蛋白结晶技术在病毒学中的应用

术平 台。
关键词 ： 蛋 白结 晶技 术 ； 病 毒 结构 ； 病 毒蛋 白
ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ Ｅ Ｍ） 是 低 温 冷 冻 技 术 与 电子 显 微 镜 相 结 合 ， 可 以 获得更 精细的病毒结 构 ， 甚 至 可 获 得 生 理 状 态 下 病 毒 的
内 部 结 构 ＿ ３ ｊ 。
收 稿 日期 ： ２ ０ ０ ３ — ０ ３ — １ １
作 者 简介 ： 黄金 海 （ １ ９ ７ Ｏ ～） ， 男， 陕西合 阳人 ， 天 津 市 畜 牧 兽 医研
究所在 读 博 士 ， 副研 究 员， 主 要 从 事动 物分 子 病毒 学 与免 疫 学研
究工作 。
可提 供一些信息 ， 但 这 些 变 化 不 可 能 解 决 这 个 问题 。 同 时 这些 技 术 也 不 可 能 用 于 分 析 大 的病 毒 粒 子 ， 如 有 上 百
蛋 白结 晶 技 术 在 病 毒 学 中 的 应 用
黄金 海ｈ ， 杨 汉 春
（ １ ． 中国农 业 大学 动物 医学 院 ， 北京 １ ０ ０ ０ ９ ４ ； ２ ． 天 津市 畜牧 兽 医研 究所 ， 天津 ３ ０ ０ １ １ ２ ）
中 图分 类号 ： ￥８ ５ ２ ． ６ ５ ； Ｑ５ １
毒药 物设计 、 病毒 突变及免 疫逃逸机理 研究等 。
ｃ ｌ ｅ ａ ｒ ｌ ｏ ｃ ａ ｌ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｉ ｇ ｎ ａ ｌ ｓ ） 与 病 毒 基 因 和 其 相 关 蛋 白迁 低温 电镜 技 术 （ ｃ ｒ ｙ ｏ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｎ ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｓ ｃ ｏ ｐ ｙ ）目 前 ， 此 移 至 核 内 ， 从 而 引 导 复 制 的发 生 。乳 头 瘤 病 毒 的 复 制 需 技 术 主要 利 用 低 温 电 镜 术 和像 重 构 方 法 ， 研 究 完 整 病 毒 要 复 制 起 始 蛋 白 Ｅ１和 Ｅ２参 与 ， 并在 复 制点 （ ｏ ｒ ｉ ） 形 成 粒子 的三维结构 ， 即病 毒 粒 子 的 结 构 研 究 ， 主要获得“ 电 （ Ｅ１ ） ２ 一 （ Ｅ２ ） ２ 一 ＤＮＡ 复 合 物 。Ｅ ｔ ｉ ｃ Ｊ Ｅ 等 通 过 对 Ｅ１二 镜结构 ” 。 低 温 电镜 术 将 病 毒 样 品在 超 低 温 状 态 下 维 持 。 聚体 进行 选 择性 突 变 ， 得 到 Ｅ１ 一 ＤＮＡ 结 合 域 ０ ． １ ９ ｎ ｍ 植 入干 冰 （ ｅ ｍｂ ｅ ｄ ｄ ｅ ｄ ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｅ ｏ ｕ ｓ ｉ ｃ ｅ ） 的样 品 形 成 冰 晶 ， 的精 细 晶体 结构 ， 分 析 表 明 Ｅ１ 一 ＤＮＡ 结 合 域 决 定 性 的 电子 显 微 镜 发 射 的 低 辐 射 电子 可 大 大 降 低 对 样 品 的 损 残 基 位 于 一 个 延 伸 的 闭 合 环 和 ａ螺 旋 内 ｊ 。 伤 ， 通 过 高 级 影 象 分 析 和 影 像 重 构 技 术 可 进 行 进 一 步 完 目前 ， 对 病毒组装 的机理 尚不清楚 。 然而 ， 其 关 键 在
文 献标 识码 ： Ａ
文章 编 号 ： １ ０ ０ ７ — ５ ０ ３ ８ （ ２ ０ ０ ３ ） ０ ５ — ０ ０ ０ １ — ０ ３
分子 生 物学 技 术 的发 展 ， 使 人们 可 以用基 因工 程重 组 摘 要 ： 病毒 及其 亚单位 蛋 白的三 维结构 （ ３ Ｄ） 技 术 表 达 病 毒 或 病 毒 蛋 白 亚 单 位， 并 对其 进 行结 晶分 析 。 解析 是认 识 病 毒 蛋 白功 能 的 有 力手 段 。对 病 毒
结 构 的认 识 正 经 历 着病 毒 粒 子 电镜 结 构 、 纳 米 ２ 研 究 病 毒 结 构 的 常 用 方 法 ＥＭ 和 传 统 的 病 毒 结 晶 技 术 主 要 用 于 病 毒 形 态 的 水 平 的 精 细 结 构 及 病 毒 组 成 蛋 白原 子 水 平 ３ Ｄ 研 究 ， ＥＭ 的 主 要 原 理 是 利 用 在 真 空 状 态 下 重 金 属 染 色 结 构 的 变 化 。 晶 体 的 Ｘ 射 线 衍 射 技 术 可 在 原 子 利 用 这 些 技 术 水 平 上 认 识 病 毒 蛋 白 的 结 构 。 这 为 从 结 构 生 物 和 病 毒 粒 子 形 成 的 阴 影 反 差 来 观 察 结 构 ， 发 现 了 螺旋 对 称 和 二 十 面 体 对 称 的病 毒 ， 但 不 能 获 得 病 学 的 角度 认 识 病 毒 复 制 、 病毒 粒子的装 配、 病 毒 ｃ ｒ ｙ ｏ — 的 致 病 与 免 疫 机 理 及 抗 病 毒 药 物 设 计 提 供 了 技 毒 的 精 细 结 构 。 新 近 发 展 起 来 的 低 温 电 镜 技 术 （
Ｈቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ Ｖ） 。 尽 管 通 过 膜 相 关 蛋 白 的 电 子 扫 描 和 低 温 电 镜 术
Ｂ ｅ ｒ ｎ ａ ｌ Ｊ Ｄ 等 人 报 道 了 第 一 个 植 物 球 形 病 毒 一 番 茄 丛 矮病 毒（ ＴＢ Ｓ Ｖ） 的 晶体 ， １ ９ ５ ９年 报 道 了第 一 个 动 物 球 形 病 毒 一脊 髓 灰 质 炎 病 毒 （ Ｐ ｏ ｌ ｉ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ） 的晶体 。 要进行单 晶的结构分 析 ， 必 须 有 精 确 的 收集 衍 射 数 据 的技术 （ 用 聚焦好 、 高强 度 Ｘ 射 线 才 能分 辨 和 记 录 产 生的衍射数据 ） ； 进行大量 数据计算 的硬件和软件资 源 ； 要 有处 理 数据 和分 析 结构 的理论 和 方 法 。因此 ， 直 到 １ ９ ７ ８年 ， 才 获 得 ＴＭＶ 的 ０ ． ４ ０ ｎ ｍ 分 辨 率 纤 维 衍 射 数 据 和 ＴＢ Ｓ Ｖ ０ ． ２ ９ ｎ ｍ 分辨率单 晶衍射数据 ， 获 得 能 解 释 的 电 子 密 度 图Ｌ １ ｊ 。
叠， 与晶体衍射资 料互为补 充 。 应 用 Ｘ一 射 线 技 术 可 以 获 得 清 晰 的 病 毒 粒 子 模 型
图， 虽然 看不 到病毒 内 的核酸 结 构 ， 但 可 在 接 近 原 子 水 平 看到 病 毒 的精 细结 构 ， 这 是 象 扫 描 电镜 、 ＡＦ Ｍ 所 不 能作到 的 ， 但 其 最 大 的 缺 陷 在 于 需 要 得 到 易 于 进 行 Ｘ一
１ ９ ３ ５年 Ｗ ｅ ｎ ｄ ｅ ｌ ｌ Ｍ． Ｓ ｔ ａ ｎ ｌ ｅ ｙ首 次 应 用 硫 酸 铵 反 复 沉淀法 获得 烟 草 花 叶 病 毒 （ ＴＭ Ｖ ） 的 类 晶体 。１ ９ ３ ８ 年
Ｘ一 射线衍射 技术 （ Ｘ— ｒ ａ ｙ ｄ ｉ ｆ ｆ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ） 解 析 病 毒 结 构 最 重 要 的方 法 是 对 纯 化 病 毒 形 成 的 晶 体 进 行 Ｘ一 射 线 衍 射分析 ， 从 而 可 在 原 子 水 平 上 认 识 病 毒 的 结 构 。 但 一 些 因素影 响 了 Ｘ 射线 衍 射 图谱 技 术对 病 毒 的分 析 ： ① 病 毒必须 高度纯化且 保持结构 整体性 ， 以形 成 足 够 大 的 结 晶， 经 Ｘ 射线 衍射后才 能形成 显 著 的衍射 图 ， 否 则 影 响 特 异衍射 信息 的收集 ； ② 部分 病 毒仅 仅 能得 到微 晶 ， 这 些 晶体用 Ｘ 射线 衍射 技 术 不能 得到 足 够 的分 析 信 息 ， 必须 使用更强 的同步辐 射 （ ｓ ｙ ｎ ｃ ｈ ｏ ｔ ｒ ｏ ｎ） 技 术 产 生 更 强 的光束 ， 以进行 进一步 的分 析 ； ③ 不 规 则 的 有 囊 膜 病 毒 不 容 易 形 成 晶体 ， 从而 难 以得 到完 整 的原 子结 构解 析 ， 目前 尚没 有 一 种 有 囊 膜 病 毒 的 原 子 结 构 被 解 析 （ 包 括
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２
动 物 医学进 展
２ ０ ０ ３年
第 ２ ４卷
第 ５期 （ 总第 １ ２ ７期 ）
种 蛋 白组 分 的痘 病 毒 的 结 构 分 析 。
３ ． ２ 研 究 病 毒 的 增 殖 与 组 装
核 磁 共 振 技 术 （ Ｎｕ ｃ ｌ ｅ ａ ｒ ｍａ ｇ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｒ ｅ ｓ ｏ ｎ ａ ｎ ｃ ｅ ， 如 病 毒 核 衣 壳 蛋 白结 构 与 核 酸 结 合 的 构 象 关 系 ， 在 ＮＭ Ｒ） 核磁共 振正被 用于各种 分子 ， 包 括 蛋 白和 核 酸 结 维 持 病 毒 复 制 、 转 录 等过程 中对维 护基 因稳定 性 ， 发 挥 构 的分 析 。但 这 种 技 术 仅 限 于 分 子 量 不 大 于 ３ ～ ４万 小 酶 活 性 中 的 作 用 机 理 。 病 毒 衣 壳 除 具 有 保 护 病 毒 基 因 的 分 子 的分 析 ， 而 且 所 得 到 的信 息 不 能 被 现 有 的其 它 分 析 功 能 外 ， 还 具 有 与 宿 主 细 胞 特 异 性 组 分 结 合 以 引 导 复 制 技术解译 （ ｄ ｅ ｃ ｉ ｐ ｈ ｅ ｒ ） 。在 病 毒 学 上 主 要 用 于 病 毒 短 肽 分 发 生 的作 用 ， 明 显 的 例 子 是 在 宿 主 细 胞 内 复 制 的 病 毒 核 子 与抗 体 小 肽 表 位 间 空 间 构 象 变 化 的研 究 。 可 用 于 抗 病 衣 壳 蛋 白 。 包含在初 始氨基 酸序列 的“ 核定位信 号” （ ｎ ｕ —
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动物医学进展 ， ２ ０ ０ ３ ， ２ ４ （ ５ ） ： １ － ３
Ｐｒ ｏｇｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎａ ｒ ｙ Ｍ ｅｄ ｉ ｃ ｉ ｎｅ
品 零 覆 ≥ｄ
略 文 献 综述
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内 部 的核 酸 之 间 是 由各 种 次 级 键 结 合 的 ， 因此 ， 用 一 些 射 线 分 析 的 规 则 晶体 。 能破坏氢 键 、 盐键 或疏 水键 等次 级键 ， 而 又 不 破 坏 共 价 上个世 纪末 ， 随 着分 子 生物 学技 术 的发 展 ， 使 得 病 键 的试 剂 处 理 ， 可 使 病毒 蛋 白与核 酸分离 ， 或 使 蛋 白 质 毒 亚 单 位 蛋 白 的 表 达 及 纯 化 变 得 相 对 容 易 ， 从 而 使 进 一 外壳解聚 。 但 这 些 理 化 学 方 法 都 可 使 蛋 白质 发 生 不 同程 步 从 原 子 水 平 上 研 究 病 毒 亚 单 位 蛋 白 的 结 构 及 功 能 成 度 的变 性 ， 需 要 防 止 不 可 逆 变 性 的发 生 。 为 可 能 。 研 究 蛋 白 三 维 结 构 的 方 法 有 ３种 。
电子 显微 镜 （ Ｅ Ｍ） 技 术 和 晶 体 的 Ｘ一 射 线 衍 射 技 术 １ ９ ８ ２ 年 Ｂｉ ｎ ｎ ｉ ｎ ｇ Ｇｒ ４ Ｊ 发 明 了 原 子 力 学 显 微 镜 是 研究 病 毒 形 态 结 构 的 主 要 技 术 。 晶 体 结 构 是 用 于 研 究 （ ａ ｔ ｏ ｍｉ ｃ ｆ ｏ ｒ ｃ ｅ ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｓ ｃ ｏ ｐ ｙ， ＡＦＭ ） 技术， 该 技 术 能 很 好 蛋 白质 三 维 结 构 的一 种 主 要 手 段 ， 由 于 晶体 蛋 白一 般 含 可 以准 确 测 量 病 毒 的 大 小 及 其 表 面 有 ３ Ｏ ～９ Ｏ 的溶 剂 ， 有 助于 维持蛋 白的天然构象 ， 从 地 观 察 生 物 学 结 构 ， 结 构 ， 揭 示 衣 壳 的 排 列 ， 甚 至 衣 壳 蛋 白 亚 单 位 在 衣 壳 的 而 使 蛋 白结 构 及 对 功 能 的 推 测 与 研 究 具 有 可 靠 性 。 分 布 ， 经 进 一 步 优 化 ， 其 结 果 可 与 Ｘ一 射 线 晶 体 图 谱 重 １ 病 毒 结 晶研 究 的历 史 完 整 的病 毒 颗 粒 和 它 的 外 壳 蛋 白可 以 分 别 被 纯 化 结 晶 并 进 行 Ｘ 射 线 衍 射 单 晶 结 构 分 析 或 纤 维 结 构 分 析 ， 通 过 解 析 Ｘ 射 线 衍 射 图 进 一 步 获 得 病 毒 的 形 态 结 构。 早期 的研究主要通 过理化学方法 纯化病毒及其 蛋 白 而获得晶体 。 病 毒 外 壳 蛋 白各 亚基 之 间 以及 它 们 与 病 毒