无菌实验室操作规程

无菌实验室操作规程

一日常管理

1 准备工作

实验前，准备齐当天所用物品（包括废液缸），并置2%新洁尔灭溶液（3000ml）及空盆于无菌间，开操作台和无菌室紫外灯30min。放臭氧15分钟后，再进无菌间操作。

2 无菌间操作

进无菌间后换拖鞋、穿工作服、戴口罩、帽子、手套，然后用新洁尔灭洗手；

将所用的试剂用新洁尔灭或75％酒精擦拭后放入操作台，撕封口膜，用酒精棉球擦拭瓶口，再在酒精灯火焰上烤，之后用止血钳夹住瓶塞取下；

在操作台内，瓶口尽量不应直立向上，在盖塞前烤塞子与瓶口（除酒精棉球瓶外），再盖严加封口膜取出；

做完实验，清理操作台，用新洁尔灭擦拭台面及操作台上的物品。

3 无菌间清扫

无菌室每周要彻底打扫一次，用新洁尔灭擦墙、门、仪器及桌面等；75%酒精擦窗、玻璃等；过氧乙酸擦操作台、出问题或准备要用的培养箱。

4 无菌服

冬天时一周一洗；夏天时一天一洗。按实验室值日生顺序轮流洗涤，并由上一人及时通知下一人。洗涤晾干，高压灭菌后放入无菌间紫外杀菌。

5 臭氧发生器

每晚最后离开实验室的，关电器、门窗等，并打开臭氧发生器定时一小时。

二实验室物品处理

1新塞子的处理

新胶塞对细胞有一定的毒害作用，其处理方法为：

新胶塞→洗衣粉洗→洗涤灵洗→晾干→20g/1000ml的NaOH煮30min→水冲洗→去离子水浸泡过夜→双蒸水冲洗→晾干→备用

有水沸腾时算起，煮30min。

2 接触细胞的用品的处理

用品→过氧乙酸浸泡过夜[20ml/10000ml过氧乙酸]→取出→洗涤灵擦洗→水冲→晾干→泡酸[洗液]→自来水浸泡过夜→去离子水冲洗→双蒸水冲洗→晾干→备用

3 未接触细胞的用品的处理

用品→自来水冲洗[可适当用洗衣粉或洗涤灵洗]→去离子水冲洗2~3次→双蒸水冲洗2~3次→晾干→包口→备用

滤器、瓶→自来水冲洗30min→去离子水冲洗→双蒸水冲洗→晾干→备用

三细胞污染时培养瓶及培养箱的处理

1 细胞污染

细菌污染时培养基多出现浑浊，在镜下观察时多出现黑色跳动小点。

真菌多为霉菌污染时，初期为镜下可见圆形漂浮或贴辅的空心圆泡，后期可见明显霉斑，镜下可见菌丝为树枝状。

2 处理

细菌多用新洁尔灭（20ml/1000ml水）可适当加大浓度，浸泡24h以上。

真菌多用过氧乙酸（20ml/10000ml水）可适当加大浓度，浸泡24h以上。

3 培养箱处理

培养箱应拆下内部组件，彻底清洗，用过氧乙酸擦拭后再用新洁尔灭擦拭，然后用酒精擦拭，紫外照射30min，最后用75%的酒精（40℃，CO2为零）培养箱内部熏蒸3~4h;污染严重时要将其放入烘箱内100~200℃烘3~4h安装后再照紫外。

注：

Ⅰ每次操作时要将培养箱彻底擦拭；

Ⅱ每月对培养箱做一次AUTOSUART（具体操作见说明书）

4 培养间处理

要彻底打扫，擦拭，先用0.5%过氧乙酸擦一遍，大约10分钟后，用0.5%新洁尔灭再擦一遍，最后用过氧乙酸熏蒸消毒。方法为：向熏蒸槽内加入适量酒精，放上石棉网，取一个烧杯，加入100ml过氧乙酸和等量的蒸馏水，把烧杯放在石棉网，一起端进无菌室，并打开室内所有厨子和抽屉，点燃酒精开始熏蒸，中途可以检查酒精燃烧情况，如燃完可以视过氧乙酸剩余多少，再加入适量酒精，切忌烧干过氧乙酸。

注意事项

1 进出无菌间，无论什么事，都必须带一次性手套开门；

2 血清、双抗等不能照紫外的试剂，只接带进无菌间后用酒精棉球擦拭三遍；

3 无菌间内装消毒液的桶、盆必须专用；

4 所用抹布，在做完实验后要洗涤、高压灭菌，烘干后照紫外，从传递柜带进无菌间,所有能灭菌的均以此方式处理；

5 -70℃冰箱及液氮室钥匙由专人负责，除特殊情况，任何人不得随意拿用；平时也要先跟负责人请示；

6 实验操作分组时，各组使用各组的仪器设备，能分开用的要彻底分开；

7 为提高实验操作人员的关注程度，试验的每个步骤都要有相关纪录；

8 无论实验室有无污染，均要定期熏蒸，夏天一天一次，每次不必太长时间；

9 实验中遇到问题先查书、再找专家，切记勿盲目轻信；

10 私人衣物可以在实验室洗，但除无菌服外，禁止在实验室晾；

11 实验室内的试剂、相关工具等均有相应摆放位置及电子图示，勿乱放、并做好定期更新；

12 实验室内禁止带入任何食品；

13 在包滤器、滤瓶时，要包口，外面再包一层牛皮纸之后外面再包一层布，在高压灭菌后则不会进入水蒸气；

14 在配制试剂时所用的水为去离子、三重蒸馏水，现用现烧。