人sCR1克隆、真核和原核表达纯化及其多克隆抗体制备
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备方法多克隆抗体是由多个不同的免疫细胞（多克隆）产生的抗体混合物，可以识别并结合到目标生物标志物上。
多克隆抗体在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的应用价值。
制备多克隆抗体需要经过一系列复杂的实验流程，下面将详细介绍多克隆抗体的制备方法。
一、抗原的选择在制备多克隆抗体时，首先需要选择一个合适的抗原。
抗原通常是目标生物标志物的蛋白质或多肽片段。
选择抗原的关键因素包括其表达水平、稳定性和纯度。
抗原的选择直接影响到最终多克隆抗体的亲和力和特异性。
二、免疫小动物免疫小动物通常是用于制备多克隆抗体的主要实验动物，例如小鼠、兔子、大鼠等。
在免疫前需要确保小动物健康，并对其进行相应的预处理，如注射驱虫药物、进行适当的接种。
还需要根据具体实验要求决定预免疫、免疫计划以及免疫方案的制定。
三、免疫过程免疫过程是制备多克隆抗体的核心环节。
首先需将抗原与适当的佐剂混合，增强免疫原性，然后用于免疫小动物。
在免疫过程中需要控制免疫剂量和免疫间隔时间，以及监测动物的免疫应答情况。
免疫后还需要定期采集血清样本，监测抗体滴度的动态变化。
四、细胞融合与筛选经过一段时间的免疫后，需要从免疫动物的脾脏或骨髓中收集免疫细胞，然后与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
随后采用限稀稀释法将杂交瘤细胞进行单克隆化分，筛选出高亲和力的多克隆抗体细胞株。
五、生产与纯化经过筛选的多克隆抗体细胞株需要进行扩大培养，生产足够数量的多克隆抗体。
之后通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等手段，从细胞培养上清液中纯化出多克隆抗体。
六、性质鉴定与应用纯化后的多克隆抗体需进行性质鉴定，包括亲和力、特异性、稳定性等方面的测试。
最后经过滤菌毒处理后，多克隆抗体可应用于科学研究、临床诊断、生物药物研发等领域。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，需要科学合理地选择抗原、合理设计免疫方案、熟练掌握细胞融合和筛选技术，以及对多克隆抗体进行严格的生产和性质鉴定。
蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法参考
蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法参考一、蛋白的原核表达实验目的蛋白的原核质粒的构建。
适用范围蛋白原核表达。
实验原理参考实验室工具书《分子克隆实验指南》《抗体制备与使用实验指南》实验试剂病毒RNA的提取（Trizol法）相关试剂，反转录相关试剂（M-MLV Buffer、10M dNTPs、DEPC水、随机引物、RNA酶抑制剂、反转录酶M-MLV），GenStar高保真酶，T4连接酶，菌液PCR相关试剂，Western blot试剂盒实验设备和材料DH5a感受态细胞、BL21感受态细胞操作步骤（一）病毒RNA的提取（Trizol法）参照分子克隆的方法进行，（1）将250 μL液体样品加入1.5 mL Ep 管中，再加入750 μL冰预冷的TRIZOL。
（2）将样品剧烈混合后，在室温静置5 min。
（3）加入200 μL氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和，使液体充分混匀呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置5 min。
（4）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min。
（5）将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇并上下颠倒混匀，然后在室温静置至少 10min。
（6）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min 后，小心并尽可能地去除全部上清液。
（7）用1 mL 75% DEPC 乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁，4℃ 12000×g离心5 min后小心弃去乙醇。
（8）将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用 10μL 无 DEPC 水（无RNA酶的水）将RNA溶解并于-20℃保存。
（二）反转录反应体系（20 μL）：按下列顺序加样M-MLV Buffer 4 μL10M dNTPs 1 μLDEPC 水 3 μL随机引物 1 μL RNA酶抑制剂 0.5 μL反转录酶 M-MLV 1 μL提取的 RNA 9.5 μL总体积20 μL反应条件：42℃水浴 1~1.5 h（三）引物设计与合成依据新城疫毒株全基因序列，运用Oligo或者Primer Premier5.0软件设计上下游引物，设计引物是注意选择常用的酶切位点以及保护性碱基的添加引物使用前用灭菌超纯水配成相应浓度，-20℃保存备用。
基因片段Myo5a原核表达、纯化及多克隆抗体制备
基因片段Myo5a原核表达、纯化及多克隆抗体制备①游荷花唐锐敏②（山西医科大学汾阳学院免疫学与免疫学检验教研室，汾阳 032200）中图分类号R730.2 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2023）10-2227-05［摘要］目的：制备了PGEX-4T-3/Myo5a原核表达载体，并表达与纯化融合蛋白，制备其多克隆抗体。
方法：通过PCR 扩增Myo5a末端一个基因小片段，Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后，连接到原核载体pGEX-4T-3，制备原核表达载体PGEX-4T-3/Myo5a。
鉴定后，在BL21菌中诱导表达蛋白并对重组蛋白进行纯化，重组蛋白PGEX-4T-3/Myo5a采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹进行鉴定。
采用融合蛋白免疫家兔，制备其抗血清，测定抗血清效价和特异性。
结果：经鉴定后原核表达载体PGEX-4T-3/Myo5a制备成功，表达的重组蛋白相对分子量约为30 kD。
免疫家兔后抗血清滴度为1∶128 000，免疫印迹和间接免疫荧光证明其特异性。
结论：实验成功制备了PGEX-4T-3/Myo5a原核表达载体，融合蛋白具备了较高的免疫反应性，并得到了其多克隆抗体，为进一步探讨Myo5a的生物学意义做了铺垫。
［关键词］PGEX-4T-3/Myo5a；原核表达；蛋白表达与纯化；多克隆抗体Prokaryotic expression of Myo5a gene fragment， purification and preparation of polyclonal antibodyYOU Hehua， TANG Ruimin. Department of Immunology and Laboratory Immunology， Fenyang College of Shanxi Medical University， Fenyang 032200， China［Abstract］Objective：The prokaryotic expression vector pGEX-4T-3 /Myo5a was prepared， the fusion protein was expressed and purified， and polyclonal antibody was prepared. Methods：One small fragment of Myo5a was amplified by PCR. After Bam HⅠ and XhoⅠdouble digestion， the fragments were inserted into prokaryotic expression vector pGEX-4T-3 to construct one prokaryotic expression vectors pGEX-4T-3/Myo5a. After correct identification，BL21 prokaryotic expression bacteria were transferred to IPTG induction. The recombinant protein pGEX-4T-3/Myo5a was purified and the recombinant protein was identified by SDS-PAGE electro‑phoresis and Western blot. The rabbit was immunized with fusion protein， whose antiserum was prepared and its titer and specificity were determined. Results：After identification， the prokaryotic expression vector pGEX-4T-3/Myo5a was prepared correctly， and the relative molecular weight of the expressed recombinant protein was about 30 kD. After immunizing rabbits，the antiserum titer was 1∶ 128 000， and the specificity was proved by Western blot and indirect immunofluorescence. Conclusion：The PGEX-4T-3/Myo5a prokaryotic expression vector is successfully prepared， the fusion protein had high immune reactivity， and its polyclonal antibody is obtain， which paved the way for further exploration of the biological significance of Myo5a.［Key words］PGEX-4T-3/Myo5a；Prokaryotic expression；Protein expression and purification；Polyclonal antibodyMyosin是肌球蛋白，又称肌凝蛋白，是真核细胞里的一类ATP依赖型分子马达［1］。
重组人sCR1多克隆抗体制备及纯化鉴定
【 摘 要】 目的 制备原 核表达人 ｓ Ｒ 多克隆抗体并对其进行鉴定 。方法 Ｃ １ 提取人总 Ｒ Ａ进行 Ｒ — Ｎ Ｔ
采
・
论 著・
Ｐ Ｒ扩增合成 ｃ Ｎ 以 ｃ Ｎ Ｃ Ｄ Ａ， Ｄ Ａ为模板 。 构建重组表达质粒 ｐ Ｔ ８—ｓ ＲＩ 在大肠杆菌巾表达人 ｓ Ｒ 融 Ｅ ２ａ Ｃ 。 ＣＩ
ｔｅ ｅ ｎ ｉ ｏ ｙ ｐ ｏ ｅ ｔ ｓ ｈ ｓ ａ ｔ ｄ ｒ ｐ ｒｉ ．Ｍ ｅ ｈ ｄ Ｔ ｅ ｆ ｌ ｌ ｎ ｔ ＤＮＡ ｆ ｈ ｍａ ｓ Ｒ１ ａ ｏ ｔｉ ｅ ｕ ｉｇ Ｔ— ｂ ｅ ｔｏ ｓ ｈ ｕｌ ｅ ｇｈ ｃ ｏ ｕ ｎ Ｃ ｗ ｓ ｂａ ｎ ｄ ｓｎ Ｒ
ｂ Ｓ ｙ ＤＳ－ ＡＧＥ． Ｒｅ ｕ ｔ ｒ ｅ ａｂ ｉ ｏｙ ｌｎ ｌ ｎ ｉｏ ｙ ｇ ｉ ｓ Ｐ ｓｌ ｓ ｈ ｒ ｂ ｔ ｐ ｌｃｏ ａ ａ ｔ ｄ ａ ａ ｎ ｔ ｕ ｎ ＣＲ Ｉ ｆ ｓｏ ｐ ｏ ｅｎ ｏ ｌ ｂ ｈ ｍａ ｓ ｕ ｉｎ ｒ ｔｉ ｃ ｕ ｄ ｓ ｅ ｉ ｃ ｌｙ ｒ ｃ ｇ ｉｅ ｈ ｍａ Ｃ ｆ ｓ ｎ ｐ ｏｉ ．Ｃｏ ｃｕ ｉ ｎ Ｔ ｅ ｈ ｍａ Ｃ ｕ ｉｎ ｐ ｏｅ ｎ ｗ ｓ ｕ ｅ ｐ ｃｆ ａｌ ｅ ｏ ｎｚ ｕ ｎ ｓ ＲＩ ｕ ｉ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ ｎ ｌ ｓ ｈ ｕ ｎ ｓ ＲＩ ｆ ｓｏ ｒ ｔ ｉ ａ ｓ ｄ ｏ
ａ ｈ ｉ ｓ ｔ ｅ ｍｍｕ ｏ ｅ ａ ｔｒ ｕ ｉ ｅ ａ ｄ ｅｏ ｄｎ ，ｗｈｃ ｈ ｓ ｅｔｒ ａ ｔ ｅ ｉｉ ａ ｄ ｍｍｕ ｏ ｅ ｉ ｉ ． ｈ ｎ ｇ ｎ ｆ ｐ ｒ ｄ ｎ ｒ ｆｌ ｉ ｇ ｅ ｉ ｆ ｉｈ ａ ｂ ｔ ｎ ｉ ｎｃ ｔ ｎ ｉ ｅ ｇ ｙ ｎ ｇ ｎ ｃｔ Ｆ ｅ ｙ
多克隆抗体的制备
免疫方法
选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、 免疫次数、免疫间隔等因素。
免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动 物的个体状态和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜 过大，以免产生免疫麻痹。 免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴 结 等，视不同的免疫方案而异。对于不易获取的宝贵抗原可 采用淋巴结免疫法。 免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素，其中首次与第二 次免疫的间隔时间尤为重要，一般以10～20天为佳，二次后 间隔时间一般为7～10天，若间隔时间太长，则刺激减弱， 抗体效价不高。
纯度鉴定： 抗体纯度的鉴定可采用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、 双向扩散试验、免疫电泳等方法。 IgG含有重链和轻链，纯IgG的SDS-PAGE结果应有两条蛋白电泳 带（分子量约53kD和22kD），若出现多条电泳带则表明制备的抗 体混有杂蛋白，需进一步纯化。
结合活性鉴定：测定抗体亲力的方法较多，如平衡透析法、 ELISA或RIA竞争结合试验等。
免疫佐剂
某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增 强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应 答类型，此类物质称为免疫佐剂 (immunoadjuvant)，简称佐剂。
佐剂的种类
佐剂一般包括以下几类： 无机佐剂：如氢氧化铝、明钒等；
生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日 咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰 二肽和细胞因子等；
增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被吞噬细 胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴细胞增生，从而增 强和扩大免疫应答的效应。
动物免疫
免疫动物的选择：
抗原来源与动物种属的关系：抗原的来源与免疫动物种属 差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或 亲缘关系越近，免疫效果越差。
原核表达及抗体的制备
原核表达及抗体的制备实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。
转化缓冲液中的DNA 形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。
42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA 复合物。
将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。
然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。
感受态细胞的制备1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。
2．取50UL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。
以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行：3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。
在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。
注意：1mL的取液器设定在500mL。
悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。
4．将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。
细胞可以立即使用或储存。
5．将感受态细胞迅速转移到-20℃或更低的低温冰中。
注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。
转化：1．新鲜制备的或-20℃下保存的感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。
2．取200UL的感受态细胞，加入适量的重组子，轻轻混匀.3.冰浴30min.4．42℃水浴热激90秒。
5．冰上放置2-5分钟。
6．加400UL LB培养液，37℃振荡培养45分钟。
7．将适量的菌液涂布在Amp/LB（Amp50ug/ml）琼脂平板上。
多克隆抗体的制备
第一节抗原的制备除完整的细胞可作为抗原外，各种不同的细胞内存在的各种分子量不同的物质，也都具有全抗原或半抗原的性质，某种抗原物质可能是某一类细胞所特有的，可作为这种细胞的一个标志。
由于细胞存在着许多性质不同的抗原物质，有时要从这众多的物质中提取、纯化某种抗原物质，以供科学研究之用。
一、抗原的提取抗原的制备是一件十分细致的工作，要制备一个高纯度的抗原，需要付出艰巨的努力，制备工作涉及物理学、化学和生理学等许多领域的知识。
根据物理或化学特性建立起来的分离、纯化方法的主要原理不外乎科二个方面：①利用混合物中几个组分分配率的差别将他们分配到可用机械方法分离的两或几个物相中，如盐析、有机溶剂抽提、层析和结晶等；②把混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同的区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心和超滤等。
由于组织细胞内存着许多分子结构和理化性质不同的抗原物质，其分离方法也不一样，就是同一类大分子物质，因选材不同，所使用的方法也很大差别。
因此很难有一个通用的标准方法供提取任何生物活性物质使用，所以在提取前必须针对所欲提取的物质，充分查阅文献资料，选用合适的方法。
如果要提取一个结构及性质未知的抗原物质，更需要经过各种方法的比较探索，才能找到一些工作规律和获得预期的效果。
抗原物质的制备，大概要经过如下过程：①材料的选择和预处理；②细胞的粉碎（细胞器的分离）。
③提取；④纯化；⑤浓缩或干燥，保存。
现分别简述如下。
（一）材料的选择及预处理选择什么材料主要根据实验目的而定。
通常选含量高、工艺简便、成本低的材料。
材料选定后，通常要进行预处理，剔除结缔组织、脂肪组织等，把组织块剪碎。
若取材后不立即进行提取，则应冷冻保存，动物组织更要深低温保存。
某些容易失活的物质，一般宜采用新鲜材料。
（二）细胞的粉碎除了提取体液、组织间液内的多肽、蛋白质、酶不需粉碎细胞外，凡要提取组织内、细胞膜上及胞内的生物活性物质，都必须把组织和细胞粉碎，使活性物质充分释放到溶液内。
多克隆抗体制备
③初次应答产生的抗体总量较低，维持时间也短，通常以 IgM 为主，且抗体的平均亲和力较低。
精品课件
再次应答(secondary response)
鸡可将大量IgY输送入鸡蛋黄中, 从鸡蛋中收获抗体 可避免采用损伤性的收集手段。
精品课件
免疫剂量
（1）延长抗原释放时间；
•
剂量：免疫（原2）合增适加剂抗原量的的表选面积定；应考虑抗原 性强弱、分（（子34））量佐增大剂强小能辅刺助和激T细免吞胞疫噬的细时作胞用间对；。抗原大的动处物理；
抗原剂量（（以5）蛋刺白激抗致敏原淋为巴准细胞）的约分0裂.和5～浆细1m胞g/
精品课件
鸡
鸡的种系距哺乳动物较远,用以制备抗哺乳动物蛋白 质的抗体具有独特的优点。
鸡的IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物的补体 成分C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物的 Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下,鸡 IgY的稳定性不如家兔IgG,不过,鸡的IgY在鸡蛋内可 保持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏 条件下则可保存数年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和 单价的Fab或Fab′等片段。
机体再次接触相同的抗原时，体内产生抗体 的过程称为再次应答或回忆应答(anamnestic response)，主要特点为： ①潜伏期显著缩短，约为初次应答潜伏期的 一半； ②抗体含量大幅度上升，比初次应答多几倍 到几十倍，而且维持时间长； ③诱发再次应答所需的抗原剂量极小； ④再次应答产生的抗体主要为 IgG，而 IgM 很少，抗体的平均亲和精品课力件 高。如果再次应答
多克隆抗体的制备ppt课件
多克隆抗体的制备
动物免疫
免疫动物的选择：
抗原来源与动物种属的关系：抗原的来源与免疫动物种 属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系 或亲缘关系越近，免疫效果越差。
人工合成佐剂：如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、 双链多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）；油剂：如弗氏完全 佐剂、花生油乳剂等；
纳米佐剂
多克隆抗体的制备
弗氏佐剂（Freund’s adjuvant）
分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种： 前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化剂（羊 毛脂或吐温-80）按1：1～1：5比例混合而成；
选择性沉淀：
选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境， 如：
核酸去除 盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法
多克隆抗体的制备 50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白；
超滤法： 利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小
的抗原物质进行滤筛。 电泳
多克隆抗体的制备
精分离
层析法： 凝胶过滤层析 离子交换层析 亲和层析 疏水层析 反相层析
多克隆抗体的制备及 抗体活性测定
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多克隆抗体的制备
主要内容
• 多克隆抗体制备的基本原理 • 多克隆抗体制备的操作步骤 • 抗体活性的实验原理、操作流程和结果判断
多克隆抗体的制备
原理
1、克隆(clone)： 是指无性繁殖细胞系，由单一个祖先细胞 分裂繁殖而形成的一簇细胞系。在这个家族的所有成员中， 如无发生突变其基因是完全相同的。
多克隆抗体的制备
人sCR1多克隆抗体的制备及鉴定
多克隆抗体制备流程
多克隆抗体制备流程多克隆抗体制备流程有问题？丁香实验库全新大升级，10000+ 实验方法任你选前往丁香实验抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。
一般而言，抗体按靶位点不同主要分为单克隆抗体和多克隆抗体，由多个B淋巴细胞克隆产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可以与多种抗原表位结合的抗体就是多克隆抗体，本篇主要讲述兔源性多克隆抗体制备的相关流程。
抗原有两个基本特性，即抗原性和免疫原性。
有抗原性的物质不一定有免疫原性，所以由此引出半抗原和完全全抗原，半抗原必须经过经过一定的改造（偶联蛋白载体BSA，OVA或者HSA等大分子物质）方能成为完全。
一般而言完全抗原分子量越大（大于10KDa），结构越复杂引起免疫反应的能力也就越强。
抗体就是能与特异性抗原结合的免疫球蛋白，抗体一般分为多克隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体能与抗原的多个表位结合。
本篇主要讲述兔来源的多克隆抗体的生产步骤多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→ 效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。
具体实验步骤如下：1.兔子的准备挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.预采血（作阴性参照用）1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min； h.收集上清，即为血清。
2. 兔子的免疫2.1 注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。
人心肌肌钙蛋白ⅰ单克隆抗体及多克隆抗体的制备
人心肌肌钙蛋白ⅰ单克隆抗体及多
克隆抗体的制备
人心肌肌钙蛋白ⅰ单克隆抗体的制备：
1、蛋白表达：从人类心脏组织中取得肌钙蛋白ⅰ，通过转录和翻译，在表达载体上表达出来。
2、纯化：采用柱色谱纯化技术，将表达蛋白进行纯化，获得蛋白悬液。
3、生物筛选：采用体外表达，在培养基中生成抗原抗体，经过抗原抗体筛选，筛选出与抗原高度亲和的抗体。
4、细胞培养：将筛选出的抗体引入细胞中，在细胞内表达，并进行增殖，以获取抗体株。
5、纯化：采用柱色谱纯化技术，对抗体株进行纯化，获得单克隆抗体。
多克隆抗体的制备：
1、蛋白表达：从人类心脏组织中取得肌钙蛋白ⅰ，通过转录和翻译，在表达载体上表达出来。
2、纯化：采用柱色谱纯化技术，将表达蛋白进行纯化，获得蛋白悬液。
3、抗体组合：将筛选出的单克隆抗体引入细胞中，在细胞内表达，并进行增殖，以获取多克隆抗体株。
4、纯化：采用柱色谱纯化技术，对多克隆抗体株进行纯化，获得多克隆抗体。
重组人sCR1真核表达载体的构建表达及其生物学活性
重组人sCR1真核表达载体的构建、表达及其生物学活性【摘要】目的: 采纳酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体（sCR1）, 研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性。
方式: 从人外周血中提取总RNA, 应用RT PCR取得人sCR1全长cDNA, 然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中, 构建含人sCR1的重组质粒（pPIC9k sCR1）, 经测序鉴定正确, 电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中, 将经G418抗性挑选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定, 经甲醇诱导, 表达产物经SDS PAGE分析和Western blot鉴定, 通过Ni2+NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定。
结果: 取得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k sCR1, 经G418挑选及PCR鉴定取得高拷贝整合的重组酵母细胞株, 经甲醇诱导含pPIC9k sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。
此蛋白在SDS PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带, 在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体（mAb）识别。
经Ni2+NTA agarose亲和层析纯化后取得较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性。
结论: 人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达, 而且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。
【关键词】可溶性补体受体1 毕赤酵母细胞生物学活性真核表达载体补体受体1（complement receptor type l, CR1）又称C3b/C4b 受体, 在人白细胞表面被命名为CD35分子, 是最先定型的补体受体, 也是目前所知最重要的一种补体受体。
Weisman等[1]于1990年第一次研制出缺乏跨膜区和胞内区的可溶性补体受体1（soluble complement receptor type l, sCR1）是CR1细胞外片段。
人抗酶抑制因子-1的原核表达纯化及多克隆抗体的制备
人抗酶抑制因子-1的原核表达纯化及多克隆抗体的制备吕亚丰;杨建林;秦宇;王艳林【摘要】We aim to carry out prokaryotic expression and purification of human antizyme inhibition factor-1(AZIN1),and to prepare as well as identify polyclonal antibody against AZIN1. Prokaryotic expression vector pET-28a/AZIN1 was transformed into Escherichia coli BL21(DE3),in which the recombinant AZIN1 was expressed by IPTG induction and purified by affinity chromatography with Ni-NTA resin under denaturing condition. The purified recombinant AZIN1 was used as the antigen to prepare the antibody in the BALB/c mice. The titer and specificity of anti-sera were detected by ELISA,Western blot,cell immunofluorescence,and immunochemistry. As results,restriction analysis and DNA sequencing proved that the plasmid pET-28a/AZIN1 was constructed successfully. In E. coli,recombinant AZIN1 protein was expressed by IPTG induction and mainly existed in a form of inclusion body. The AZIN1 protein expressed in the E. coli was effectively purified using affinity chromatography. When used as the antigen to immune mice,this protein induced the production of specific antibody against AZIN1 with serum titer of 1640000. The prepared antiserum specifically recognized and bound to the AZIN1 protein expressed in human or mouse tumor cells. And this antiserum was efficiently used in the analysis for AZIN1 by Western blot,cell immunofluorescence, and cell immunochemistry. In conclusion,the prokaryotic expression and purification of human AZIN1 protein andpreparation of polyclonal antibody against AZIN1 were successfully performed in this study. These results provide a basis for further research on the roles of AZIN1 in regulating cell proliferation and in disease prevention and treatment.%原核表达纯化人抗酶抑制因子-1((antizyme inhibition factor-1,AZIN1),制备并鉴定抗AZIN1多克隆抗体.pET-28a/AZIN1表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG诱导蛋白表达,利用Ni-NTA树脂于变性条件下亲和层析纯化人AZIN1蛋白.将重组AZIN1蛋白用作抗原免疫BALB/c小鼠以制备多克隆抗体,ELISA检测抗AZIN1抗体效价,Western bloting、细胞免疫荧光、细胞免疫化学方法检测抗体的应用.结果显示,重组pET-28a/AZIN1表达质粒经酶切及测序鉴定构建正确.细菌内重组AZIN1蛋白可被IPTG诱导表达并以包涵体的形式存在.用亲和层析法能有效纯化原核表达的AZIN1蛋白,该蛋白在小鼠体内能够诱导抗AZIN1特异性抗体产生,血清效价达到1640000.制备抗体能够特异性识别和结合人及小鼠瘤细胞中表达的AZIN1蛋白,并可有效用于AZIN1的Western blotting、细胞免疫荧光和细胞免疫化学分析.成功原核表达和纯化了人AZIN1蛋白并制备了抗AZIN1多克隆抗体,为深入研究AZIN1在调控细胞增殖及在疾病防治中的作用提供了研究基础.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2017(033)003【总页数】6页(P193-198)【关键词】抗酶抑制因子;原核表达;抗体【作者】吕亚丰;杨建林;秦宇;王艳林【作者单位】三峡大学医学院肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室,宜昌443002;三峡大学医学院肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室,宜昌 443002;三峡大学医学院肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室,宜昌 443002;三峡大学医学院肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室,宜昌 443002【正文语种】中文多胺（腐胺、精脒和精胺）是一类带正电荷的烷基类小分子化合物，广泛存在于真核细胞并参与细胞的增值、分化及凋亡等重要的生理过程，其在细胞内的合成、分解及摄取受到严密的调控以维持体内的多胺代谢稳衡［1，2］。
兔抗人sCR1抗体制备及临床初步应用
兔抗人sCR1抗体制备及临床初步应用王广兰;刘亚利;初霞;张长远;宫璀璀;王文丽;高天蓝星【摘要】目的原核表达人sCR1分子胞外区,制备多克隆抗体,建立双抗体夹心ELISA法.方法提取人总RNA进行RT-PCR扩增合成cDNA,以cDNA为模板,构建重组表达质粒pET28a-sCR1,转化大肠埃希菌,用IPTG诱导表达重组人sCR1融合蛋白,以其免疫家兔制备抗血清.经纯化并鉴定特异性后建立双抗体夹心ELISA法检测血清中sCR1水平,探讨其对慢性病毒性肝炎及活动性SLE怠者的诊断价值.结果研制的兔抗人sCR1抗体ELISA法效价为125 000,纯度和特异性较好.30例健康献血者血清中sCR1为(39.8±7.9)ng/ml;22例慢性病毒性肝炎患者为(48.5±24.7)ng/ml;9例活动性SLE患者为(36.3±17.6)ng/mL,结论制备的兔抗人sCR1抗体效价及特异性较好,用其建立的双抗体夹心ELISA法有望用于临床血清学的诊断.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2010(028)002【总页数】2页(P131-132)【关键词】多克隆抗体;补体受体1型;临床检测【作者】王广兰;刘亚利;初霞;张长远;宫璀璀;王文丽;高天蓝星【作者单位】解放军第153中心医院济南军区检验中心,郑州450042;解放军第153中心医院济南军区检验中心,郑州450042;解放军第153中心医院济南军区检验中心,郑州450042;解放军第153中心医院济南军区检验中心,郑州450042;解放军第153中心医院济南军区检验中心,郑州450042;解放军第153中心医院济南军区检验中心,郑州450042;解放军第153中心医院济南军区检验中心,郑州450042【正文语种】中文【中图分类】R392.11补体受体 1型(complement receptor type l,CR1)又称 C3b/C4b受体,即人白细胞表面的 CD35分子。
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备及效价测定多克隆抗体的制备步骤一、器材剪刀(剪兔毛用)一把、弯头眼科手术镊子(游离血管用)一把、直头眼科手术剪(剪血管用)一把，手术刀架，手术刀片，注射器(1ml、10ml，25ml)附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿(直径18cm)、弯头止血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等。
二、试剂生理盐水(或PBS)弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA)弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，FIA)二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN3三、免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。
每次免疫100-200μg免疫原。
四、兔子的选择兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。
五、免疫用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/4的免疫原。
这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
注：抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。
待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血。
取血量约5ml足矣。
免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。
抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。
将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。
首次免疫用FCA，以后都用FIA。
免疫方法可采用背部多点注射法。
即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射(不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好)。
每次免疫的抗原量约100μg。
免疫次数在四五次即可，抗原用量大可以减少次数。
六、取血：免疫一周后，可以耳动脉取血检测抗体效价。
LINE_1编码蛋白L1_ORF1的原核表达纯化和多克隆抗体制备
中国生物工程杂志 Ch i n a B iotechnology ,2010,30(10):7 11LI NE 1编码蛋白L1 ORF1的原核表达纯化和多克隆抗体制备*胡明明1,2朱运峰1**王 越2 王 宇2 张 亮2 高旭东1 董金凯3 于继云2**(1军事医学科学院附属医院 北京 100071 2军事医学科学院基础医学研究所 北京 100850)(3中国人民解放军总医院 北京 100853)摘要 目的:制备具有肿瘤组织特异性表达的L1 ORF1蛋白多克隆抗体并进行初步应用研究。
方法:采取基因工程表达方法制备L1 ORF1蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体,间接ELI SA 检测抗体效价,W estern blot 和细胞免疫荧光方法检测抗体特异性,免疫检测验证其识别肿瘤细胞内L1 ORF1蛋白的特异性。
结果:制备的抗L1 ORF1蛋白多克隆抗体具有很高的敏感性与特异性,免疫学检测表明该抗体不仅能检测出正常细胞中瞬时表达的L1 ORF1蛋白,而且可检测出肿瘤细胞中天然表达的L1 ORF1蛋白。
结论:制备的多克隆抗体具有较高的敏感性与特异性,为以后该抗体的进一步应用奠定了基础。
关键词 L1 ORF1p 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体 间接免疫荧光中图分类号 R730.21收稿日期:2010 06 07 修回日期:2010 07 08*国家科技重大专项基金(2008ZX10002 003)、国家自然科学基金(30772002)资助项目**通讯作者,电子信箱:z huyf 2004@163.co m;yujyun @126.co mL I NE (long interspersed nuclear ele m e nts ,L1)长散布核元件,是人类基因组中重要的重复序列,L I NE1(L1)为主要的L I NEs 序列,占人类基因组的17%。
L1通过转座,在人类基因组中获得多达10万份的拷贝数[1]。
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ｎａ ｔｈ ｍ ａ ＣＲ１ ａ ｄ ｐ ｅ ａ ａ ｉ ｎ ｏ ｔ ｏ ｙ ｌ ｎ ｌａ ｔ ｄ ｎ ｕ ｎｓ ｎ ｒ ｐ ｒ ｔｏ ｆ ｉｓ ｐ ｌ ｃ ｏ ａ ｎ ｉ ｂｏ ｙ
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摘 要 ：目的 ： 核 表 达 人 ｓ Ｒ 原 Ｃ １分 子 胞 外 区及 其 多 克 隆 抗 体 制 备 。方 法 ：提 取 人 总 Ｒ Ａ 进 行 Ｒ —Ｃ Ｎ ＴＰ Ｒ扩 增 合 成 ｃ Ｎ 以 ｃ Ｎ 为模 板 ， 建 重 组 表 达 质 粒 ｐ Ｔ ８ — Ｃ １ Ｄ Ａ， Ｄ Ａ 构 Ｅ ２ ａ ｓ Ｒ 。转 化 大 肠 杆 菌 中 ， ＩＴ 用 Ｐ Ｇ诱 导 表 达 重 组 人 ｓＲ Ｃ １融合 蛋 白 ， 其 作 为 免 疫 原 制 备 兔 多 抗 。采 用 Ｅ ＩＡ 法 检 测 抗 体 效 价 ， 免 疫 亲 和 层 析 法 纯 化 后 ， 将 ＬＳ 经 进 行 Ｓ ＳＰ Ｇ Ｄ —Ａ Ｅ鉴 定 分 析 。 结果 ： 原 核 细 胞 巾高 效 表 达人 ｓ Ｒ 在 Ｃ １融 合 蛋 白 ， 纯 化 复 性 后 作 为 免 疫 原 ， 疫 经 免 家 兔 ， 得 了 高效 价 及 特异 性 的 兔 抗 人 ｓ Ｒ 获 Ｃ １多 克 隆 抗 体 ， 特 异 地 识 别 人 ｓ Ｒ 可 Ｃ １蛋 白 。 结 论 ： 化 复 性 后 纯 的 ｓＲ Ｃ Ｉ融合 蛋 白作 为抗 原 免疫 家 兔 ， 较 好 的抗 原 性 和 免 疫 原 性 ， 功 地 制 备 出 兔 抗 人 ｓ Ｒ 有 成 Ｃ １多 克 隆 抗 体 ， 为进一步大量表达纯化人 ｓＲ Ｃ １融 合 蛋 白与 临 床 免 疫 学 检 测 方 法 的 建 立 ， 为深 入研 究 ｓ Ｒ 生 物 学 功 能 奠 也 Ｃ １
第 １ ７卷 第 ４期
２ ０ 拄 ０ ８
河 南 医 学研 究
Ｈ ＥＮＡＮ Ｍ Ｅ ＣＡＬ Ｒ Ｅ ＥＡＲＣＨ ＤＩ Ｓ
Ｖ０ ． ７ １ １
ＮＯ பைடு நூலகம் ．
１ ２月
Ｄｅ ｅ ｃ ｍｂｅ ２ ０８ ｒ ０
文章 编 号 ： ０ ４４ ７ ２ ０ ） ４ ０ ８ —５ １ ０ －３ Ｘ（ ０ ８ ０ －２ ９ ０
・
基础研 究 ・
人 ｓＲ Ｃ １克 隆 、 核 和 原 核 表 达 纯 化 及 其 多 克 隆 抗 体 真 制 备
王 广 兰 ，宫璀 璀 ，刘 亚利 ，张 长远 ，刘 珊 ，王 文 丽 ，戴 启 宇
（ 放 军 第 １ ３中 心 医 院 济 南 军 区 检 验 中心 河 南 郑 卅Ｉ ４ ０ ４ ） 解 ５ ５ ０ ２
定 了基 础 。
关 键 词 ： 核 表 达 ；多 克 隆 抗 体 ； 体 受 体 ｌ型 ； 疫 亲 和层 析 纯 化 原 补 免
中 图 分 类 号 ： ３２ Ｒ ９ 文 献 标 识码 ： Ａ
Ｐｒ ｋ ｒ ｏ ｉ ｘ ｒ ｓ ｉ ｎ ｏ ｈ ｘ ｒ ｃ ｌ ｌ ｒ ｒ ｇ ｏ ｆ ｒ ｃ ｍ ｂ － ｏ ａ ｙ ｔｃ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｆ ｔ ｅ ｅ ｔ ａ ｅ ｌ ａ ｅ ｉ ｎ ｏ ｅ ｏ ｕ ｉ
取纯化复性后的scrl表达蛋白免疫家兔初次免疫300ilg与完全弗氏佐剂fca等体积混合充分乳化后在兔颈背万方数据人scrl克隆真核和原核表达纯化及其多克隆抗体制备部皮下多点10点注射免疫家兔之后每3周使用200ilg的scrl表达蛋白与等体积的不完全弗氏佐剂fia充分混合乳化后全部颈背部皮下多点10点注射加强免疫2次后7天取兔耳静脉血样elisa法检测抗血清效价如未达到所需效价可用200ixg的scrl表达蛋白加生理盐水兔耳静脉注射直到所需效价将家兔颈动脉无菌放血处死获取血清分离后一20保存
Ａｂ ｔａ ｔ ｓｒ ｃ ：Ｏｂｅ ｔ ｅ ｏ ｅ ｐｏｅ ｔｅ ｐ ｏ ａｙ ｔ ｘ ｒｓｉｎ ｏ ｈ ｘｒ ｃｌ ｌｒｒｇｏ ｆｈ ｍａ ｊ ｃｉ ：Ｔ ｘ ｌｒ ｈ ｒｋ ｒｏｉ ｅ ｐ ｅｓｏ ｆｔｅ ｅ ｔ ｅｌ ａ ｅ ｉｎ ｏ ｕ ｎ ｖ ｃ ａ ｕ
ｓ ＣＲ１ ａ ｄ ｐ ｅ ａ ｅ ｉｓ ｐ ｌ ｃｏ ａ ｎ ｉ ｏ ｙ． ｅ ｈｏ ｓ：Ｔｈ ｕ ｌｌｎ ｔ ｎ ｒ ｐ ｒ ｔ ｏｙ ｌ ｎ ｌａ ｔｂ ｄ Ｍ ｔ ｄ ｅ ｆ ｌ ｅ ｇ ｈ ＲＮＡ ｆｈ ｍ ａ ＣＲ １ ｏ ｕ ｎ ｓ ｗａ ｂ ｓｏ ．
ｔ ｉ ｅ ｎ ｍｐｌ ｅ ｙ ＲＴ— ａｎ ｄ ａ ｄ ａ ｉ ｄｂ ｉ ｆ ＰＣＲ ，ｔ ｅ ｏ ｓｒ ｃ ｅ ｘ ｅ ｓｏ ｅ ｔｒ ｈ ｎ ｃ ｎ ｔｕ ｔｄ ｅ ｐｒ ｓ ｉｎ ｖ ｃｏ ｓ ＰＥＴ２ — ＣＲ１． Ｔｈ ｅ ｏ ８ａ ｓ ｅ ｒ ｃ ｍ。
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