秋水仙素诱导加倍

在染色体加倍过程中,0.3%~0.5%秋水仙碱水溶液在20~25的条件下浸种棉花单倍体植株芽24 h,加倍率可达40%以上,效果较好[棉花]。在对小麦与玉米杂交诱导产生的小麦单倍体中,以0.5%浓度的秋水仙

碱加倍处理效果最好,可获得98.2%加倍率[玉米]。

若把带秋水仙碱溶液的脱脂棉盖在油菜的顶芽、腋芽上,或用0.45 mm针头把0.2%秋水仙碱注射到植株中加倍染色体;初花期把单倍体植株挖出,用

0.2%~0.34%秋水仙碱溶液浸根1.5~8.0 h也可进行染色体加倍;15~20日龄的胚状体可用0.1%~0.2%秋水仙碱处理8~20 h进行加倍。

秋水仙素处理材料常用方法有:浸渍法、注射法、琼脂法、滴液法等。

浸根法。

将植株从土壤中拔出来,洗净根部泥土,然后

将根浸泡在0.2%~0.34%秋水仙素溶液中1.5~3h,流水洗净根部的药液后,再把植株栽到土中。此法多用于加倍远缘杂交产生的不孕杂种和用其它方法未能加倍而又必要的小孢子单位体苗[8]。但浸根法所需药剂量大,成本较高,而且移栽后,幼苗成活率会受到影响。

浸种法。

运用秋水素溶液直接浸泡种子。

注射法。

茎尖生长点注射法,高效、省工、成本低,适合于大量材料的处理。刘志增[14]用此法诱导的玉米单倍体加倍效果比对照提高了3.6倍;Chase用0.05%秋水仙素和10%甘油液0.5 mL采用注射法注射盾片节,发现处理比对照的结实率提高了3倍多。

琼脂法

在刚展开的子叶生长点中央涂抹0.2%秋水仙素琼脂凝胶,罩玻璃杯保湿,以免琼脂干裂,处理后冲洗多次,消除残毒。此方法诱变率很高,而以前采用浸种法、幼苗滴液法一直未获成功。

实验表明，有效的诱变浓度是0.0006～1.6%，以0.2%的浓度诱变效果最好。此药剧毒，在应用时要特别注意。秋水仙素是诱变多倍体效果最好的药剂之一。

1.0g/L秋水仙素溶液的配制：称取20 mg秋水仙素，加入8.5g/L NaCl溶液20mL，待完全溶解后，经5.516×104Pa，15min高压蒸汽灭菌后避光保存于4度冰箱中。秋水仙素为剧毒药品,实验中应注意不要将药品沾到皮肤上,眼睛中。如果沾到皮肤上,应用大量自来水冲洗。

取10.0g/L秋水仙素溶液1mL加入8.5g/L NaCl溶液99mL即10µg/mL的秋水仙素。使用时取10µg/mL 的秋水素溶液0.1mL，用8.5g/L NaCl稀释至1mL即为1µg/mL的秋水仙素溶液。

0.002g/2ml*100%=0.2%

0.001g/2ml*100%=0.1%

0.0005g/2ml*100%=0.05%

为了节省，可以用万分之一的分析天平称取，然后用移液器吸取溶剂。或者，如下：0.01g/5ml*100%=0.2%

取2ml上述溶液再加2ml溶剂，即为0.1%

取1ml上述溶液再加3ml溶剂，即为0.05%

秋水仙素，一种生物碱，0.1%这样的一般是质量浓度. m/ρ.V=0.1% 其中水的密度为1，M 为要配的量，利用此等式求出所用的秋水仙素的量，然后定量配置.

大家好，请教一下0.5mg的秋水仙素配多少水才能得到0.2%的秋水仙素溶液呢？谢谢了！！！根据溶质稀释前后的量不变，需要加40ml的水

1.洋葱材料的处理：将秋水仙素溶液倒入小培养皿中，放上洋葱鳞茎，使其生根部位刚和液面接触。同时另－培养皿内放清水，亦放洋葱鳞茎作为对照。在25C下培养数日，待鳞茎长出幼根时即可进行观察，经加倍的根尖都较正常对照的肥大，用刀片切取经处理而肥大的根尖及对照的根尖（长约2－5毫米），投入FAA固定液中固定。按前面方法进行染色体制片，计数染色体数目的变化。

2.处理种子：这种方法适用于发芽快、或能在数天内发芽的种子。先将水稻或大麦种子洗净用水浸一天或干燥种子用0.1－0.2%升汞溶液消毒8－10分钟，再用清水洗净，然后摆放在铺有湿滤纸的一些培养皿中，其中一部分培养皿中加入0.2%秋水仙素溶液，另一部分培养皿中注入清水作为对照。为了避免蒸发可加盖，置于培养箱中保持25℃左右使种子发芽。种子萌发后，应继续处理24小时。在处理过程中，仍注意药液的蒸发随时添加清水，保持原处理药液浓度。处理后，用清水冲洗净种子上的残留再播种或砂培。处理适度的种子比对照的发芽稍慢，种芽胀大。从形态上可初步区分出加倍是否成功。

3.处理幼苗或成株：对于发芽迟缓的种子，在其出苗后处理幼苗效果更好。由于秋水仙素只对正在分裂的细胞发生作用。因此处理部位大多在茎尖，或顶端的生长点或新发育的侧芽。若烟草幼苗较小，可将种植幼苗的钵、盆倒置架起来，只使茎端的生长点浸入装有0.2－0.4%秋水仙素的器皿中。如果是水稻或大麦幼苗，则可将幼苗穿过纱布将根盖好，避免失水干燥。注意根系，一般易受药害，尤其是双子叶植物，故不采取处理根的办法。处理后的幼苗，用清水冲洗残液后，进行栽种或砂培。

对于成株烟草则采用将蘸有0.1－0.4％秋水仙素的棉球，置放于烟草顶芽、腋芽的生长点处，并且经常滴加清水保持药液浓度。

处理幼苗或成株的生长点所需时间约在24－28小时之间，处理后将植株上残存药液充分洗净，待进一步生长后，进行观察和鉴定。

5.观察与鉴定：处理后的植株和未处理植株在外部形态上和结构上，是有区别的。常采用的方法是观察和比较两者气孔的大小。将叶面表皮撕下在显微镜下观察，多倍体叶面气孔比二倍体大很多，从外部形态上加倍后生长的植株比二倍体高大，叶片肥厚。

在形态观察的基础上，可进一步进行镜检观察染色体数目的变化。

附：0.2－0.4%秋水仙素的配制：取秋水仙素1克（先用少许95%酒精助溶），溶于250－500亳升蒸馏水中，配成0.2－0.4%秋水仙素溶液。亦可制成较高浓度的母液，放入棕色玻璃瓶内，用时再稀释到所需的浓度。

可以称4mg+200ml生理盐水溶解，就是20ug/mml 的终浓度了，你可以根据相关比例去称取比例的秋水仙素就可以了。其中，溶解需要稍微水浴加热溶解（37°C）5分钟左右即可！，过滤后闭光保存！

用10mg 加10ml注射用水得到0.1%母液。

秋水仙素与二甲基亚砜(DMSO)以及细胞分裂素配合使用，能有效提高加倍频率J。因为DMSO及细胞分裂素能引起植物的生理损伤，从而降低诱变剂的诱变效应。秋水仙素溶液中加DMSO、甘油等低分子量中性的溶质，这些溶质在溶液中能与多个水分子结合(水合作用)，可提高溶液的粘度，同时甘油和DMSO等能缓慢渗透到细胞质内部，使秋水仙素作用面加大。陈柏君_l 将黄苓愈伤组织用含有2％DMSO 的0．2％秋水仙素水溶液浸泡12 h，诱导率高达40．0％。

秋水仙素溶液的浓度及处理时间的长短是诱导多倍体成功的关键因素。一般秋水仙素处理的有效浓度有0.0006%～1.6%，比较适宜的浓度为0.2%～0.4%。处理时间长短与所用秋水仙素的浓度有密切关系，一般浓度俞大，处理时间则要愈短，相反则可适当延长。多数实验表明，浓度大，处理时间短的效果比浓度小，处理时间长要好。但处理时间一般不应小于24小时或以处理细胞分裂的1～2个周期为原则。

由于不同植物，不同器官或组织在一定条件下对秋水仙素的反应不同，因此，须根据不同情况来掌握处理的浓度和时间。例如，东北林业大学张敩方等人用白花类型金鱼草种子进行多倍体诱变，采用浓度0.3%～0.5%的秋水仙素处理24小时诱变效果较好。另有实验表明，处理矮牵牛种子的适宜浓度为0.01%～0.1%，以0.05%处理时间24小时效果最佳。在不同器官方面，处理种子的浓度可稍高些，持续时间可稍长（一般为24～48小时）；处理幼苗时，浓度应低些，处理时间可稍短点；植物幼根对秋水仙素比较敏感，极易受损害，因此，对根处理时应采用秋水仙素溶液与清水交替间歇的方法较好。

秋水仙素溶液只是影响正在分裂的细胞，对于处于其他状态的细胞不起作用。因此，对植物材料处理的适宜时期是种子（干种子或萌动种子）、幼苗、幼根与茎的生长点、球茎与球根的萌动芽等。如果处理材料的发育阶段较晚，被诱导的植株易出现嵌合体。

4．秋水仙素处理的方法

（1）浸渍法

此法适合于处理种子，枝条盆栽小苗的茎段生长点。

一般，选干种子或萌动种子，将它们放于培养器内，再倒入一定浓度的秋水仙素溶液，溶液量为淹没种子的2/3为宜。处理时间多为24小时，浓度0.2%～1.6%。浸渍时间不能太长，一般不超过6天，以免影响根的生长。最好是在发根以前处理完毕。处理完后应及时用清水洗净残液，再将种子播种或沙培。对于百合类植物，常采二倍体鳞片浸于0.05%～0.1%的秋水仙素溶液，处理1～3小时后洗净扦插。唐菖蒲实生小球也可用浸渍法促使染色体加倍。

盆栽幼苗，处理时将盆倒置，使幼苗顶端生长点浸入秋水仙素溶液内，以生长点全部浸没为度。对于组织培养试管苗也可采用浸渍法处理，只是处理时须用纱布或湿滤纸覆盖根部，处理时间因材料可从几个小到几天。对插条，一般处理1～2天。

（2）滴定法

用滴管将秋水仙素水溶液滴在子叶、幼苗的生长点上（即顶芽或侧芽部位）。一般6～8小时滴一次，若气候干燥，蒸发快，中间可加滴溜馏水一次，如此反复处理一至数日，使溶液透过表皮渗入组织内起作用。若水滴难以停留在芽处，则可用棉球包裹幼芽，再滴芽液处理。此法与浸种法相比，可避免植株根系受到伤害，也比较节省药液。

（3）毛细管法

将植株的顶芽、腋芽用脱脂棉或纱布包裹后，将脱脂棉与纱布的另一端浸在盛有秋水仙素溶液的小瓶中，小瓶置于植株近旁，利用毛细管吸水作用逐渐把芽浸透，此法一般多用于大植株上芽的处理。

（4）涂抹法

将秋水仙素乳剂涂抹在牙上或梢端，隔一段时间再将乳剂洗去。

（5）套罩法

保留新梢顶芽，除去牙下数叶，套上一个胶囊。内盛0.65%的琼脂加适量秋水仙素，经24小时即可除去胶囊。

（6）注射法

采用微量注射器将一定浓度的秋水仙素溶液注入植株顶芽或侧芽中。

（7）复合处理法

据日本山川邦夫（1973年）报道，将好望角苣苔属（Streptocarpus，属苦苣苔科植物）中的一些种用秋水仙素处理11天，又用0.04～0.05Gy（4～5rad）的X 射线照射，可提高染色体加倍植株的出现率达到60%。而单独用秋水仙素处理时为30%。采用复合处理法还获得了两株八倍体。

5．秋水仙素诱导多倍体需注意的事项

（1）幼苗生长点的处理愈早愈好，获得全株四倍性细胞的数目就愈多，处理时间愈晚，则大多是混杂的嵌合体。

（2）植物组织经秋水仙素处理后，在生长上会受到一定影响，如果外界条件对它生长不适宜，也会使试验失败，要注意培育、管理。对形成嵌合体的可采用摘顶、分离繁殖、细胞培养等方法。

（3）处理期间，注意处理时的室温，当温度较高时，处理浓度应低一些，处理时间要短些；相反，当室温较低时，处理浓度应高些，处理时间应长点。

（4）诱导多倍体时，处理的植物材料应选二倍体类型，且生长发育处理幼苗期，材料数量上应尽量多数，以便选择有利变异。