已知基因序列的获取策略200612116731
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5U 72 ℃保温20～30 min
两步变温法PCR
载体构建中的常见问题
利用单酶切位点将片段插入载体 双酶切中的问题
对过长cDNA片段:可分段扩增，再利用RE
位点或重叠延伸融合成全长cDNA
酶切位点甲基化的问题 Cla I G6mATCGAT Xba I TCTAG6mATC
真核表达载体的选择
Primer Premier 5.0
引物设计 限制性内切酶位点分析 DNA基元(motif)查找 同源性分析
Genetool V 2.0
Oligo6.69
四、测序图比对、拼接与虚拟 克隆(in silico cloning)
常用本地软件：Clone manager、Vector NTI、DNAstar和ds-Gene等 在线工具：BLAST等
常用序列拼接软件
DNAstar 的SeqMan模块 VectorNTI程序的Contig Express模块 Sequencher
新的拼接任务
开始→所有程序→DNAstar →SeqMan
添加序列
打开保存序列的文件夹
选择序列
导入
用鼠标拖动手 动更改末端 整理一下末端
用鼠标点击更改 序列方向和形式
如何确认RNA的质量
RNA的电泳图谱 检测RNA溶液的吸光度 保温试验 荧光染色、毛细管电泳和Agilent2100生 物分析仪分析
28S 18S 5S
RT引物的选用
GSP：适合序列肯定的模板，常用于一步法RT －PCR。但是引物设计质量影响RT的结果。在 扩增低丰度的转录本时是最好的。 Oligo dT引物:真核生物的mRNA适用，建议用 于高质量RNA及全长转录本的逆转录； 随机引物：适合各种RNA的RT，可用于mRNA 片段的逆转录。
尽量减少RNAase污染
RNase的危害主要集中在将RNA pellet溶 解在水中之后，防止RNA降解的重点应 当放在组织样本的保存和RNA水溶液的 保存上。 注意实验前的准备工作：各种器材的去 RNAase处理与无RNAase的准备。 长期保存RNA时建议用去离子甲酰胺溶 解总RNA沉淀
同源性或互补性：两引物间最好不存在4个连续碱基
的同源性或互补性。
GC含量：一般为40-60%。另外，上下游引物的GC含
量不能相差太大。
Tm值：引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左
右可使复性条件最佳。有多种计算方法，如按公式 Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在软件中常使用的是最邻近
法(the nearest neighbor method) 。
搭桥技术融合基因
三、引物设计
引物设计的3条基本原则： 引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体 或发夹结构， 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
引物设计注意事项
引物的长度一般为15-30 bp，常用的是 18-27 bp，但不应大于38bp。 引物序列在模板内应当没有相似性较高， 尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易 导致错配。 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成 效率有较大的影响。
选择载体
自动查找
看看结果 拼接
6种阅读框
选择的序 列的位置
点开测序图 NCBI查询所选择的序列
保存结果
打印成PDF文 件也是一个不 错的选择
运行VNTI 程序 Contig Express
程序窗口，可以设定参数， 一般用默认值即可。
导入测序结果（文 件扩展名ab1改成 abi）相关软件
EditView for Macs ； Chroma for Windows]
SOE技术与基因人工合成及多基因融合
基因设计与人工合成中的密码子优化 DNAWorks 2.4 (Hoover, D. and Lubkowski, J., 2002) http://mcl1.ncifcrf.gov/dnaworks/
wenku.baidu.com
SOE：Spliced by overlapping extension
Promoter Conventional/Tissue-Specific/Inducible Poly (A) tail Kozak序列：－9GCCGCCA/GCCAUGG＋4
一个载体内的多基因表达
IRES系统 加linker直接融合表达 多个独立的表达 cassettes：优于共转染 表达
高保真DNA 多聚酶的选用
常用高保真DNA 多聚酶：如Pfu、Deep Vent、Vent、
Pwo、KOD、Pyrobest、PrimerStar等
PCR过程中HotStart与Touchdown的使用 高保真DNA 多聚酶与普通rTaq的混合使用 PCR产物加A尾进行T-A克隆：循环即将结束时加入rTaq
也可以用鼠标右键
导入后可以双击查看和编辑各个测序结果
选择序列，根据实际情况调整序列末端
选择序列拼接
双击查看结果
输出结果到剪贴板，注意最上面的像机按钮，直观吧。
开始→所有程序
导入序列
选择序列 此界面调整参数
详细说明
拼接
双击查看结果
输出结果
5’端序列的修饰与标记：可在引物设计时加上限
制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突 变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5‘端 限制酶位点外再加1-3个保护碱基。
简并引物：应选用简并程度低的密码子, 例如选
用只有一种密码子的Met, 3’端应不存在简并性。 否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
锚定RT引物的选用：5'–(T)25V N–3‘ 热启动RT
有条件者选用Tricine-EDTA Buffer溶解cDNA 10 mM Tricine-KOH (pH 8.5) 1.0 mM EDTA
小于5 微克
可自己找公司合成
建议用热盖PCR仪 或空气浴孵箱保温 建议选用RNase H消化
一、如何获取已知目的基因的 序列信息
先查找其蛋白相关信息,了解该基因编码 产物的基本情况与功能 （www.expasy.org） 进一步查找其核酸相关序列信息，常用 数据库：Genebank、EBI、DDBJ
二、目的基因cDNA序列的获取 方法
cDNA文库扫描 RT-PCR 人工合成
△G值：指DNA双链形成所需的自由能，该值反映
了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端 △G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间△G值 相对较高的引物。引物的3’端的△G值过高，容易在 错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。引物二 聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导 致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR反应不能正常进行。
已知基因序列的获取策略 ——兼谈引物设计与序列分析
黄 钢 第三军医大学遗传教研室 2006.11.1.
获取序列信息，设计合适的引物
选取相应的组织或细胞，提取RNA并RT
RNase H消化（可选）
PCR扩增获得全长cDNA
装入合适的克隆或表达载体，菌落PCR、酶切 与测序证实 根据需要进一步进行亚克隆
RT中提高合成全长cDNA的效率
消除mRNA 二级结构：逆转录之前将RT引物与RNA 模板
进行短暂的热变性, 可破坏mRNA 二级结构, 促进锚定引物与模板 的正确配对。
选用RNase H灭活改造的新型耐高温逆转录酶：
Thermoscript、Superscript Ⅲ等，RT后建议进行RNase H消化处 理。
组织RNA的提取
在匀浆器中加工冷冻的组织 通过注射器加工冷冻的组织 在液氮中将组织研磨成粉末 在液氮中研磨组织至粉末状，细胞裂解 更完全，产量比前二者多一倍。 合适的RNA提取方法加上合适的组织处 理方法，才能够获得最佳的提取效果
RNA提取两要素
忌讳贪多：不能指望1ml Trizol 提取100mg以上 组织，一般50mg用1mlTrizol较合适 速战速决：尽量缩短提取时间，不要完全照搬 Protocol,比如匀浆后如果没有很多组织碎片的话， 可以立即加入氯仿，立即离心，14000rpm离心 10min,取完上清加入0.6~1体积的异丙醇，立即 高速离心（14,000rpm,5min），..... 总之尽量快 速！
两步变温法PCR
载体构建中的常见问题
利用单酶切位点将片段插入载体 双酶切中的问题
对过长cDNA片段:可分段扩增，再利用RE
位点或重叠延伸融合成全长cDNA
酶切位点甲基化的问题 Cla I G6mATCGAT Xba I TCTAG6mATC
真核表达载体的选择
Primer Premier 5.0
引物设计 限制性内切酶位点分析 DNA基元(motif)查找 同源性分析
Genetool V 2.0
Oligo6.69
四、测序图比对、拼接与虚拟 克隆(in silico cloning)
常用本地软件：Clone manager、Vector NTI、DNAstar和ds-Gene等 在线工具：BLAST等
常用序列拼接软件
DNAstar 的SeqMan模块 VectorNTI程序的Contig Express模块 Sequencher
新的拼接任务
开始→所有程序→DNAstar →SeqMan
添加序列
打开保存序列的文件夹
选择序列
导入
用鼠标拖动手 动更改末端 整理一下末端
用鼠标点击更改 序列方向和形式
如何确认RNA的质量
RNA的电泳图谱 检测RNA溶液的吸光度 保温试验 荧光染色、毛细管电泳和Agilent2100生 物分析仪分析
28S 18S 5S
RT引物的选用
GSP：适合序列肯定的模板，常用于一步法RT －PCR。但是引物设计质量影响RT的结果。在 扩增低丰度的转录本时是最好的。 Oligo dT引物:真核生物的mRNA适用，建议用 于高质量RNA及全长转录本的逆转录； 随机引物：适合各种RNA的RT，可用于mRNA 片段的逆转录。
尽量减少RNAase污染
RNase的危害主要集中在将RNA pellet溶 解在水中之后，防止RNA降解的重点应 当放在组织样本的保存和RNA水溶液的 保存上。 注意实验前的准备工作：各种器材的去 RNAase处理与无RNAase的准备。 长期保存RNA时建议用去离子甲酰胺溶 解总RNA沉淀
同源性或互补性：两引物间最好不存在4个连续碱基
的同源性或互补性。
GC含量：一般为40-60%。另外，上下游引物的GC含
量不能相差太大。
Tm值：引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左
右可使复性条件最佳。有多种计算方法，如按公式 Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在软件中常使用的是最邻近
法(the nearest neighbor method) 。
搭桥技术融合基因
三、引物设计
引物设计的3条基本原则： 引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体 或发夹结构， 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
引物设计注意事项
引物的长度一般为15-30 bp，常用的是 18-27 bp，但不应大于38bp。 引物序列在模板内应当没有相似性较高， 尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易 导致错配。 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成 效率有较大的影响。
选择载体
自动查找
看看结果 拼接
6种阅读框
选择的序 列的位置
点开测序图 NCBI查询所选择的序列
保存结果
打印成PDF文 件也是一个不 错的选择
运行VNTI 程序 Contig Express
程序窗口，可以设定参数， 一般用默认值即可。
导入测序结果（文 件扩展名ab1改成 abi）相关软件
EditView for Macs ； Chroma for Windows]
SOE技术与基因人工合成及多基因融合
基因设计与人工合成中的密码子优化 DNAWorks 2.4 (Hoover, D. and Lubkowski, J., 2002) http://mcl1.ncifcrf.gov/dnaworks/
wenku.baidu.com
SOE：Spliced by overlapping extension
Promoter Conventional/Tissue-Specific/Inducible Poly (A) tail Kozak序列：－9GCCGCCA/GCCAUGG＋4
一个载体内的多基因表达
IRES系统 加linker直接融合表达 多个独立的表达 cassettes：优于共转染 表达
高保真DNA 多聚酶的选用
常用高保真DNA 多聚酶：如Pfu、Deep Vent、Vent、
Pwo、KOD、Pyrobest、PrimerStar等
PCR过程中HotStart与Touchdown的使用 高保真DNA 多聚酶与普通rTaq的混合使用 PCR产物加A尾进行T-A克隆：循环即将结束时加入rTaq
也可以用鼠标右键
导入后可以双击查看和编辑各个测序结果
选择序列，根据实际情况调整序列末端
选择序列拼接
双击查看结果
输出结果到剪贴板，注意最上面的像机按钮，直观吧。
开始→所有程序
导入序列
选择序列 此界面调整参数
详细说明
拼接
双击查看结果
输出结果
5’端序列的修饰与标记：可在引物设计时加上限
制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突 变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5‘端 限制酶位点外再加1-3个保护碱基。
简并引物：应选用简并程度低的密码子, 例如选
用只有一种密码子的Met, 3’端应不存在简并性。 否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
锚定RT引物的选用：5'–(T)25V N–3‘ 热启动RT
有条件者选用Tricine-EDTA Buffer溶解cDNA 10 mM Tricine-KOH (pH 8.5) 1.0 mM EDTA
小于5 微克
可自己找公司合成
建议用热盖PCR仪 或空气浴孵箱保温 建议选用RNase H消化
一、如何获取已知目的基因的 序列信息
先查找其蛋白相关信息,了解该基因编码 产物的基本情况与功能 （www.expasy.org） 进一步查找其核酸相关序列信息，常用 数据库：Genebank、EBI、DDBJ
二、目的基因cDNA序列的获取 方法
cDNA文库扫描 RT-PCR 人工合成
△G值：指DNA双链形成所需的自由能，该值反映
了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端 △G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间△G值 相对较高的引物。引物的3’端的△G值过高，容易在 错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。引物二 聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导 致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR反应不能正常进行。
已知基因序列的获取策略 ——兼谈引物设计与序列分析
黄 钢 第三军医大学遗传教研室 2006.11.1.
获取序列信息，设计合适的引物
选取相应的组织或细胞，提取RNA并RT
RNase H消化（可选）
PCR扩增获得全长cDNA
装入合适的克隆或表达载体，菌落PCR、酶切 与测序证实 根据需要进一步进行亚克隆
RT中提高合成全长cDNA的效率
消除mRNA 二级结构：逆转录之前将RT引物与RNA 模板
进行短暂的热变性, 可破坏mRNA 二级结构, 促进锚定引物与模板 的正确配对。
选用RNase H灭活改造的新型耐高温逆转录酶：
Thermoscript、Superscript Ⅲ等，RT后建议进行RNase H消化处 理。
组织RNA的提取
在匀浆器中加工冷冻的组织 通过注射器加工冷冻的组织 在液氮中将组织研磨成粉末 在液氮中研磨组织至粉末状，细胞裂解 更完全，产量比前二者多一倍。 合适的RNA提取方法加上合适的组织处 理方法，才能够获得最佳的提取效果
RNA提取两要素
忌讳贪多：不能指望1ml Trizol 提取100mg以上 组织，一般50mg用1mlTrizol较合适 速战速决：尽量缩短提取时间，不要完全照搬 Protocol,比如匀浆后如果没有很多组织碎片的话， 可以立即加入氯仿，立即离心，14000rpm离心 10min,取完上清加入0.6~1体积的异丙醇，立即 高速离心（14,000rpm,5min），..... 总之尽量快 速！