甘草愈伤组织多糖合成调控

甘草愈伤组织多糖合成调控摘要［目的］研究培养条件对胀果甘草愈伤组织中多糖类化合物合成的影响。

［方法] MS 培养基为基本培养基，改变其蔗糖浓度，氮源类型比例和金属离子（Fe2+、Mn2+、Zn2+）的浓度，在黑暗和光照下进行甘草愈伤组织培养，利用分光光度法检测甘草愈伤组织中多糖类化合物的含量。

［结果］适合甘草愈伤组织生长的最佳条件是（24±1)ºC光照培养，培养基为MS培养基基(附加1.0 mg/L 2，4-D和0.5 mg/L KT)，其中含有30 g/L 蔗糖、NH4+/NO3-比例为20/40、Fe2+浓度为0.05 mmol/L、Mn2+浓度为0.2 mmol/L、Zn2+浓度为0.3 mmol/L。

适合甘草愈伤组织多糖积累的最佳条件是（24±1)ºC光照培养，培养基为MS培养基基(附加1.0 mg/L 2，4-D和0.5 mg/L KT)，其中含有30 g/L蔗糖、NH4+/NO3-比例为20/40、Fe2+浓度为0 mmol/L、Mn2+浓度为0.3 mmol/L、Zn2+浓度为0.1 mmol/L。

［结论］初步建立了甘草愈伤组织和多糖合成均能良好表达的组培体系,为通过植物组织细胞培养途径生产甘草多糖多糖提供了依据。

关键词：甘草愈伤组织；甘草多糖；生长量；多糖含量Regulation of licorice polysaccharides in licorice callusABSTRACT[Objective] To study the effects of the culture components and illumination on the accumulation of polysaccharide compounds . [Method] By adjusting the concentration of carbon, nitrogen and metalion（Fe2+、Mn2+、Zn2+）in the MS culture solution, and kept the licorice callus under dark or illumination, then detected the content of polysaccharide compounds by spectrophotometry. [Result] The optimum condition of licorice callus growth was (24±1) ºC in the light and the basic medium was Murashige and Skoog (MS) (plus 1.0 mg/L 2,4 - D and 0.5 mg/L KT) with 30 g/L sucrose, NH4+/NO3-为20/40、0.05 mmol/L Fe2+、0.2 mmol/L Mn2+、0.3 mmol/L Zn2+.The optimum condition of licorice polysaccharides accumulation was (24±1) ºC in the light and the basic medium was Murashige and Skoog (MS) (plus 1.0 mg/L 2,4 - D and 0.5 mg/L KT) with 30 g/L sucrose, NH4+/NO3-is 20/40、0 mmol/L Fe2+、0.3 mmol/L Mn2+、0.1 mmol/L Zn2+. [Conclusion] The optimal media of licorice callus growth and polysaccharides accumulation express well. Licorice as explant and with a view to an industrial production of polysaccharides by tissue and cell culture.Keywords: Licorice callus；Glycyrrhiza polysaccharide；Growth；polysaccharide目录1 前言 (1)1.1 甘草的简介 (1)1.2 甘草多糖的简介 (1)1.3 愈伤组织的培养 (1)1.4 超声波法提取多糖 (2)1.4.1 超声波提取技术 (2)1.4.2 超声波萃取原理 (2)1.4.3 超声波萃取的特点 (3)1.5 苯酚-浓硫酸法测多糖含量 (3)1.6 实验目的及意义 (3)2 本论 (5)2.1 材料与仪器 (5)2.1.1 材料 (5)2.1.2 仪器与试剂 (5)2.2 实验方法 (5)2.2.1 无菌材料的制备 (5)2.2.2 愈伤组织诱导 (5)2.2.3 愈伤组织的继代培养 (6)2.2.4 配置各种处理的继代培养基 (6)2.2.5 生长曲线测定 (6)2.2.6 甘草多糖的提取 (6)2.2.7 甘草多糖含量的测定 (7)2.2.7.1 多糖标准曲线的制备 (7)2.2.7.2 多糖含量的测定 (7)2.3 结果与分析 (8)2.3.1 葡萄糖标准曲线 (8)2.3.2 蔗糖浓度对甘草愈伤组织生长及多糖合成的影响 (8)2.3.3 氮源类型对甘草愈伤组织生长及多糖合成的影响 (9)2.3.4 Fe2+、Mn2+和Zn2+对甘草愈伤组织生长及多糖合成的影响 (10)2.3.5 光照对甘草愈伤组织生长及多糖的影响 (12)3 结论 (13)参考文献 (14)致谢 (16)1 前言1.1 甘草的简介甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)多年生草本植物，又名甜草根、红甘草、粉甘草、粉草,是传统常用中草药之一。

1977年，《中国药典》(一部)正式将乌拉尔甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch、光果甘草c．glabra L和胀果甘草G．inflata Batal，作为药用甘草植物收载[1]。

此后，我国学者对甘草属药用植物从系统分类、生态资源、化学成分、质量评价以及生产加丁等诸方面进行了大量的研究。

据现有资料报道，国内外已从甘草中分离出100多种黄酮类化合物、60多种三萜类化合物以及香豆素类、18种氨基酸、多种生物碱、雌性激素和多种有机酸等。

甘草药用根,其性甘、平，具有清热解毒,健脾补气，润肺止咳之功效，民间用于治疗乳腺炎、胃及十二指肠溃疡、慢性气管炎、咳嗽、气喘、慢性咽喉炎、食物中毒等症[2-3]。

1.2甘草多糖的简介多糖是一类重要的生物活性物质，广泛存在于动物、植物、微生物等有机体中。

它是自然界中储量丰富的生物聚合物，主要包括植物多糖、动物多糖以及微生物多糖3类，多糖具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗辐射、抗菌抗病毒、保护肝脏等生物活性功能[4-6]。

甘草中含有丰富的甘草多糖，具有免疫调节作用，能抑制变态反应，并具有较强的抗肿瘤作用和抗病毒作用。

经现代科学研究表明，甘草中的主要有效成分有很多[7]，主要为甘草多糖（Glycyrrhiza Polysaccharide，GPS）、甘草酸（Glycyrrhizic Acid）或甘草甜素及甘草次酸和黄酮类化合物（Flavonoids）等[8]。

国内的一些研究表明，甘草多糖是甘草中重要的活性成分之一，具有肾上腺皮质激素样作用、抗炎及抗免疫作用、解毒作用、抗消化道溃疡作用、抗脂肪肝作用、抗肿瘤和抗病毒作用等[9-11]。

1.3 愈伤组织的培养愈伤组织（callus）原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。

它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。

在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。

其发生过程是：外植体中的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织。

从植物器官、组织、细胞离体培养所产生的愈伤组织，在一定条件下可进一步诱导器官再生或胚状体而形成植株。

在单倍体育种中，也可由花粉产生的愈伤组织或胚状体分化成单倍体植株。

甚至可由原生质体培养诱导植株或器官再生。

在药用植物次生代谢产物生产过程中，植物组织培养主要有两方面的用途：一是利用试管快繁生产大量种苗以满足药用植物人工栽培的需求；二是通过愈伤组织的培养或悬浮细胞的大量培养，直接生产药物或进行提取优化等。

1.4 超声波法提取多糖1.4.1 超声波提取技术超声波是指频率为20千赫～50兆赫左右的电磁波，它是一种机械波，需要能量载体—介质—来进行传播。

超声波在传递过程中存在着的正负压强交变周期，在正相位时，对介质分子产生挤压，增加介质原来的密度；负相位时，介质分子稀疏、离散，介质密度减小。

也就是说，超声波并不能使样品内的分子产生极化，而是在溶剂和样品之间产生声波空化作用，导致溶液内气泡的形成、增长和爆破压缩，从而使固体样品分散，增大样品与萃取溶剂之间的接触面积，提高目标物从固相转移到液相的传质速率。

在工业应用方面，利用超声波进行清洗、干燥、杀菌、雾化及无损检测等，是一种非常成熟且有广泛应用的技术。

1.4.2 超声波萃取原理超声波萃取中药材的优越性，是基于超声波的特殊物理性质。

主要是主要通过压电换能器产生的快速机械振动波来减少目标萃取物与样品基体之间的作用力从而实现固—液萃取分离。

（1）加速介质质点运动。

高于20 KHz声波频率的超声波的连续介质（例如水）中传播时，根据惠更斯波动原理，在其传播的波阵面上将引起介质质点（包括药材重要效成分的质点）的运动，使介质质点运动获行巨大的加速度和动能。

质点的加速度经计算一般可达重力加速度的二千倍以上。

由于介质质点将超声波能量作用于药材中药效成分质点上而使之获得巨大的加速度和动能，迅速逸出药材基体而游离于水中。

（2）空化作用。

超声波在液体介质中传播产生特殊的“空化效应”，“空化效应”不断产生无数内部压力达到上千个大气压的微气穴并不断“爆破”产生微观上的强大冲击波作用在中药材上，使其中药材成分物质被“轰击”逸出，并使得药材基体被不断剥蚀，其中不属于植物结构的药效成分不断被分离出来。

加速植物有效成份的浸出提取。

（3）超声波的振动匀化（Sonication）使样品介质内各点受到的作用一致，使整个样品萃取更均匀。

1.4.3超声波萃取的特点适用于中药材有效成份的萃取，是中药制药彻底改变传统的水煮醇沉萃取方法的新方法、新工艺。