高密度培养

高密度培养

应用领域为生物制药，其代表为人生长激素。现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌生产多肽类药物的实践中逐步发展起来的。基本信息

中文名高密度培养

发展基础基因工程菌生产多肽类药物

应用领域生物制药

代表人生长激素

技术介绍

现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌（尤其是 E.coli）生产多肽类药物的实践中逐步发展起来的。例如，人生长激素、胰岛素、白细胞介素类和人干扰素等。

具体方法

（1）选取最佳培养基成分和各成分含量。

（2）补料，这是工程菌高密度培养的重要手段之一。

（3）提高溶解氧的浓度，提高好氧菌和兼性厌氧菌培养时的溶氧量也是高密度培养的重要手段之一。

（4）防止有害代谢产物的生成。

高密度培养过程中培养基成份及作用：

根据微生物对营养的要求，培养基包括水分、碳源、氮源、无机元素和生长素等五大类物质，此外还应有一定的酸碱度和渗透压。一般来讲，不同种类的微生物对培养基的要求是不同的，甚至同一种类的微生物在不同的生长阶段及使用目的时，对培养基的要求也不完全相同。有三种类型的培养基：合成培养基、复合培养基和半合成培养基。当营养物浓度可知并且在培养过程中可控制，合成培养基通常用于获得高细胞密度。在复合培养基中的营养物，比如蛋白胨和酵母粗提物，可以在成分和质量上有所变化，这使得用复合培养基的发酵可重复性低。然而。半合成或复合培养基有时对于促进产物形成是必需的，即在合成培养基中加入少量酵母粉、蛋白胨等，以及少量无机盐和氨基酸有助于菌体的生长及产物的形成。

碳源

Escherichiacoli可以利用葡萄糖、乙醇、甘油、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源，当培养基中含有葡萄糖和乳糖时，细菌优先使用葡萄糖，当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过短时间适应，就能利用乳糖作为碳源。还原型的碳化合物常用于构建细胞和形成产物。除了葡萄糖，也可采用一些其他天然有机化合物做为碳源，用于生长和生产。培养基中的碳源浓度相当重要。如培养基中碳源含量超过5%，细菌的生长因细胞脱水而开始下降。使用不同的碳源对菌体生长及外源基因表达有影响。葡萄糖和甘油相比，它们所导致的菌体比生长速率及呼吸强度相差不大，但甘油的菌体得率较小，而葡萄糖所产生的副产物较多。用甘露

糖作碳源时，不产生乙酸，但比生长率和呼吸强度较小。对tac启动子的表达系统，使用乳糖作碳源较有利，乳糖同时起诱导作用，葡萄糖对lac启动子有抑制作用，原因有：(1)降低胞内cAMP水平，(2)诱导物排外作用。采用流加措施，控制培养液中葡萄糖浓度在低水平，可减弱或消除葡萄糖的阻遏作用。

氮源

氮源的作用主要是提供氨基酸、蛋白质、核酸等合成所需的元素氮，氮源可分为有机氮源和无机氮源，有机氮源主要是一些含氮有机物的水解产物，含有丰富的氨基酸、小肽和其他营养物，其中的氨基酸和其它一些小分子有机物可被工程菌直接利用，而不需要再从糖代谢的中间代谢产物合成了，因而对工程菌的生长和外源蛋白的合成都有利，在工程菌培养中被广泛使用，但有机氮一般价格较高，而且，工程菌对有机氮源中各成分的利用是不均衡的，因而过量使用会使某些成分发生积累，产生抑制作用或影响后续纯化工作。常用的有机氮源有：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆等。无机氮源主要是一些含有氮的化合物，如氨水、铵盐等。无机氮源的优点是价格低廉且成分确定，易于按需补加。其中氨水在工程菌培养过程中还可同时起到调节pH的作用。

无机盐和维生素

工程菌培养基中所需的无机盐主要为磷酸盐、Mg、Fe、Ca和一些微量元素如S、Zn、Co、Cu、Mn、Ni等的盐类，其作用是提供菌体生长所需的各种元素，同时还有维持渗透压和控制pH的作用。大多数工程菌都能合成所需的各种维生素，可以在不含有维生素的培养基中生长，但在培养基中含适量的维生素往往对菌体的生长是有利的，而有些工程菌的宿主菌为维生素营养缺陷型，这些菌的培养基中必需含相应的维生素。酵母提取物、玉米浆等有机氮源中含有丰富的无机盐和维生素，因而当培养基中含有较高浓度的上述成分，且菌密度较低时，除加入20-100mmol/L的磷酸盐用于维持pH和渗透压外，不需另外补加无机盐和维生素。但当培养基中不含有机氮源或培养的菌密度较高时，则应考虑补加无机盐和维生素。

对一个合适的发酵培养基，上述各成分的量应以满足或略多于菌体生长和产物合成所需为度，不宜过多加入，以免产生抑制效应和浪费原料，另外各成分的配比也很重要，以利于菌体均衡利用各成分。表1.1为基本培养基中一些主要营养元素的得率系数，表1.2为一些营养成分产生抑制效应的浓度。但对每个工程菌，其发酵培养基最终应通过实验筛选。

任何发酵培养基的优化是一个高强度劳动的过程，需要实验大量的营养化合物种类及其浓度。工程菌高密度培养基设计原理如下：（1）使用基本培养基以便精确设计营养成分之间的定量关系，同时避免任何不利于细菌生长的营养限制性因素；（2）利用碳源限制的方法直接阻断细菌对数生长期间抑制性代谢产物的合成；（3）依据细菌细胞的元素组成确定培养基各成分的精确配比。培养基中的碳氮比（C/N）是相当重要的，如果碳氮比偏小，会导致菌体生长旺盛，造成菌体提前衰老自溶；如果碳氮比偏大，菌体则会生长缓慢，产率下降。即使碳氮比合适，浓度的大小也会影响菌体的生长。