细胞工程实验室组成及无菌操作技术共102页
细胞工程第二章
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(3)干热灭菌
主要用于玻璃器皿的灭菌。将用 于细胞培养的器皿放入干燥箱内， 加热至160º C，保温90-120 min。
（4）过滤除菌：
会被高热破坏之溶液，例如细胞培养基或培 养基添加物(例如氨基酸、蛋白质溶液等)，可用 过滤膜除菌。 使溶液通过0.1 um 或0.2 um孔径之 无菌过滤膜，以达无菌之目的。 滤器型号按直径大小划分。如过滤量大的培 养用液常用较大型号的金属滤器(直径90 mm、100 mm、142 mm……等)，配以过滤泵使用。过滤量较 小的液体常用注射器推动的塑料小滤器(直径20 mm、25 mm等)。滤膜孔径有0.60um、0.45um、 0.35um、0.22um、0.10um等，以0.22um除菌最为 保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔 径较大的滤膜。
2.化学消毒法
• 利用化学药剂杀灭微生物的方法称为化学
消毒法。化学消毒法操作简单、方便有效。
常用的消毒液有如下几种：
• • •
(1)70 ％ ( 或 75 ％ ) 酒精：超净台里常备 70 ％酒精 棉球 ( 卫生级酒精 ) ，用于手和一些金属器械或工 作台面的消毒。 (2)0.1％新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以 及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常备盛有 0.1％新洁尔灭溶液的容器及纱布。 (3) 来苏儿水 ( 煤酚皂溶液 ) ：主要用于无菌室桌 椅、墙壁、地面的消毒和清洗．以及空气喷撒消 毒，特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度按说 明。
• (4)0.5%过氧乙酸：是强效消毒剂，10 min即可将 • •
芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒，用喷撒 和擦拭方式进行。 (5)乳酸蒸气：将乳酸放人坩锅内用酒精灯或电炉 加热至沸腾为止。将门窗紧闭1-2d。可将空气中 漂浮的微生物杀死。 (6)37％甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将 37％甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭 火，用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放入已 加热好的甲醛中形成蒸气，1-3d后方可达到消毒 空气的目的。
《细胞工程》实验指导书
实验指导书课程：细胞工程授课专业：生物工程、生物技术主编：徐艳实验一实验室的概况与培养基母液的配制一、实验目的：熟悉植物细胞工程实验室的基本结构、必须的基本设备及其用途与作用方法，掌握配制培养基母液的基本技能。
二、材料与用具：1、药品：生长调节类物质、无机盐类、有机化合物等。
2、用具：分析天平、移液管、量筒、培养瓶、烧杯、冰箱、母液瓶等。
三、教学时数：4课时。
四、实验内容：（一）实验室的基本结构及主要设备：1、洗涤室：水槽、工作台、蒸馏水器等功能：器皿及材料洗涤；蒸馏水制备。
2、消毒室：高压蒸汽灭菌锅、烘箱等功能：器皿的干燥；器皿及培养基的消毒。
3、试剂室：试剂柜、冰箱功能：存放试剂及器皿。
4、准备室：工作台、天平、水浴锅、电炉、显微镜及各种玻璃仪器、金属仪器等功能：培养基药品称量、配制、分装、灭菌；材料预处理；培养材料的观察分析。
5、接种室（含缓冲室）：超净工作台、接种箱等功能：无菌操作。
6、培养室：培养架、摇床等功能：培养物的控制培养。
7、驯化移栽室：如温室、大棚等功能：试管苗的驯化移栽。
（二）培养基母液的配制：1、MS基本培养基母液：各成分单独称量、单独溶解后混合定容①大量元素母液：10倍，1L注意：CaCl2.2H2O易与其他成分反应产生沉淀；②微量元素母液：100倍，0.5L③铁盐母液：100倍，0.5L注意：两者等体积溶解后混合，且需80℃水浴1h充分螯合，等待冷却后定容；④有机母液：100倍，0.5L2、激素类母液的配制：①1mg/ml的6－BA 50ml：先用0.1mol∕L的 HCL或NaOH溶解后再加水定容；②0.1mg/ml的NAA 50ml：先用少量0.1mol∕L的NaOH溶解后再加水定容。
注：精度要求精确到小数点后三位。
（三）培养器皿的洗涤：1、对污染的培养器皿先进行消毒灭菌处理；2、清除残渣，用清水洗净，浸泡于合成洗涤剂中6-24小时；3、用洗涤刷洗涤，并用自来水冲洗干净；4、用烘箱烘干或晾干，存放于防尘橱内备用。
细胞工程细胞工程实验室组成及无菌操作技术精选文档
倒置显微镜
分注器
血球计数器
磁力搅拌器
移液器
8、其它辅助设备
①培养基灌装机及洗瓶机
②空调机：用于接种 室和培养室温度的控 制。
③ 除湿机：使培 养室的湿度保持在
定的范围内。
⑤冰箱：用于在常温下易变 性或失效的试剂和母液的储 藏，细胞组织和试验材料的 冷冻保藏，以及某些材料的 预处理。
锅内温度达121℃。在此蒸气温度下，可以很快 杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
(2)使用方法：首先检查灭菌锅内是否有水，而且水
刚好淹住加热器，然后放入灭菌材料，对称拧紧灭菌锅 上的螺丝，关闭放气阀通电。待压力上升到0.05MPa时， 打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭 放气阀。三次放气后，关阀再通电，压力表上升达0.10.15Mpa时，维持20min后，断电，待压力降至零时，打 开入气阀，取出灭菌材料。
④烘箱：用于干燥洗净后的玻 璃器皿，还可用80℃的温度烘 干组织培养植物材料以测定干 物质。
⑥ 纯 水 机 与 蒸 馏 水 发 生 器
⑦天平：天平包括分析天平，电 子天平，药物天平等，用于制备 母液时培养基组成成分的称取。 如一些需要量少的激素和微生素 类物质，天平的精确度要到 0.0001g，这就要求精确度更高的 分析天平。
（4）培养室：
培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需 要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和 节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性 能。
培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设4-5层， 最低一层离地高约l0cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左右。 培养架长度都是根据日光灯的长度而设计， 如采用40W日光灯，则长1.3m， 30W的长lm，宽度一般为60cm。
细胞工程实验室涉及的基本操作技术
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1. 培养基准备。
细胞工程实验室组成及无菌操作技术
玻璃漏斗式滤器
微孔滤膜滤器
干热灭菌箱/烘箱
电热灭菌器
2.培养仪器设备
培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。
3.细胞学观察设备
应备有普通显微镜和倒置显微镜。
4. 化学实验常规设备
主要用于试剂保存与称量、培养基配制与 分装和水处理等，根据实际需要予以配置。
冰箱、天平、酸度计、离心机、加热器、 纯水器、分装设备等。
操作的场所。 要求：封闭性好，干燥清洁明亮，防止空气
对流。外应设缓冲室、更衣室 。
基本的设备：超净工作台（接种箱）、电热灭菌器、喷雾
消毒器、紫外灯、酒精灯等。
③培养室 功能：是对接种到培养瓶的离体材料进行控制培养的 场所。 要求：是要能控制光照和温度，应保持干燥和清洁， 防止微生物感染。
培养室基本设备：培养架、摇床、光照培养箱、通 风设施、时间过程控制器、空调机、加湿器、除湿 机及温度感应器等。
▪ 灭菌(sterilization)：是指用物理或化学的方法， 杀灭或清除传播媒介上的所有微生物，使之达到无 菌程度。
▪ 消毒（disinfection）：是指杀死、消除或充分抑 制部分微生物，使之不再发生危害作用。经过消毒， 许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死， 即消毒后的环境里、物品上还有活着的微生物。
4、滤 器
▪ 玻璃滤器：与玻璃器皿清洗相同。无论是水 浸泡还是酸浸泡，都可用抽滤法。
▪ 不锈钢滤器：使用后弃去石棉滤膜，金属部 分刷洗干净，最后用蒸馏水漂洗2～3次，晾 干备用。
▪ 微孔滤膜滤器：使用后弃去微孔滤膜，滤器 用清水充分冲洗，最后用蒸馏水漂洗，晾干 备用。
二、灭菌和消毒方法
灭菌和消毒是组织培养重要的工作之一 。
第二节、无菌操作技术
细胞工程实验室配置及基本技术
用蔗糖调节外，常用的还有甘露醇，山梨
醇等。
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§3.培养条件
六.气体影响
CO2、 O2
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§3. 培养条件
六.气体影响
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§4.离体培养的营养需求
一.无机盐类 二.有机化合物 三.植物激素 四.其它附加成分
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§4.离体培养的营养需求
一.无机盐类
消毒器、紫外灯。
无菌操作设备 净化工作台、接种箱。 光温控制设备 时间程序控制器、空调及温度感应器。 细胞培养设备 培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、
摇床、 生物反应器等。
细胞学鉴定设备 光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜。
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§2.实验室设置
二.基本设备配置
灭菌设备
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§3.培养条件
四.pH值
通常使用的pH值范围是5.0～6.5。pH在 4.0以下或7.0以上培养物就不能正常生长。
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§3.培养条件
五.渗透压
事实上为了某些培养需要，在设计培养基
时就应该考虑渗透压的问题，如White培
养基的渗透压为0.15个大气压，MS培养基
为1.9个大气压。此外，培养基的渗透压除
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§2.基本技术
一.洗涤技术
洗涤方法 玻璃器皿洗涤 新的玻璃器皿 已使用过的试管、烧杯、三角瓶 吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品 塑料用品洗涤 一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较 强，因此冲洗时必须反复多次，最后用 蒸馏水冲洗。 金属用品洗涤 金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤， 需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火 焰干燥。 第12页/共32页
第三章细胞工程基本技术
２、电离辐射消毒 适用于消毒量大和不适于做高压或滤过的
用品。
３、湿热灭菌 湿热灭菌即高压蒸气灭菌，是最常用和
最有效的一种方法。布类、胶塞、金属器械、 玻璃器皿及某些培养用液都可用此法消毒灭 菌。 各种物品有效消毒灭菌压力和时间不同， 一般培养用液、橡胶制品要求10磅(114℃)， 10～20分钟或8磅(112℃)30分钟。布类、玻 璃制品、金属器械等为15磅(12l℃)20分钟。
玻璃滤器适用于各种培养液的滤过除菌。玻璃滤 器根据滤板的孔径分为G1一G6几种规格，一般采用 G6型(孔径在1.5μm以下)，可达到除菌目的。
3、塑料器皿的清洗
细胞培养使用的塑料器皿主要有培养板、培 养皿及培养瓶等。这些产品主要是进口的一次 性商品，己消毒灭菌，打开就可使用。
如想反复使用，清洗方法如下：用后立即用 流水清洗或浸泡在水中，用脱脂棉清拭掉残留 附着物，用2％NaOH浸泡过夜，流水冲净后再 用5％盐酸浸泡30min，自来水冲洗、蒸馏水漂 洗2~3次，最后三蒸水漂洗2次，晾干备用。
② 刷洗
浸泡后的玻璃器皿要用软毛刷和优质洗涤剂（加 热）刷洗。
③ 浸酸
刷洗不掉的极微量杂质经过清洗液浸泡的 强氧化作用可被除掉。清洗液对玻璃器皿无 腐蚀作用，去污十分有效，是清洗过程中关 键环节。清洗液是由重铬酸钾、浓硫酸和水 按一定比例配制而成。浸泡时器皿要充满洗 液，不留气泡。浸泡时间不应少于6小时，一 般应浸泡过夜。
新配制的清洁液为棕红色，经多次使用，水份增多 或遇有机溶剂时成为绿色，这时表示清洁液已失效， 应废弃而重新配置。
也可以使用10％～40％的硝酸溶液。
第二章 细胞工程基本理论及其基本操作技术课件高中生物竞赛
微生物以及它们的芽孢或袍子，使物体成为无菌状态 消毒：是非彻底杀菌，即用物理或化学等方法，杀死物体上的有
害物质，但不能杀死全部芽孢 防腐：是抑菌过程，即用化学或物理方法，防止或抑制微生物生
长繁殖
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实验室常用于细胞工程的 三种消毒灭菌方法：物理法、化学法、抗生素法 1）物理法：
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要求 1、掌握 组织培养的概念及相关 2、掌握植物组织培养技术中 营养条件有哪些 3、掌握培养基中必不可少 的六大类无机盐元素 4、了解各无机盐元素的生理功能
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有机化合物
糖 类：
1）作用：既可作为C源，又可维持细胞的渗透压；
胁迫作用
2）原因：通常植物本身能进行光合作用，不需要从
外部供给糖，但植物组织培养进行异养的情况下，大
可根据需要配制成 弱、中、强三种。 弱 用重铬酸钾50g加入蒸馏水1L，加热溶化，冷却后再缓慢加
入浓硫酸90ml。 中 用重铬酸钾50g加入蒸馏水100ml，加热溶化，冷却后再缓
慢加入浓硫酸875ml。 强 与浓硫酸加热的同时缓慢加入磨碎的重铬酸钾，直到重铬
酸钾达到饱和为止。一般浓硫酸1L加入重铬酸钾50g
在胡萝卜胚状体的分化中，仅含硝酸盐是不能分化，只有 铵盐同时存在时才会产生胚状体的分化。
植物组织从培养基中吸收NO3-和NH4+后，经过一系列的反应转 化成氨基酸，进而合成蛋白质，成为植物体的主要组成部分
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无机盐类
磷：常用的是磷酸盐，是植物必需元素之一。 磷参与植物生命过程中的核酸合成、蛋白质合
是一种全新的植物组织培养技术, 是环境控制技术和组培技术的有机结合。
其特点在于: 1）以CO2 代替糖作为植物体的碳源,利用工程技术手段调节组培 微环境的空气、光照、湿度等影响因子,促进植物体自养生长 。 2）提高苗的质量和产苗率,缩短培养周期。