12基因诊断与基因治疗

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常与基因突变的DNA单链
将在凝胶上显现出不同的带型，从而确定野生型和突变型。
优点：简单，较高的敏感性，可同时分析多个样本。
（三）基因测序
是最直接、最准确的基因诊断技术
病例SOX9基因HMG box内发生单碱基置换突变R178L(G→T)，左侧正常
对照第225位碱基为C，而该患儿为A（反义链中）。
GAG——GTG Glu——Val

已知限制酶Mst 1识别序列 （CCTNAGG）

CCTGAGG

CCTGTGG 突变后不能识别 酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。

Southern blot
（二）PCR技术
巢式PCR 多重PCR RT-PCR 实时PCR 联合PCR
mRNA特异性的互补结合即抑制了该mRNA的翻译，
是原核生物基因表达调控的一种方式，在真核生物中 也存在反义RNA。
特点 （l）安全性高，专一性强，效率高。反义RNA只作用 于特异的mRNA 分子，不改变所调节基因的结构。反 义RNA分子无论怎样修饰，最终将在细胞内部被降解， 不留“残渣” （2）设计和制备方便 （3）具有剂量调节效应 （ 4 ）在治疗 RNA 病毒感染性疾病时有更大的优势。 能直接作用于一些RNA病毒，阻断RNA病毒的繁殖
靶细胞 载体 目的基因
in vivo
（五）治疗基因表达的检测
无论以何种方法导入基因，都需要检
测这些基因是否能被正确表达。被导入基
因的表达状态可以用 PCR 、 RNA 印迹、
蛋白印迹及ELISA等方法去检测。对于导
入基因是否整合到基因组以及整合的部位，
可以用DNA印迹技术进行分析。
（六）回输体内
突变类型
缺失为主 点突变为主 点突变为主 点突变、缺失等 点突变 点突变、缺失
诊断方法
Gap-PCR、DNA杂交、 DHPLC 反向点杂交、DHPLC PCR-RFLP PCR-STR连锁分析 PCR-STR连锁分析、ASO分子 杂交 PCR-VNTR连锁分析、 DHPLC
基因检测的现状

目前可以用基因检测进行检测的疾病数1767种，其中1492 种检测应用于临床，275种仅用于研究。


四、基因治疗的应用与展望
应用
遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、 感染性疾病、神经系统疾病
展望
进一步寻找切实有效的基因 精密调控外源基因在人体内的表达 体细胞移植和重建的生物学研究 减少外源基因对机体的不利影响
基因治疗展望
展望21世纪, 各种遗传病, 肿瘤外, 传染病，

神经系统, 心血管系统和各种常见疾病均可以获 得治疗. 基因治疗象吃药和打针一样方便; 按照人和疾 病治疗的需要定量表达或关闭基因. 基因治疗可以让人类告别传染病, 肿瘤, 使人 长得更高,寿命更长,使人更聪明，更漂亮，使人
导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。
（五）基因免疫治疗(基因疫苗) 定义
通过将抗癌免疫增强细胞因子（TNF,干扰素，IL-2) 或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗 癌免疫反应。
三、基因治疗的基本程序
治疗性基因的选择 基因载体的选择 靶细胞的选择 基因转移
病毒载体 非病毒载体
体细胞 生殖细胞 间接体内疗法 直接体内疗法
（二）基因载体的选择
基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效
转移入患者体内、并能调控其适度表达。
病毒载体：逆转录病毒(RV)、腺病毒(AV)、腺
相关的病毒(AAV)等。
非病毒载体：这类载体的发展较快，目前主要
是脂质体。
（三）靶细胞的选择
---- 分为生殖细胞和体细胞两大类,现阶段只限于应用体细 胞 靶细胞选择的原则:

美国早在1996年就开始了基因检测，2004年接受检测的人 次数递增至400万，占人口比例1.57﹪，至2007年已有700 多万人次。 国内目前已经开展的基因检测项目包括：


遗传病基因检测数十种，如遗传病的染色体检测，地中海 贫血基因检测，G-6PD基因检测等；

易感基因型检测400多种，如白细胞抗原（HLA）分型检 测、多种癌症、糖尿病、冠心病、心肌梗死、动脉粥样硬 化、高血压病、老年性痴呆等；
PCR-单链构象多态性 single strand conformation
polymorphism( SSCP)分析
PCR-SSCP是在PCR技术基础上发展起来的一种简单、 原理：PCR产物经变性后可以产生2条互补的单链，不同 快速、经济的显示PCR反应产物中点突变的手段。
的单链构象不同，如果存在基因突变，哪怕是只要有一个碱基 发生改变，单链的构象也发生变化;
二、基因治疗历史
20世纪60年代 Edward Tatum提出基因水平上纠正缺陷基 因的设想。以病毒为截体，体细胞为靶细胞的技术路线，从根 本上解决遗传病的治疗问题。 1966年 美国国立实验室的Rogers发现，接触兔乳头状病毒 的实验工作人员中相当部分的血精氨酸降低。推测病毒核酸进 入细胞使精氨酸酶活性升高。 1973年 Rogers用shope兔乳头状瘤病毒感染一个患有精氨 酸血症女孩的皮肤成纤维细胞，使细胞精氨酸酶活性上升，且 可持续7个月。 1990年11月，美国NIH的Blease,Culver和Anderson进行 了首例人体基因治疗临床试验。患ADA缺失症的4岁小女孩， 利用反转录病毒将ADA基因转移到T淋巴细胞中，再回输。患 者免疫力明显提高，取得了巨大成功。
可降解相应的 mRNA或抑制其翻译，阻断致病
基因的异常表达，从而达到治疗疾病的目的。
这一策略称为基因失活（gene inactivation）或
基因沉默（gene silencing）。
反义RNA
定义：与mRNA或其它RNA互补的RNA分子。
由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与
疾病易感基因检测适合于…...

家族中有某种疾病的遗传病史者。 某类疾病的高风险人群，如近亲或个人罹患 慢性疾病，或者常处于污染环境者。

有正确健康意识者。
第 二 节 基 因 治 疗
Gene Therapy
一、基因治疗的概念
定义
早期是指用正常的基因整合入细胞基因组， 以校正和置换致病基因的一种治疗方法。 目前广义上来讲是指将某种遗传物质转 移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以 达到治疗疾病的目的。
看得更远，听得更清楚, 生活更加美好.
三、基因诊断的应用
遗传疾病
肿瘤
感染性疾病，传染性流行病
判断个体疾病易感性 器官移植组织配型 法医学中个体识别、亲子鉴定
我国部分代表性常见单基因遗传病基因诊断
疾病
α地中海贫血 β地中海贫血 甲型血友病 乙型血友病 苯丙酮尿症 马凡综合症
致病基因
α珠蛋白 β珠蛋白 凝血因子Ⅷ 凝血因子Ⅸ 苯丙氨酸羟化酶 原纤蛋白
一、基因诊断的主要对象和样品来源
对象：
主要是DNA分子，涉及到功能分析时，还可 定量检测RNA（主要是mRNA）和蛋白质等 分子。
样品来源：
临床上可用于基因诊断的样品有血液、组织 块、羊水和绒毛、精液、毛发、唾液和尿液 等。
二、基因诊断技术
定性分析 分类 定量分析
基因分型 检测基因突变
测定基因拷贝数 测定基因表达产物量
方式：静脉注射、肌注、皮下注射、滴鼻等
基因修饰的淋巴细胞以静脉注射的方式回输到血液中；
将皮肤成纤维细胞以细胞胶原悬液注射至患者皮下组 织； 采用自体骨髓移植的方法输入造血细胞； 或以导管技术将血管内皮细胞定位输入血管等。
腺苷脱氨酶(ADA, Adenosine Deaminase) )缺乏的 严重联合免疫缺陷(SCID, severe combined immunodeficiency syndrome)
基因诊断 与基因治疗
Gene Diagnosis and Gene Therapy
主讲：李志红
第 一 节 基 因 诊 断
Gene Diagnosis
基因诊断
基因 蛋白质
性状
基因 诊断
生化 诊断
临床 诊断
基因诊断的概念和特点
定义
利用现代分子生物学技术，直接检测基因 结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出 诊断的方法。 特点 1．以基因做检查材料和检查目标，针对性强 2．分子杂交选用特定基因序列作探针，故特异性强 3．分子杂交和PCR具有放大效应，故灵敏度高 4．适用性强，诊断范围广
靶细胞来实现基因的转移。
膜融合法——细胞融合法、脂质体介导法、原生质体
融合法、微细胞核介导法等
将治疗基因导入人体

间接体内疗法

目的基因转移到体外培养的靶细胞内高效表达， 然后将靶细胞回输体内

直接体内疗法

将目的基因在体内直接转移到靶细胞 载体：需要有特异导向性和高转移效率
ex vivo
外源基因表达的筛选 利用在体中的标记基因
回输体内
（一）选择治疗基因
许多分泌性蛋白质如生长因子、多肽类
激素、细胞因子、可溶性受体（人工构建的 去除膜结合特征的受体），以及非分泌性蛋 白质如受体、酶、转录因子的正常基因都可 作为治疗基因。
简言之，只要清楚引起某种疾病的突变
基因是什么，就可用其对应的正常基因或经 改造的基因作为治疗基因。
（二）基因增补
不删除突变的致病基因，而在基因组的某
一位点额外插入正常基因，在体内表达出功能
正常的蛋白质，达到治疗疾病的目的。
这种对基因进行异位替代的方法称为基因 添加（gene augmentation）或称基因增补，是 目前临床上使用的主要基因治疗策略。
（三）基因沉默或失活