HPLCfinal高效液相色谱分析
高效液相色谱分析实验
高效液相色谱分析实验高效液相色谱(HPLC)是一种用于分离、检测和定量分析化学样品的分析技术，具有高分辨率、高灵敏度和高选择性。
在实验室中，HPLC广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全等领域。
本文将介绍HPLC的实验原理、步骤及关键技术。
一、实验原理HPLC的原理是将混合物通过高压注射，经过固定相柱进行分离。
在HPLC中，固定相柱是最重要的组成部分之一，它可以根据样品之间的化学性质选择不同的固定相柱，如反相柱、离子交换柱、手性柱等。
在HPLC实验中，样品可以通过两种方式进样，一种是自动进样器，另一种是手动进样。
进样器将样品注入进样站点后，通过高压泵将样品推入柱子中，样品在柱子中分离后，被通过光学检测器检测，进而得到分离的结果。
二、实验步骤1.样品准备：根据实验要求，准备需要进行分析的物质样品，将其溶解或稀释到适当的浓度。
2.选择柱子：根据样品的性质选择适当的固定相柱。
例如，如果样品是极性的，则选择反相柱。
3.设定实验条件：根据样品的特征和实验需求，设置高压泵的流速、检测器、柱温等参数。
4.样品进样：将样品使用自动进样器或手动进样器进行进样。
5.柱子分离：开启高压泵，将样品推入柱子中。
样品将在柱子中根据化学性质进行分离。
6.数据检测和记录：通过光学检测器检测样品的峰值，并记录分离结果。
可以使用计算机软件进行数据分析。
7.清洗和重用：实验完成后，需要对HPLC仪器进行清洗和重置，以便下次使用。
三、关键技术1.换柱：为了保证实验结果的准确性和可靠性，柱子需要定期更换。
柱子的寿命取决于样品的特性和使用情况。
2.校准标准品：在实验中使用标准品校准HPLC仪器，以确保仪器的准确性和灵敏度。
3.优化实验条件：通过改变流速、温度、柱子等实验条件，可以优化分离效果。
4.检测器选择：根据样品的性质选择合适的检测器，例如紫外检测器、荧光检测器等。
5.数据分析：使用HPLC软件对数据进行分析，生成和保存分析报告。
四、实验安全1.注意个人防护：在操作HPLC仪器时，应佩戴安全防护眼镜和手套，避免接触有害物质。
高效液相色谱分析原理及流程
高效液相色谱分析原理及流程高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。
通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。
所用的固定相为大于100um的吸附剂(硅胶、氧化铝等)。
这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。
而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。
高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。
近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。
世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。
高效液相色谱分析原理(一)高效液相色谱分析的流程由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。
被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。
(二)高效液相色谱的分离过程同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。
组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。
若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。
高效液相色谱分析
高效液相色谱分析高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种广泛应用于化学、生物学、环境科学等领域的分析方法。
它以液相为载流相，通过对样品溶液进行分离、检测和定量分析。
HPLC基于物质在固定相表面上的分配和吸附性质的差异，通过调节流动相的组成、浓度和温度等参数，实现对样品组分的分离和定量。
高效液相色谱技术具有以下几个优点。
首先，它可以对几乎任何类型和性质的化学物质进行分析。
不同于气相色谱仅适用于气体和挥发性液体的分析，HPLC可以处理各种样品类型，包括有机化合物、小分子药物、天然产物、生物大分子等。
其次，HPLC分析具有高度的灵敏性和选择性。
通过使用不同类型和特定的固定相材料，可以实现对样品成分的高效分离和检测。
此外，HPLC具有较高的分辨率和重现性，使得得到准确和可靠的分析结果成为可能。
高效液相色谱的基本原理是在不同固定相表面上，样品分子在溶剂中以不同的速率分配和吸附。
为了实现对样品的有效分离，需要选择合适的固定相、流动相和检测方法。
固定相通常是多孔性颗粒，如硅胶、气相色谱柱填料等。
流动相是溶解样品的溶剂，其组成和性质对分析结果具有重要影响。
为了实现高效的分离和检测，常常需要优化流动相的组成和流速等参数。
检测方法通常使用紫外可见吸收光谱检测，通过测量样品在紫外可见光范围内的吸收强度，可以得到定量信息。
高效液相色谱可以应用于各种分析问题。
例如，在药物研发和质量控制中，HPLC可以用于判断药物纯度、测定活性成分浓度等。
在环境分析方面，HPLC可以用于检测水中的有机物、重金属离子等污染物。
在食品安全和质量监控中，HPLC 可以用于检测食品中的添加剂、农药残留物、重金属等有害物质。
在生物医学研究中，HPLC可以用于分离和定量分析生物样品中的代谢产物、蛋白质、核酸等。
为了实现高效的色谱分离和定量分析，HPLC方法的优化是至关重要的。
首先，需要选择合适的固定相材料、柱尺寸和填充方式等。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的仪器分析方法，广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域。
本文将介绍HPLC的原理、仪器组成、操作步骤以及应用领域。
HPLC的原理是利用样品在液态流动条件下在固定相上的分配行为进行分离和定量分析。
相比于传统的色谱法，HPLC具有操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点。
HPLC的仪器组成主要包括溶液配制系统、进样系统、柱温控制系统、分离柱、检测器和数据处理系统。
其中，溶液配制系统主要用于调配流动相，进样系统用于将样品注入分离柱，柱温控制系统用于控制柱温度，分离柱用于实现样品的分离，检测器用于检测样品，数据处理系统用于处理和分析检测结果。
HPLC的操作步骤如下：1.首先，需要根据需要选择合适的固定相和流动相，然后将固定相充填到分离柱中。
2.将样品溶解于合适的溶剂中，并按照一定的稀释比例稀释溶液。
3.将稀释后的溶液注入进样器中。
4.打开柱温控制系统，设置合适的柱温。
柱温的选择应考虑到样品的性质以及分离柱的要求。
5.打开溶液配制系统，调配合适的流动相，并将流动相以一定的流速通过分离柱。
6.启动检测器，并设置适当的检测波长和灵敏度，以便对样品进行检测。
7.数据处理系统会自动记录检测结果，并进行相应的数据处理和分析。
HPLC广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域，常见的应用包括药物分析、环境污染物检测、食品成分分析等。
例如，可以利用HPLC对药物中的成分进行分离并进行定量分析，以保证药物的质量和疗效。
在环境科学中，HPLC可以用于检测空气、水体和土壤中的有机污染物。
在食品科学中，HPLC可以用于检测食品中的残留农药、添加剂和重金属等。
总之，HPLC是一种常用的高效仪器分析方法，通过流动相在固定相上的分配行为实现样品的分离和定量分析。
由于其操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点，成为化学、药学、环境科学、食品科学等领域中不可或缺的分析工具。
高效液相色谱分析HPLC
高效液相色谱
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第7讲
高效液相色谱
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§3-4 液相色谱法固定相
色谱柱是色谱法的心脏，固定相及装柱技术是关键。 一、液-液色谱法及离子对色谱法固定相 1.全多孔型担体：直径小于10µm（75/-4） 2.表面多孔型担体，目前不用。 3.化学键合固定相（P76及P69） a.成相：用化学的方法通过化学键把有机分子结合 到担体表面。常用18碳柱 b.特点76/-5：4点. 4.分离机制77/2：既不是全部吸附过程，亦不是典型 的液-液分配过程，而是双重机制兼而有之，只是 按键合量的多少而各有侧重.
第7讲
高效液相色谱
第16页
离子对色谱分离过程示意图
第7讲
高效液相色谱
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五、离子色谱法 1.固定相:离子交换树脂 流动相:电解质溶液 检测器:电导检测器 主配件：抑制柱 2. 流程图：fig3-2 3.分离机制 （阴离子为例） a.双柱型：化学抑制型离子色谱法； b.单柱型：非抑制型，用低电导的洗脱液； 4.应用：从无机和有机阴离子到金属阳离子，从 有机阳离子到糖类、氨基酸等均可用该法分析.
高效液相色谱
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第三章
高效液相色谱分析（HPLC）
§3-1高效液相色谱的特点 一、定义：液相色谱法是指流动相为液体的色谱 技术。 二、特点 1.高压: 可达150～350×105 Pa 2.高速: 例，分离20种氨基酸，经典色谱法要20 多小时，用HPLC只需1小时。 3.高效：3万塔板/米（GC2000塔板/米） 4.高灵敏度： 紫外检测器10-9 g 荧光检测器10-11g
高效液相色谱
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第7讲
高效液相色谱
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高效液相色谱技术分析
高效液相色谱技术分析一、概述高效液相色谱技术是目前分析化学中非常重要的一种分离、检测方法，其应用范围广泛，可以用于药物研究、食品安全、环境污染、生物化学等多个领域。
本文将对高效液相色谱技术进行详细解析，包括其基本原理、仪器设备、应用实例等方面的内容。
二、高效液相色谱技术的基本原理高效液相色谱技术本质上是一种液相色谱技术，其最大的特点是加入了固定化液相。
在传统的液相色谱技术中，液相是直接涂覆在固定相上的，但在高效液相色谱技术中，为了提高色谱分析的效率，常常采用小粒径、高孔径的固相材料作为载体，然后用一定的方法将液相固定在上面。
这种固相材料具有很好的化学稳定性、较大的表面积，可以大大提高分离的精度和速度。
高效液相色谱技术的基本原理是：将样品（物质混合物）经过预处理后，加入到经过固定化液相的柱子中，然后进行溶剂梯度洗脱。
不同成分会根据吸附力、分配系数等量而移动到固相柱某个位置处，从而完成分离和检测的过程。
三、高效液相色谱技术的主要仪器设备1. 高效液相色谱柱高效液相色谱柱是高效液相色谱仪的核心器件，其主要作用是分离洗脱样品中的组分。
市面上常见的柱子材料主要有C18、C8、C4等不同类型，根据分析需要选择不同类型的柱子可以获得更好的分离效果。
同时，考虑柱子长度、直径等因素也是仪器的主要参数。
2. 色谱系统高效液相色谱系统由进样器、泵、检测器、色谱柱等多个部分组成，其中，泵的作用是将流动相压力输送到柱子中，进样器用于自动或手动进样，检测器用于检测分离的组分及其浓度。
同时，为了避免进样到色谱柱之前的样品混合和体积效应，需加滤器、混合器等附件。
3. 检测器高效液相色谱检测器常见的有UV-Vis分光光度计、荧光检测器、光散射检测器等多种类型，这些检测器可以用于分析化学、生物化学等领域。
四、高效液相色谱技术的应用实例1. 分析药物高效液相色谱技术可以用于药物分析，如对丙磺舒钠等药物分析可采用该技术，可获得极好的分离效果和灵敏度。
分析化学高效液相色谱法
分析化学高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种分离和测定化学物质的重要分析方法，具有高分离效率、高灵敏度、宽线性范围和广泛的应用范围等优点。
下面将从仪器原理、工作原理和应用等方面对HPLC进行详细分析。
一、仪器原理：HPLC仪器主要由溶剂系统、进样器、柱温箱、液相分离柱、检测器和数据处理系统等组成。
1.溶剂系统：通常采用双头柱泵供应稳定的流动相。
溶剂通过比例调节阀混合形成所需的溶剂混合物。
2.进样器：它将少量的样品溶液注入到流动相中，通常使用自动进样器进行样品进样。
3.柱温箱：控制流动相的温度，以提高分离的效果。
柱温一般在室温到高温之间进行控制。
4.液相分离柱：是HPLC的核心部分，其中填充有液相固定相。
根据不同的分析目标和样品性质，可以选择不同类型的液相柱，如反相色谱柱、离子交换柱等。
5.检测器：常见的检测器有紫外-可见光谱检测器（UV-VIS）、荧光检测器、折射率检测器等。
根据不同化学物质的性质和要求，可以选择不同的检测器。
6.数据处理系统：包括记录和处理仪器所得到的信号。
常见的数据处理系统有计算机数据采集系统，可以进行数据的分析和处理，生成相应的色谱图。
二、工作原理：HPLC通过运用固定相与移动相之间的亲疏水性差异来实现化学物质的分离。
样品在液相中与固定相发生相互作用，不同化合物的相互作用程度不同，因此在液相中呈现出不同的流动速度。
根据样品分离的顺序，不同的化合物在一定时间内通过液相分离柱，进而被检测器检测到。
HPLC中的流动相一般由溶剂和缓冲液组成，并通过色谱柱中的固定相将待测试的物质分离开来。
其中，缓冲液（通常称为背后电解质）可以调节流动相的pH值，改变待测试物质的性质，从而影响其分离。
三、应用：HPLC广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全和生化分析等领域。
1.药物分析：HPLC可以用于药物分析中，以检测药物的含量、纯度和杂质成分。
药物的测定可以通过校准曲线来进行分析。
2.环境检测：HPLC可以用于环境监测中，例如水质分析、大气污染物分析等。
高效液相色谱测定含量的方法
高效液相色谱测定含量的方法
高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种广泛用于测定化合物含量的分析技术。
以下是一般的HPLC测定含量的步骤和方法：
1.样品制备：根据分析的目的，准备含有目标化合物的样品。
样
品制备可能涉及提取、溶解、过滤等步骤。
2.标准曲线制备：准备一系列已知浓度的标准溶液，用于建立标
准曲线。
标准曲线上的点数通常越多越好，以提高测定的准确
性。
3.HPLC系统设置：设置HPLC系统，包括选择合适的色谱柱、
移动相（流动相）和检测器。
根据样品性质和目标分析物，选
择适当的柱和检测条件。
4.进样：将标准溶液和待测样品注入HPLC系统。
通常使用自动
进样器，以提高精度和重复性。
5.色谱条件优化：通过调整流速、温度等条件，优化色谱分离，
使目标化合物得到良好的分离和峰形。
6.数据采集和分析：使用检测器（如紫外-可见（UV-Vis）检测
器）记录样品在色谱柱中的吸收峰，并使用标准曲线计算目标
化合物的浓度。
7.质量控制：包括在分析中加入质量控制样品，以确保实验的准
确性和可靠性。
8.结果报告：报告目标化合物的浓度，通常以样品中目标化合物
的峰面积或峰高度与标准曲线的关系来表示。
需要注意的是，HPLC分析的方法会因分析的具体目的和分析物的性质而有所不同。
因此，在进行HPLC分析之前，建议参考相关的方法学文献、标准操作程序（SOP）或咨询有经验的分析师。
高效液相色谱法HPLC
VS
报告结果
整理分析数据，撰写分析报告，提供各组 分的浓度、纯度等相关信息，为科研或生 产提供决策依据。
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实验操作步骤
流动相的准备与平衡
根据实验要求配制流动相，通过泵以适宜的流速 通过色谱柱进行平衡。
洗脱与检测
流动相带着样品经过色谱柱洗脱，各个组分依次 流出并进入检测器进行检测。
ABCD
进样
将样品注入进样器，通过压力将样品送入色谱柱 进行分离。
数据处理与结果分析
对检测器输出的信号进行处理，得到各组分的峰 形和峰面积，进行定性和定量分析。
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进样
将样品注入色谱柱。
分离
在流动相的带动下，样品中的 组分在色谱柱中进行分离。
检测
检测器对分离后的组分进行检 测，并记录信号。
数据处理
对采集到的数据进行处理、分 析和存储。
高效液相色谱仪的维护和保养
定期清洗色谱柱
使用适当的溶剂清洗色谱柱， 以去除残留物和杂质。
维护和检查检测器
定期检查检测器的性能和准确 性，确保其正常运行。
数据处理系统
用于采集、处理、分析和存储色谱数据，通常采用色谱工 作站。
高效液相色谱仪的操作流程
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样品准备
将样品进行适当处理，以 便注入色谱柱。
流动相制备
根据实验要求，选择合适 的流动相，并进行过滤和 脱气处理。
系统平衡
在进样之前，确保色谱系 统达到平衡状态，以提高 分离效果。
高效液相色谱仪的操作流程
样品的预处理
分离
对于复杂样品，需要进行分离操 作以去除杂质或提取目标成分。 常用的分离方法包括离心、过滤、
高效液相色谱HPLC简介
3、废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。 这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而ＨＰＬＣ改变的是 流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。
• （二）高效液相色谱的分离过程
•
同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固定相和流动相之间进行的一
高效液相色谱HPLC简介
项目 进样方式 流动相 分离原理 检测器
应用范围
HPLC的特点
高效液相色谱法 样品制成溶液
溶液 吸附、分配、筛析、亲和等
UVD、PDAD、RID等 低、中、高沸点有机化合物
离子型无机化合物 热不稳定化合物 生物活性分子
高效液相色谱HPLC简介
气相色谱法 样品需气化或裂解
惰性气体 吸附和分配 TCD、FID、ECD等
高效液相色谱HPLC简介
紫外吸收检测器有三种类型
固定波长紫外吸收检测器：低压汞灯提供固定254nm或280nm紫外光。 可变多波长检测器：氘灯做光源，光栅分光 光二极管阵列检测器photo－diode－array detector（PDAD，PDA, DAD）： 钨灯和氘灯组合光源，进入检测池的不是单色光，而是一段紫外波长上的光。 PDA 可以辅助定性。
高效液相色谱（HPLC效液相色谱(HPLC)？
• HPLC (High Performance Liquid Chromatography ) —高效液相色谱 法
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是目前广泛应用于仪器分析领域的一种重要分析方法。
它通过利用柱子中流动的流动相和样品的物理化学性质的相互作用，使样品组分在柱子中发生分离，再通过检测器对各组分进行定量或定性分析。
仪器分析高效液相色谱法主要由流动相供给系统、进样器、柱子、检测器和数据处理系统等组成。
流动相供给系统通过恒压或恒流的方式将流动相送入进样器中，进样器将样品注入柱子中，柱子根据物理化学性质的差异，使不同组分发生分离，之后检测器检测进入检测器的各组分的浓度，并通过数据处理系统对数据进行分析和整理。
高效液相色谱法具有分离效率高、分离时间短、适用范围广等特点。
与传统的液相色谱法相比，高效液相色谱法的流动相的流速更高，柱子填充物颗粒更小，从而大大提高了分离效率。
同时，高效液相色谱法对样品的需求量较小，具有较好的分析灵敏度。
因此，高效液相色谱法被广泛应用于生物、环境、食品、药物、化工等领域的组分分析和质量控制。
在生物领域中，高效液相色谱法常用于生物样品中代谢产物和药物的分析。
通过绑定柱子、手性柱子以及使用不同的检测器，可以对复杂的生物样品中的不同组分进行准确的分析和定量测试。
例如，对尿液中的代谢产物进行分析可以帮助人们了解人体健康状态，对药物的残留物进行分析可以保证食品和水的安全等。
在环境领域中，高效液相色谱法常用于水质、大气和土壤等环境样品中有机污染物的分析。
通过连接各种不同相的柱子，可以对复杂的环境样品中的有机污染物进行有效的分离，使用紫外-可见光检测器或质谱检测器可以对分离后的各组分进行检测和定量。
在食品领域中，高效液相色谱法常用于食品中添加剂、农药残留物和食品中的有害物质的分析。
通过选择合适的柱子和检测器，可以对复杂的食品样品进行分离和检测，以保证食品的安全性和质量。
在药物领域中，高效液相色谱法常用于药品中活性成分和杂质的分析。
仪器分析—高效液相色谱法
仪器分析—高效液相色谱法高效液相色谱（HPLC）是一种分离和定量化学物质的分析技术。
它广泛应用于生物医药、食品安全、环境监测等领域。
HPLC的原理基于样品在流动相中的分配行为，通过调节流动相成分和流速，实现对样品中化合物的分离和定量。
HPLC的特点之一是分离效率高。
其分析柱内有高效填料，通常是细小颗粒的吸附剂，能够提供大的表面积，有效地增加了分析柱与流动相接触的面积，从而提高了分离能力。
此外，在HPLC中还可以根据需要选择适当的流动相，调节柱温和压力等条件，进一步优化分析条件，提高分离效果。
其次，HPLC的灵敏度高。
在HPLC中，使用的检测器通常有紫外-可见光谱法、荧光法、质谱法等。
这些检测器可以实现对特定化合物的高选择性检测，而且还能够对不同化合物进行同时检测。
对于低浓度的化合物，可以通过选择合适的检测器和优化分析条件，提高检测灵敏度，使得即使在样品中含量很低的化合物也能够被准确地检测到。
此外，HPLC在分析速度和样品处理方面也比较快捷。
与传统的柱色谱技术相比，HPLC使用的高压泵可以提高流动相的速度，从而缩短分析时间。
对于样品预处理方面，使用HPLC时只需要进行简单的处理，如溶解样品并过滤，就可以直接进入分析阶段。
这使得HPLC具有高通量分析的优势，能够在短时间内快速分析大量样品。
此外，HPLC还可与其他技术结合应用。
例如，HPLC-质谱联用技术可以实现对样品中化合物的分离和结构的同时鉴定，具有非常高的分析灵敏度和选择性。
HPLC还可以与色谱预处理、液相萃取和样品前处理等技术结合，提高样品的净化效果和检测灵敏度。
综上所述，HPLC是一种高效、灵敏和多功能的分析技术，被广泛应用于各个科学领域。
它的分离效率高，灵敏度高，分析速度快，样品处理简便，可以与其他技术结合使用，提高分析的效果和可靠性。
在今后的科学研究和实际应用中，HPLC将继续发挥重要的作用。
第十四章 液相色谱法-final
按规定，用HPLC建立分析方法时，需进行“系统适用性
试验”，给出分析状态下最小理论板数、分离度、重复性
和拖尾因子(对称因子)。分析样品时，需检验柱性能是否
合乎要求，可见评价柱效的重要意义。 评价的推荐条件：流动相流量1mL/min，进样量10μL，检 定波长254nm，其它参见下表。
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色谱柱的柱效评价
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示差折光检测器
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d. 荧光检测器 （fluorescence detector）
高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、 黄曲霉素、卟啉类化合物、 农药、药物、氨基酸、甾类 化合物等有响应；
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电化学检测器
基于电化学原理和物质的电化学性质进行检测，主要有安 培、极谱及电导等几种类型，适用于测定具有电化学氧化还原 性质及电导的化合物，如含硝基、氨基等有机化合物及无机阴、 阳离子等。
11
外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定 的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。 内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的 溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。
12
各组分k相差较大，k大的峰宽矮， 分析时间长
溶解能力较强的B，各组分 很快被洗脱下来，但k小的 得不到分离
7
高效液相色谱与气相色谱比较
气相色谱 只能分析挥发性物质，只能 分析20%的化合物 不能分析热不稳定物质 用毛细管色谱可得到很高的 柱效 有很灵敏的检测器如ECD和 较灵敏的通用检测器(FID和 TCD) 流动相为气体，无毒，易于 处理 运行和操作容易 仪器制造难度较小 高效液相色谱
几乎可以分析各种物质
梯度洗脱使各组分在适宜k下全部流出，峰形好时间短
等度洗脱与梯度洗脱
第7章高效液相色谱分析法
第7章高效液相色谱分析法高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和分析技术。
它的分离原理是利用样品中不同组分在固定填料（站相）上的分配行为，通过流动相（流动相）的推动，使不同组分在填料上快速分离。
HPLC由于其灵敏度高、分析速度快、分辨率高等优点，广泛应用于药物分析、环境监测等领域。
高效液相色谱分析法的基本步骤包括：样品制备、进样、色谱分离、检测和数据处理。
样品制备是将需要分析的样品处理成可溶解于溶剂体系中的形式，通常需要提取、过滤等步骤。
进样是将样品注入色谱柱中，常用的进样方式有定量进样和体积进样。
色谱分离是指样品组分在填料中的分离过程，选择合适的填料和流动相可以实现对目标物的有效分离。
检测是通过检测器对样品在色谱柱中的分离情况进行监测，常用的检测器有紫外检测器、荧光检测器等。
数据处理是将得到的检测结果进行定量分析和报告生成。
高效液相色谱分析法具有如下特点：1.分离效率高：由于HPLC使用的填料颗粒细小，色谱柱长度较长，使得分离能力显著提高，可以同时分离多个组分。
2.灵敏度高：HPLC配备了多种灵敏度高的检测器，如紫外检测器、荧光检测器等，可以对很低浓度的组分进行检测。
3.分析速度快：HPLC的柱径较小，填料颗粒细小，流动相的流速较大，使分离速度更快。
可以在短时间内完成大量分析。
4.具有选择性：可以根据目标物的化学性质选择不同的填料和流动相，从而实现对不同化合物的选择性分离。
5.自动化程度高：HPLC仪器配有自动控制系统和数据采集系统，可以实现样品进样、数据处理等自动化操作，提高了实验效率和准确性。
高效液相色谱分析法在实际应用中具有广泛的应用。
比如在药物分析方面，HPLC可以用于药物质量控制、药物代谢动力学研究等。
在环境监测方面，HPLC可以用于有机污染物的检测和分析。
在食品安全方面，HPLC可以用于检测食品中的残留农药、添加剂等。
高效液相色谱法测定
高效液相色谱法测定
高效液相色谱技术是现代分析检测的重要技术之一，在精确检测、毒理学研究、药物筛选等领域发挥着不可替代的作用。
本文对高效液相色谱技术进行了较为详细的介绍。
高效液相色谱技术（high performance liquid chromatography，简称HPLC）是一种物理化学分离技术，它可以将曲线性或非线性的有机及无机物质以及混合物进行分离。
它主要由一个采样泵、柱状体、温控器以及检测器等组成。
将采样物料通过泵注入导入柱状体，在不同的流速和温度条件下通过各种分离机理的作用及有机阳离子交换分离出组分物质，最后再通过检测器检测并量化比较分离出的物质。
高效液相色谱技术具有较高的分离效率、测定灵敏度，并且使用简单方便，实
用价值很高。
它常用于缺质分析、新药、制药中添加剂的测定等，在药学研究中，运用十分广泛，可用于各种有机物的分离及测定，如药效成分的研究与质量控制，比如，止咳糖浆中的止咳成分及添加剂的测定；山楂糖浆中的有效成分及添加剂的研判等等。
此外，它还被用于分析和研究乳剂、谷物和稻米及饲料中的有机物；用于检测及分析石油、油农副产品和石化产品中各种有机物；用于分离、分析油，水和气中的有机污染物；以及用于检测和分析水中有机物，如腐殖酸等等。
综上，高效液相色谱技术的应用不仅拓宽了我们的实验研究范围，而且使精密
检测变得更加易于实现，对于未来的化学研究具有十分重要的作用。
高效液相色谱分析法
e. 电导检测器p89 （electrical conductivity detector）
原理：根据物质在某些介质中电离后产生电导变化来 测定电离物质的含量。 特点：广泛用于离子色谱仪中。应用于能电 离成离子物质的检测。响应受温度影响较大。
结构：由一对平行的铂电极（表面镀铂黑以增加表面积） 和池体构成电导检测池，两电极构成电桥的一个测量臂。
2021/8/5
(5) 液相色谱检测器p84-90
a. 紫外检测器(ultraviolet photometric detector)
原理：朗伯比尔定律。
优点：应用最广，对大部分有机化合物有响应，灵敏度
高，线性范围宽。是高效液相色谱仪的标准配置。它的最重
要特征是对流动相的流速（脉冲）和温度变化不敏感，可用
的比例抽入高压泵中 混合。
2021/8/5
(3) 进样装置p83
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：
2021/8/5
(4) 高效分离柱p84
柱体为直型不锈钢管，标准内径4.6或3.9 mm，柱长 15～30 cm，填料颗粒粒度5－10μm,柱效7000-10000。发展 趋势是减小填料粒度(3－5μm)和柱径以提高柱效。
紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
2021/8/5
2021/8/5
光电二极管阵列检测器
2021/8/5
c. 示差折光检测器 p87（differential refractive index detector）
结束
2021/8/5
右图是各种HPLC方法的应用 范围及对象
高效液相色谱技术的原理和分析方法
高效液相色谱技术的原理和分析方法高效液相色谱(HPLC)技术是一种广泛应用于化学、生物、环境等领域的分析方法，它以其高效、灵敏、准确的特点被广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全等领域。
本文将介绍高效液相色谱技术的原理和分析方法，并对其在不同领域的应用进行探讨。
高效液相色谱技术是基于溶液中成分在固定相(常为填充在柱中的颗粒状材料)和流动相共同作用下的分离原理。
在HPLC中，流动相(溶剂)通过高压泵送到色谱柱中，样品溶解于流动相中，通过在固定相上的分配和吸附作用，实现目标物质的分离。
与传统色谱技术相比，HPLC表现出更高的分离效率和灵敏度。
在HPLC中，选择合适的固定相是至关重要的。
常用的固定相有反相色谱柱、离子交换色谱柱等。
反相色谱柱常用于非极性、中极性物质的分离，离子交换色谱柱则常用于带电物质的分离。
根据目标物质的特性和要求，选择合适的固定相能够提高分离效果和分析速度。
在高效液相色谱中，样品的检测通常通过紫外-可见光谱仪进行。
紫外-可见光谱仪通过测量样品在特定波长下的吸光度来获得样品的浓度信息。
除了紫外-可见光谱，还可以使用荧光检测器和质谱检测器等进行检测。
在实际应用中，高效液相色谱常常与其他分离技术结合使用，以提高检测的准确性和灵敏度。
例如，将色谱柱与质谱联用可以更准确地确定目标物质的结构和分子量。
此外，还可以将预处理技术与HPLC联用，例如对样品进行前处理、固相萃取等，以提高样品的净化效果和分析效率。
高效液相色谱技术在不同领域有着广泛的应用。
在药物分析领域，HPLC常常用于制药过程中的质量控制和药物代谢研究。
在环境监测领域，HPLC被用于分析环境中的有机污染物、重金属等。
在食品安全领域，HPLC可以用于检测食品中的添加剂、农药残留等。
总之，高效液相色谱技术因其高效、灵敏、准确的特点，在化学、生物、环境等领域得到了广泛应用。
通过选择合适的固定相、检测方法以及与其他分析技术的结合，可以更好地实现对目标物质的分离和定量分析。
高效液相色谱结果分析第二讲
三.液相色谱图名词术语(5)
谱带扩展(Band Broadening): 由于纵向扩散,传质阻 力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽 度增加的现象.
三.液相色谱图名词术语(6)
拖尾峰(Tailing Peak): 后沿较前沿平缓的不对称峰. 前伸峰(Leading Peak): 前沿较后沿平缓的不对称峰. 鬼峰(Ghost Peak): 并非由试样所产生的峰,亦称假峰.
半峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰高的中点 作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间 的距离 .
峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值.
切线 半峰宽 切线峰宽
响应值
峰面积
色谱峰的判断 (最小面积)
时间
三.液相色谱图名词术语(3)
Excellent t = 1.0 - 1.05
Acceptable t = 1.2
Unacceptable t=2
Awful t=4
正常
前伸
三.液相色谱图名词术语(7)
基线(Baseline): 在正常操作条件下,仅由流动相所产生 的响应信号.
基线噪声(Baseline Noise): 由各种因素所引起的基线 波动.
7.专属性(specificity,或称选择性）
指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在的情 况下，采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映 该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力， 是用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量.
8. 线性（Linearity）
在设计范围内，测试结果与试样中被测物浓度呈正比关 系的程度。
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高沸点、热不稳定的有机及生化试样的高效分离分 析方法。
影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
高效液相色谱法的基本概念及理论基础, 如保留值、分配系数、分配比、分离度、塔 板理论、速率理论等与气相色谱法是一致的。 而两者的主要区别可归结于流动相的不同。
高效液相色谱的流动相为液体,而气相色 谱的流动相为气体。
充时， Cm降低。
dp为固定相粒度；
Dm是试样分子在流动相中的扩散系数。
b. 滞留的流动项中的传质阻力项 Hsm
Hsm
Cs
md
2 p
Dm
式中Csm是一与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及 容量因子有关的常数。
高效液相色谱中的速率方程式为:
H 2dpC dD m(C s D d sf2C m D d m p2C sD m d m p2)
式中:
Hs
Csd f 2 Ds
Cs是与容量因子有关的常数； Ds是试样分子在固定液内的扩散系数；
df是固定液膜的厚度。
（2）流动相传质阻力 a. 流动的流动项中的传质阻力项
Hm
Hm
Cmd p2 Dm
式中: Cm是一个与容量因子有关的常数,其值取决于柱直 径、形状和填充的填料结构。当柱填料规则排列并紧密填
反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有 对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入 流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。
五、 离子色谱
离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一种技术,其 与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容 量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电 导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。
四、 离子对色谱
原理:将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（ 对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏 水性离子对化合物,使其能够在两相之间进行分配；
阴离子分离:常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢 氧化十六烷基三甲铵作为对离子；
阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对 离子；
简写为: H A B C
与气相色谱的速率方程式一致,其主要区别 在于纵向(分子)扩散项可以忽略不计，影响柱 效的主要因素是传质项。
GC的H-u曲线是一条抛物线,有一个最低点（最佳流速）； HPLC的H-u曲线是一条斜率不大的直线，这表示分子扩散项 对H基本上没有影响，这也说明HPLC分离可以在高的流动相 流速下而不至于使柱效损失太多，从而可以实现快速分离。
二、 液-固吸附色谱
固定相:为固体吸附剂,如硅胶、氧化铝等，较常使用的 是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相:各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能 团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
• 由速率方程,降低固定相粒度可提高柱效。
H
d
2 p
• 液相色谱中,不可能通过增加柱温来改善传质。
• 改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。
2.流速
流 速 大 于 0.5 cm/s 时 , H～u曲线是一段斜率不大的 直线。降低流速,柱效提高不
是很大。
3.固定相及分离柱
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱,其选用 原则与气相色谱一样。
但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非 常高的工作，一般很少自行制备。
HPLC的主要类型及其分离原理
一、 液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理:组分在固定相和流动相间的分配； 流动相:对于亲水性固定液,采用疏水性流动相，即流动 相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之， 流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正 相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合 到硅胶（担体）表面的游离羟基上。 C-18柱（反相柱）。
液体的扩散系数只有气体的万分之一至十万分之一； 液体的粘度比气体大一百倍,而密度为气体的一千倍。这些 差别将对色谱过程产生影响。
高效液相色谱中的速率方程式
1. 涡流扩散项He
与气相色谱相同。
He 2dp
2 . 纵向（分子）扩散项 Hd
Hd
Cd Dm
式中:Cd为一常数；Dm为分子在流动相中的扩散系数。
讨论——影响分离的因素与提高柱效的途径
在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一, 则速率方程中的分子扩散项B/u较小，可以忽略不计，即:
H=A+Cቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同。
液体的粘度比气体大一百倍,密度为气体的一千倍，故降低传 质阻力是提高柱效主要途径。
1. 固定相粒度
由于分子在液体中的扩散系数比气体中小4~5个数量级, 因此在液相色谱中，当流动相的线速度大于0.5 cm/s时，纵 向扩散项对色谱峰的扩展的影响可以忽略。而气相色谱中这 一项却是重要的。
3. 传质阻力项
（1）固定相传质阻力:发生在液-液分配色谱中。
固定相传质:试样分子从流动相进入到固定液内 进行质量交换的传质过程
HPLC的特点
一、概述
高效液相色谱法是继气相色谱之后,70年代初 期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。
高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱 的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典 液相色谱没有本质的区别。
不同点仅是现代液相色谱比经典液相色
谱有较高的效率 和实现了自动化 操作。
二、高效液相色谱法的特点
三、 离子交换色谱
固定相:阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相:阴离子离子交换树脂作固定相,采用酸性水溶液 ；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生反复的离子交换反应； 组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存 在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。