大地降低了慢病毒载体重组产生RCR的可能性。

同时还使得在慢病毒载体中表达抑制HIV自身基因(gag-pol)的shRNA成为可能，从而开启了将某一类病毒载体用于针对同一病毒的基因治疗的新途径。

分步表达Gag和Pol蛋白因子通过分别表达Gag和Vpr-Pol，可以几乎完全阻止重组产生RCR。

Vpr结合于Gag-Protease的前体p6并介导Vpr-Pol融合蛋白高效包装入慢病毒载体颗粒。

因此理论上，通过将慢病毒基因组进行改造，将其包装，侵染必须蛋白分别置于5个质粒载体上表达：外源插入片段表达载体，包膜蛋白(Envelope)，Gag-Protease，Vpr-Pol和Rev。

同时，在对Gag-Protease和Vpr-Pol的密码子偏好性进行改造后，还可以去除Rev蛋白，使得这一类慢病毒载体在兼具最大的安全性的同时还能保持很高的滴度和广泛的侵染率。

外源表达载体：最早使用的外源表达载体含有慢病毒载体所有的顺式作用元件(包装信号、反转录和整合元件)，外源插入片段以及相关调控元件(启动子和插入片段)。

具体来说，载体N端含有复制引发结合位点，剪切供体位点，包装信号，RRE序列和剪切受体位点；异源启动子和插入片段在中间；C端含有PolyA加尾信号和3’端LTR。

为了增加安全性，降低重组产生RCR的可能性以及增加表达效率和丰富调控表达方式，研究人员对外源表达载体进行了一系列改造：1)，构建SIN载体：由于逆转录病毒的3’端LTR的U3区在反转录和病毒DNA复制时时会被当作模板最终生成5’端LTR所对应的U3区，因此如果要去除病毒自身的转录起始元件使得外源片段发生不依赖于Tat蛋白的转录，必须将5’端LTR的U3区替换成异源启动子，同时去除3’端LTR的U3区的133-400 bp含TATA盒子和Sp1，NF-kB等转录结合位点以及其它增强子的对应序列。

改造后的不含这段序列的U3区会被复制转移形成转录产物中的5’端LTR的新U3区，所以转录产物中不再含有病毒自身转录起始元件，因此也就不再依赖于Tat 蛋白因子转录，使得可以在其它质粒载体中去除Tat编码基因。

同时，在整合入宿主细胞基因组后，还可以减少对整合位点附近基因的转录干扰，比如避免激活下游基因(在早期逆转录病毒载体中常见，并且是运用逆转录病毒载体进行基因治疗时诱发肿瘤发生的主要因素)。

2)，土拨鼠肝炎病毒转录后调控序列(WPRE, woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)和cPPT(central polypurine tract)序列可以极大增加外源片段表达效率，其机制仍不明了。

3)，将HIV-1基因组中的cPPT和cTS(central termination sequence)序列置于病毒载体异源启动子的5端可以极大增加对许多细胞的侵染效率，比如神经元细胞、造血干细胞、肝细胞和原代T细胞。

这些序列最初认为其对HIV-1的基因组复制非常重要，但重组慢病毒载体的DNA复制并不依赖于这些序列，现在认为这些序列可以帮助前整合复合物入核，增加侵染效率。

4)，引入诱导表达调控元件，比如四环素诱导系统(Tetracycline-inducible on /off system, TetOn/Off)。

其两个主要成分：a)，四环素调控转录激活因子(tTA)，是四环素抑制因子和HSV的蛋白因子VP16的转录激活区的一个融合蛋白；b)，诱导启动子，含启动子和7个拷贝的Tet操纵子部分。

缺少四环素时，tTA结合并激活诱导启动子。

tTA结合四环素或者其类似物强力霉素(Doxycline)后，发生构象变化，使得其不再能结合到Tet操纵子上因此不再能启动基因表达。

在第一代诱导表达慢病毒载体中，tTA 和诱导启动子位于同一个质粒载体中，CMV启动子控制tTA 的表达，3’端的诱导启动子调控外源片段的表达。

第一代诱导调控慢病毒载体有几个问题：a)，其包装滴度比传统慢病毒载体低5-10倍，但通过浓缩仍然可以达到109IU/ml；b)，去除Tet或者Dox之后，虽然其表达强度最高可以增加500倍之多，但也存在一定程度上的本底表达(存在Tet或Dox 时，仍然可以检测到一定的外源片段的表达)。

通过将tTA的表达和诱导启动子的表达部分分在两个质粒载体上表达，可以降低本底表达水平，而且在诱导之后其表达效率会更高。

第二代诱导调控慢病毒载体将诱导调控启动子置于U3区，虽然大大降低了本底表达，但其诱导表达变化幅度也随之下降。