CLSI MS35细菌和酵母菌快速鉴定微生物实验室应用指导_Christine C. Ginocchio

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质控性能
• • • •
根据生产商的指示 根据CLIA（临床实验室改进法案） 根据CLSI（临床实验室标准化研究所） 根据联邦/州和地方的监管机构
技术人员能力
• • • • 快速鉴定方法成功的关键 技术人员的能力和经验必须备有证明文件 未知病原菌的观察评估 缺乏经验者: 需要直接监督
Qingdao, Peoples Republic of China National Microbiology Workshop National Clinical Lab Center of Ministry of Health October 9, 2013
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MS35-A2
为什么使用快速病原学鉴定?
肺炎链球菌
病例3: 以最大化抗菌治疗效果为目的的快速 鉴定
• • • • • • Mr. Smith 67岁 主动脉瘤术后合并并发症 在ICU病房机械通气持续5周 出现发热，脓性气管分泌物 可疑呼吸机相关肺炎 血培养和痰培养生长真菌
光滑假丝酵母
微生物鉴定的影响
• 细菌和真菌的鉴定是指导抗菌药物和抗真菌药物 治疗的基础 • 微生物感染的快速报告与快速周转期相结合，以 最快启动治疗
Isolates Total
No. Correct to Species
4142
% Correct to Species
88.6
No. Correct to Genus
290
% Correct to Genus
6.2
No. Total Correct 4432
% Total Correct 94.8
132 135 108
91.7 94.7
76.5 91.9 92.6
4.4 3.6
18.2 2.2 0.0
96.1 98.2
94.7 94.1 92.6
Gram-positive GNE
NEGNB Anaerobes Yeast
300
95.7
1.7
97.3
0.0
2.7
No. = number; Gram-positive: Gram-positive cocci/rods; GNE: Enterobacteriaceae NEGNE: Non-Enterobacteriaceae Gram-negative bacilli 非肠杆菌科革兰氏阴性杆菌 MisID = incorrect to genus or incorrect to single species ID only 属或者种不正确 No ID = mixed genera or no identification provided 混合谱图或者无结果
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快速检测的方式
• • • • •
单管 玻片斑点 凝集 平板 显色培养基
• • • • •
荧光 酶 显微镜 形态学 平板培养法
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病例1: 改变命运的预后
• • • • • Stephanie 8岁 2岁被诊断为囊性纤维化 在过去2年发生严重的肺功能下降 2012年出现在肺移植手术的名单上 每月进行痰培养：确定为非发酵革兰阴性杆菌
铜绿假单胞菌
病例2: 对治疗的选择以及对潜在疾病的鉴定
• John 53岁 • 糖尿病，慢性阻塞性肺病，30年以上的吸烟史， 酗酒，静脉吸毒 • 间歇发热，出汗，呼吸短促，疲惫感持续3周，入 住ICU病房 • 多次血培养阳性，为革兰氏阳性球菌成对或成短链
为什么转变为快速检测/鉴定?
• 传统检测: 会延迟结果报告，并且费用高 • 增加的资金负担和人力的局限 • 高性价比的方法，可节省时间并且技术要求 较低 • 可用于临床决策
快速鉴定方法: 入选标准
• 最小的特征可识别某些病原菌，超过95% 可信度 • 直接报告结果，而不是推定，特异性与常 规检测相同 • 鉴定常见病原体 • 包含或排除某些潜在危险的病原体
酵母菌
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大肠杆菌鉴定策略
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通用快速检测
革兰氏染色 触酶实验 氧化酶实验 吲哚实验 尿素苯丙氨酸脱氨酶 (PDA)平板实验(隐球菌属, 布鲁 氏菌属, 幽门螺杆菌) • 尿素和尿素苯丙氨酸脱氨酶(PDA) 试管实验 • MUG 检测(大肠埃希菌和其他) • • • • •
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进一步检测的注意事项
• • • • • 一般为无菌体液 院内病原体感染控制的影响 爆发涉及的病原体 生化袭击相关病原体 通过公共卫生实验室确认
流行病/生物威胁/生化袭击的检测
2001年9月 炭疽 NYC
2003年3月 SARS 2013年: MERS
Toronto 2003
Courtesy of J. Mahoney
菌种特异性快速检测
• • • • • • • • • 快速胆汁溶解实验 (肺炎链球菌) 快速斑点CAMP实验 (无乳链球菌) 快速马尿酸水解实验(无乳链球菌) 凝固酶(金黄色葡萄球菌) MRSA (mecA 乳胶凝集) 芽管形成实验(白色念珠菌) 35度快速海藻糖同化实验 (光滑念珠菌) 吲哚乙酸酯平板实验(弯曲菌属和莫拉菌属) 快速卟啉合成实验(ALA) (嗜血杆菌)
快速鉴定的新思路 MALDI-TOF质谱分析法
检测
分离
+ +
离子检测器
m
2eU = L²
飞行时间
+
z
t²
+
加速 加速场
粒子化 解吸附
+ +
m: mass z: charge U: acceleration voltage L: path length t: time e: elementary charge
需氧和苛养革兰氏阴性杆菌
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需氧和苛养革兰氏阴性杆菌
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MALDI-TOF:挑战性的少见病原菌测试
No. Isolates
Total % Correct to % Correct Species to Genus % Total Correct
% MisID 0.2 0.4
0.0 0.0 0.9
% No ID 3.7 1.3
5.3 5.9 6.5
900 225
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M35-A2 需氧微生物
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M35-A2 厌氧微生物
Gram-positive
GNE NEGNB Fastidious Anaerobes
1319
965 558 331 651
1181
809 434 305 594
89.5
83.9 77.8 92.1 91.2
73
123 73 10 7
5.5
12.7 13.1 3 1.1
1254
932 507 315 601
NY State Department of Health, Wadsworth Center
排除特定病原菌：弗朗西斯菌
NY State Department of Health, Wadsworth Center
排除特定病原菌：伯克霍尔德菌
NY State Department of Health, Wadsworth Center
CLSI MS35-A2 细菌和酵母菌快速鉴定
微生物实验室应用指导
Christine C. Ginocchio, Ph. D., M. T. (A.S.C.P.) Senior Medical Director and Chief, Division of Infectious Disease Diagnostics Professor, Department of Pathology and Laboratory Medicine and Department of Molecular Medicine, Feinstein Institute for Medical Research, Hofstra University North Shore-LIJ Health System School of Medicine
传统检测
• 革兰氏染色• 生Fra bibliotek和酶反应试验• 商业化产品=更好的标准化和准确性
对病原菌的快速诊断以指导经验治疗
Kumar A, Roberts D, Wood KE, et al.: Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit Care Med, 34: 1589-1596, 2006.
厌氧革兰氏阴性菌
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厌氧革兰氏阳性菌
Clinical and Laboratory Standards Institute; All rights reserved M35-A2
95.1
96.6 90.7 95.2 92.3
Yeast
852
819
96.1
4
0.5
823
96.6
No. = number; Gram-positive: Gram-positive cocci/rods; GNE: Enterobacteriaceae NEGNE: Non-Enterobacteriaceae Gram-negative bacilli非肠杆菌科革兰氏阴性杆菌
革兰氏阳性球菌
Clinical and Laboratory Standards Institute; All rights reserved M35-A2
革兰氏阳性球菌
Clinical and Laboratory Standards Institute; All rights reserved M35-A2
2001年9月 天花威胁
1997-2013 禽流感
排除特定病原菌：炭疽芽孢杆菌
NY State Department of Health, Wadsworth Center
排除特定病原菌：鼠疫杆菌
NY State Department of Health, Wadsworth Center
排除特定病原菌：布氏杆菌
安全措施
• 样本类型: 脑脊液，血，淋巴结 • 穿戴个人生物安全防护服在生物安全实验室内操作 • 潜在的高致病性生物体（如弗朗西斯氏菌属，布鲁 氏菌，脑膜炎奈瑟菌） • 革兰氏染色可变，革兰氏阴性球杆菌，只生长在血 平板或巧克力平板，但不在麦康凯平板生长 • 革兰氏染色和湿片要有盖玻片 • 产生气溶胶的程序应在生物安全柜中进行或最好避 免
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快速鉴定方法: 排除标准
• 脑膜炎双球菌的早期报告，和淋病奈瑟氏菌 的确认 • 无单组简单检测可报告结果的病原菌
• 除了铜绿假单胞菌外的假单胞菌属 • 肠杆菌 • 需氧革兰氏阳性棒状杆菌
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基 质 /样 本 结 晶 靶板
MALDI-TOF鉴定常规流程
1. 挑取克隆
4. 装入VITEK MS
2. 涂在测试靶板上
3. 加基质: 1 µl 基质(CHCA) -cyano-4-hydroxycinnamic acid (甲酸– 酵母菌)
临床菌种性能多中心研究
No. Isolates 4676