高密度培养
第二章 流加发酵与高密度培养
微生物的高细胞密度培养
概述
发酵研究和工业的一个主要目标是使 体积生产率（g/L•h）最大化，即在 给定体积中和一定时间内获得尽可能 多的产品数量。 高细胞密度培养是高生产效率的要求。 历史上，高细胞密度培养首先建立在 酵母上，用以生产单细胞蛋白、乙醇 和菌体。
概述
后来，建立起其它的嗜温菌的高密度培养，生 产各种类型产品。 甲基营养生物的高密度培养导致了聚羟基烷酸 的高效生产。 如今，微生物的高细胞密 度培养的范畴已包括细菌、 古细菌和真核生物（酵母）。
温度的影响
把培养温度从 37 ℃降到 26 －30℃，会降低营养吸收和 生长速度，因此会减少有毒副产物和代谢产生的热量。 降低温度也能减少细胞对氧的需求。
降低重组细胞温度也有可能减少包含体形式的蛋白质 的产生。
以上这些优点说服了许多研究者使用低温，对大肠杆菌 进行高细胞密度培养。
HCDC遇到的问题
二氧化碳和放热的影响
HCDC中高细胞密度培养中的二氧化碳会影响细胞的生长。 高CO2分压（>0.3atm）会降低生长速率并刺激乙酸的生成。
放热也是高细胞密度培养的一个问题。
热量的主要来源是搅拌产生的机械热和细胞代谢产生的热量。
这些问题可通过降低细胞比生长速率而部分的解决。
HCDC遇到的问题
HCDC中各种微生物的最大细胞密度
微生物 细菌 Methylobacterium extorquens Escherichia coli DCW（g/l） 233 190 180 148 145 184 184 157 141 100 132 114 268 208 235 100
概述
Bacillus subtilis Alcaligenes eutrophus NCIMB 11599 Streptomyces laurentii Lactococcus lactis Pseudomonas putida BM01 古细菌 Marinococcus M52 Sulfolobus hibatae 真核 Candida brassicae Saccharomyces serevisiae Pichia pastoris
微生物的高密度培养
微生物的高密度培养高密度培养的定义：高密度培养：是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。
一般认为，细胞密度接近理论值的培养为高密度培养。
但由于菌种、菌株及目标产物差异性较大，高密度培养的最终菌体生物量无法用一个确切的值或范围界定。
Riesenbere经计算认为，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400g/L，考虑到实际情况的种种条件限制，Markel等认为最高菌体密度为200 g/L，此时，发酵液25%充满长3μm，宽1μm的菌体，发酵液粘度很高，几乎散失流动性。
而某些极端微生物细胞密度达到数克每升也可认为是高密度培养。
高密度培养技术最早用于酵母细胞的培养提高生物量或生产单细胞蛋白及乙醇的生产。
随着基因工程技术的发展和应用，构建基因工程菌已经成为提高目标蛋白表达水平的一项基本手段。
基因工程菌过量表达目标产物还有助于简化后续的分离纯化操作，同时也便于基因工程改造。
其中大肠杆菌、酵母是最常用的重组表达宿主菌高密度培养的优势:提高最终菌体生物量和目标产物的时空产率,缩小生物反应器体积，降低设备投资缩短发酵周期，减少水电使用，降低生产成本便于下游分离纯化工艺等高密度培养主要限制因素:固态或挥发性底物在液态培养基中,溶解限制底物对细胞生长可能存在限制或抑制作用。
底物和产物的稳定性差或易挥发产物降解产物或代谢副产物的积累，对细胞生长产生限制。
呼吸作用导致C02和热量的急剧积聚氧气需求量大，培养基黏度增加副产物的积累与毒害作用。
高密度培养的培养基：高密度培养要求培养基含有细胞生长所需的所有营养成分，配比均衡，且浓度不会对细胞生长产生抑制作用。
一般采用营养成分清晰的全合成培养基，便于发酵过程的调节控制和进一步的扩大培养。
培养基必须包含细胞生长必需的碳源、氮源、无机盐及生长因子。
高密度培养的初始发酵培养基营养成分必须低于抑制浓度，并结合恰当的流加补料策略提供营养物质，使细胞生长维持在最佳状态。
第二章-流加发酵与高密度培养
流加发酵
所 谓 流 加 发 酵 ， 即 补 料 分 批 发 酵 (Fedbatch fermentation)，有时又称半连续培 养或半连续发酵，是指在分批发酵过程 中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵 方法
分批、连续、流加操作方式的比较
分批发酵 连续发酵
流加发酵
优点 1.一般投资较小 2.易转产、生产灵活 3.分批操作中某一阶段可获得高的 转化率 4.发酵周期短，菌种退化率小 1.可实现有规律的机械、自动化 2.操作人员少 3.反应器体积小、非生产时间少
在菌体生长阶段采用指数速率流加法的
几点假设如下： (a) 发酵罐内为理想混合； (b) 葡萄糖为唯一限制性碳源； (c) 残留菌体对葡萄糖的产率系数(YX/s)为常 数； (d) 菌体生长遵循Monod方程。
对底物葡萄糖进行衡算，则：
d(VS ) dt
FS0
(
Yx / s
ms ) VX
F为体积流加速率(L/h)，S0为流加液中基质浓 度(g/L)，Yx/s为菌体对底物的产率系数(g/g)， ms 为细 胞比维 持系数 (g/g/h) ， X为菌体 浓度 (g/L)，V为培养液体积(L)，μ为菌体比生长速 率(h-1)。
1. 流加发酵类型
流加发酵的分类
类别
流加方式
无反馈控 制
反馈控制
恒流量流加、变流量流加和间歇流加
直接控制流加、间接控制流加 定值控制流加、程序控制流加、最优控制流 加
2. 采用流加发酵应该解决的关键问题
(1) 流加什么物质？
①补充微生物能源和碳源，如在发酵液中添加 葡萄糖、 饴糖、液化淀粉。作为消泡剂的天然油 脂，有时也能同时起到补充碳源的作用
及产物对底物的产率系数(Yp/s)
高密度培养裂壶藻的方法
高密度培养裂壶藻的方法
1.准备培养基：将适量的碳源（如糖、淀粉等）、氮源（如硝酸盐、磷酸盐等）、微量元素（如钙、镁、锌等）混合溶解，加入适量的硫酸钠，调节pH值至7.0，加入适量的抗生素，搅拌均匀，即可得到培养基。
2.接种：将裂壶藻细胞悬浮液加入培养基中，搅拌均匀，放入培养箱，控制温度为25℃，光照强度为100μmol/m2/s，湿度为80%，接种后24小时即可观察到细胞的增殖。
3.培养：每隔24小时，将培养基更换一次，以保持培养基的新鲜，控制细胞的增殖，使细胞达到高密度。
4.收获：当细胞达到高密度时，可以将细胞收集，用离心机将细胞分离，然后用适当的消毒剂处理，即可得到高密度培养的裂壶藻细胞。
微生物的高密度培养
微生物的高密度培养定义一[1]高密度培养指应用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著的提高，最终提高特定产物的比生产率。
单位：细胞干重/升（DCW/L）。
凡是细胞密度比较高，以至接近其理论值的培养均可称为高密度培养，，一般认为其上限值为150～200g （DWC/L），下限值为20～30g（DCW/L）。
定义二[2]细胞高密度培养(high cell density culture，HC-DC)是指在人工条件下模拟体内生长环境，使细胞在细胞生物反应器中高密度生长，使液体培养中的细胞密度超过常规培养10倍以上，最终达到提高特定代谢产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量) 的目的，用于发酵生产生物制品的技术。
用途[1]各种微生物（乳酸杆菌、芽孢杆菌、大肠杆菌等）的生产中，改进发酵工艺，提升其现代化发酵进程，增加单位体积培养液中菌体的数量，提高生产效率，加速微生物制剂的商品化进程。
发展状况[2]细胞高密度培养不仅是生产高质量的浓缩型细胞和代谢产物的重要环节，是工程菌和非工程菌能否以低成本实现规模生产的关键性因素，也是细胞和代谢产物工业化生产过程中必需达到的重要目标与方向。
随着市场需求的日益扩大，高密度培养技术广泛地应用于各种细胞( 植物、动物、微生物) 的生产中，它不仅可以改进发酵工艺，提升其现代化发酵进程，而且对于增加单位体积培养液中菌体数量，提高生产率，加速微生物制剂的商品化进程，更好地满足市场需求，具有重要而深远的意义。
但是目前细胞高密度培养仍然是我国生物制品难以攻下的课题，只有对细胞高密度培养关键技术进行不断的研究、改进，科学系统地运用，才能对我国传统的生物制品生产技术进行升级和科技创新。
谷胱甘肽(GSH)的生产[3]谷胱甘肽(GSH)是一种重要的生化药物,具有独特的抗氧化、抗衰老特性,近年来作为食品添加剂,其需求渐增。
迄今国内尚未有工业化生产GSH的报道,为了打破进口品的垄断地位,迫切需要加大开发GSH的力度。
第二章-流加发酵与高密度培养
4.对 发 酵 过 程 可 实 现 优 化 控 制 5.因 经 常 灭 菌 会 降 低 仪 器 使 用 寿 命
（1）状态方程的建立 （2）目标泛函的确定 （3）最优化底物流加方式的求解
流加发酵的物料衡算式可以表达为：
d(XV) XV
dt
d(dStV )XVSFF d(PV) XV
dt
dV F dt
流加发酵的最优化理论有：格林原理、庞特里金最小值 (最大值)原理等
在采用流加发酵技术之前要考虑的两个 问题
及产物对底物的产率系数(Yp/s)
4. 合适的流加发酵类型的确定 a.恒速流加(包括单一速率和分阶段恒速流加) b.指数速率流加 c.底物在线测定后的反馈流加
(如葡萄糖反馈流加) d. pH-stat e. DO-stat
5. 流加方式的应用 (1) 恒速流加
采用恒流速流加培养时，可得到如下 的物料平衡方程式：
温度的影响
把培养温度从37℃降到26－30℃，会降低营养吸收和 生长速度，因此会减少有毒副产物和代谢产生的热量。
降低温度也能减少细胞对氧的需求。
降低重组细胞温度也有可能减少包含体形式的蛋白质 的产生。
以上这些优点说服了许多研究者使用低温，对大肠杆菌 进行高细胞密度培养。
HCDC遇到的问题
流加控制策略
Streptomyces laurentii Lactococcus lactis
Pseudomonas putida BM01 古细菌
微生物的高密度培养
微生物的高密度培养高密度培养的定义：高密度培养：是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。
一般认为，细胞密度接近理论值的培养为高密度培养。
但由于菌种、菌株及目标产物差异性较大，高密度培养的最终菌体生物量无法用一个确切的值或范围界定。
Riesenbere经计算认为，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400g/L，考虑到实际情况的种种条件限制，Markel等认为最高菌体密度为200 g/L，此时，发酵液25%充满长3μm，宽1μm的菌体，发酵液粘度很高，几乎散失流动性。
而某些极端微生物细胞密度达到数克每升也可认为是高密度培养。
高密度培养技术最早用于酵母细胞的培养提高生物量或生产单细胞蛋白及乙醇的生产。
随着基因工程技术的发展和应用，构建基因工程菌已经成为提高目标蛋白表达水平的一项基本手段。
基因工程菌过量表达目标产物还有助于简化后续的分离纯化操作，同时也便于基因工程改造。
其中大肠杆菌、酵母是最常用的重组表达宿主菌高密度培养的优势:提高最终菌体生物量和目标产物的时空产率,缩小生物反应器体积，降低设备投资缩短发酵周期，减少水电使用，降低生产成本便于下游分离纯化工艺等高密度培养主要限制因素:固态或挥发性底物在液态培养基中,溶解限制底物对细胞生长可能存在限制或抑制作用。
底物和产物的稳定性差或易挥发产物降解产物或代谢副产物的积累，对细胞生长产生限制。
呼吸作用导致C02和热量的急剧积聚氧气需求量大，培养基黏度增加副产物的积累与毒害作用。
高密度培养的培养基：高密度培养要求培养基含有细胞生长所需的所有营养成分，配比均衡，且浓度不会对细胞生长产生抑制作用。
一般采用营养成分清晰的全合成培养基，便于发酵过程的调节控制和进一步的扩大培养。
培养基必须包含细胞生长必需的碳源、氮源、无机盐及生长因子。
高密度培养的初始发酵培养基营养成分必须低于抑制浓度，并结合恰当的流加补料策略提供营养物质，使细胞生长维持在最佳状态。
2、什么是高密度培养,举例论述如何利用高密度培养技术来
2、什么是高密度培养，举例论述如何利用高密度培养技术来某一产品的。
答：高密度培养有时也称高密度发酵，一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术，现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌生产多肽类药物的实践中逐渐发展起来的。
重组大肠杆菌高密度培养技术摘要：阐述了基因工程菌高密度发酵工艺的几个主要影响因素,包括重组菌构建、培养条件、生长抑制因子以及它们的控制技术。
通过高密度发酵可以提高细胞生长密度、目的蛋白的表达含量。
在高密度发酵过程中,会产生一些有害抑制代谢副产物,但通过分批补料可以降低影响。
关键词:高密度发酵; 分批补料; 生长抑制因子。
重组ＤＮＡ技术和大规模培养技术的有机结合,使得原来无法大量获得的天然蛋白质能够规模生产。
目前,已经在高密度培养中成功地提高了同源和异源蛋白的产量。
分批补料培养通常被用于微生物发酵,这种方法通过在培养过程克服细胞的调节机制:苹果酸影响,催化阻遏,产生抑制,使细胞密度达到较高水平。
大肠杆菌高密度培养工艺广泛地应用于重组蛋白的生产,这主要是由于大肠杆菌的遗传学和生理学已基本被认清。
产量的高低主要取决于细胞密度、目的蛋白的表达含量。
但在培养过程也存在一些问题,如氧、基质的利用率、小分子物质、生长抑制物的积累等。
因此,减少抑制物的形成,提供良好的生长条件是必要的。
1 重组大肠杆菌构建的几个影响因素1.1宿主菌的选择不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在很大差别。
现在普遍应用的大肠杆菌ＢＬ21(ＤＥ3)ｐｌｙｓＳ因其带有编码Ｔ7溶菌酶的小质粒,而有效地降低杂蛋白的表达,但不影响ＩＰＴＧ诱导目的蛋白的表达水平,从而成为近年来最为常用的宿主菌。
表达产物的形成在大肠杆菌体内有三条路径:第一,形成稳定的天然构象,可溶且有活性,不易被降解;第二,蛋白质是可溶性的,但构象为非天然状态,易被胞内的各种蛋白酶识别降解;第三,多肽链间彼此聚集形成不可溶的包涵体,并且有蛋白酶抗性。
普通微生物学课后习题及答案第六章
微生物的个体生长：指细胞物质有规律地、不可逆地增加，导致细胞体积扩大的生物学过程。
繁殖：引起生命个体数量增加的生物学过程。
微生物细胞数目的检测方法：显微直接计数法：用计数板在光学显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。
活菌计数法：通过测定样品在培养基上形成的菌落数来间接确定其活菌的方法，计数依据是在稀释情况下一个菌落由一个活细胞繁殖形成，又称平板菌落计数法。
微生物生物量的测定方法：1、湿重法将微生物培养液离心，收集细胞沉淀物，然后称重。
2、干重法将离心得到的细胞沉淀物置于100~105℃的烘箱中干燥过夜至水分去除，然后再称重。
3、比浊法细菌培养物在其生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物混浊度的增加。
在一定浓度范围内，悬液中细胞的数量与透光量成反比，与光吸收值成正比。
因此利用分光光度计在450nm~650mn的某一波长可以测定培养物的光吸收值来确定细胞量。
4、生理指标法与微生物生长量相平行的生理指标很多，可根据实验目的和条件适当选用。
一般微生物细胞的含氮量比较稳定，故可用凯氏定氮法等测定其总氮量，再乘以系数6.25即为粗蛋白含量。
蛋白质含量越高，说明菌体数和细胞物质量越高。
1、丝状微生物菌丝长度测定法将真菌接种在琼脂平皿的中央，定时测定菌落的直径或面积。
2、培养料中菌体生长速率测定法主要测定一定时间内固体培养料中菌丝体向前延伸的距离。
3、单个菌丝顶端生长速率测定法可利用湿室培养法对丝状微生物进行培养，定时将湿室中的培养有微生物的载玻片置于显微镜下，借助目镜测微尺测定一定时间内单个菌丝的伸长长度。
微生物的同步生长与同步培养方法同步培养法：使培养物中所有的微生物细胞都处于相同的生长阶段的培养方法。
同步生长：指这种培养物中所有微生物细胞都处于同一生长阶段，并都能同时分裂的生长方式。
获得微生物同步生长的方法主要有两类：环境条件诱导法：采用物理或化学因子使微生物细胞生长进行到某个阶段停止下来，使先到该阶段的微生物细胞不能进入下个阶段，待全部群体细胞都到达该生长阶段后，再除去该因子，使全部群体细胞同时进入下个生长阶段，达到诱导微生物细胞同步生长的目的。
流加发酵与高密度培养
假定为常数，则上式积分可得： XV X F VF e (t t F )
由于生长符合Monod方程
d ( XV ) XV dt
m S
Ks S
dS 0 dt
V
dS dV S F S0 ( m) V X dt dt Yx / c
采用恒流速流加培养时，可得到如下 的物料平衡方程式：
d (VX )
a.恒速流加 (包括单一速率和分阶段恒速流加)
b.指数速率流加
c.底物在线测定后的反馈流加
(如葡萄糖反馈流加)
细胞平衡：dt 碳平衡：
Vrx
d (VS ) Vrs FS 0 dt
d. pH-stat
e. DO-stat
dVP 产物平衡： Vrp dt dV 体积平衡： F dt
3. 流加发酵过程中某些重要参数的确定
a. 最佳底物浓度的确定
(包括菌体生长阶段和产物合成阶段)
b. 底物的消耗速率
c. 体比生长速率()
d. 菌体对底物的产率系数(Yx/s)
及产物对底物的产率系数 (Yp/s)
2
2014/1/8
4. 合适的流加发酵类型的确定
5. 流加方式的应用 (1) 恒速流加
流加发酵最优化研究的核心问题是找出 最佳的底物流加方式，以维持发酵过程 始终处于最佳状态 流加发酵最优化的研究内容包括： （1）状态方程的建立 （2）目标泛函的确定 （3）最优化底物流加方式的求解
流加发酵的物料衡算式可以表达为：
d ( XV ) XV dt d ( SV ) XV S F F dt
恒流速流加过程中的流量 F的确定：
(a)预试验中所得出的流加时刻菌体对
高密度培养名词解释
高密度培养名词解释高密度培养是一种新型的生物技术，它可以促进生物体内的生长和强化存活率。
这种技术通过改变细胞增殖环境来提高培养基中细胞的生长和存活率。
通过使用高密度培养，生物技术人员可以研究出更多的生物分子，从而推动农业技术的发展和改善人类的生活质量。
高密度培养的定义是指在细胞培养基中添加大量细胞，以达到增加细胞的数量、形态和活力的效果。
在细胞培养基中，有多种不同的营养素，这些营养素可以为细胞提供必要的营养和养分，促进细胞增殖。
它也可以控制细胞环境，以确保它们具有良好的生长和存活率。
高密度培养技术也可以应用于细胞表面工程，以促进细胞增殖和调节细胞活动。
在细胞表面工程中，微米级的物质可以被放置在细胞表面，从而改变细胞表面蛋白的表达，影响细胞的生长和存活率。
同时，细胞表面工程也可以调节细胞的代谢过程，从而影响细胞的活性和特性。
高密度培养技术有助于提高培养细胞的速度和灵敏度，在很大程度上提高了细胞的存活比率。
高密度培养还可以节约种子和细胞培养基的成本，从而降低实验过程中制备细胞培养基的成本。
在细胞培养过程中，它还可以提高培养基的吸收率，使细胞增殖所需的时间减少。
此外，高密度培养技术还可以应用于基因工程中，从而更有效地避免变异。
基因工程是一种利用生物技术改变特定基因的技术，通过改变特定基因，可以改变外在表现。
高密度培养可以帮助基因工程技术更有效地抑制基因变异，从而提高改造后细胞的生长和存活率。
总之，高密度培养是一种先进的生物技术，可以有效地提高细胞的生长和存活率，从而提高农业技术的发展和改善人类生活质量。
这种技术的开发和应用不仅可以提高生物分子的研究和开发能力，而且还可以改善人们的健康和生活品质，为人类谋取更多的福祉。
凝结芽孢杆菌的筛选及高密度培养工艺研究
凝结芽孢杆菌的筛选及高密度培养工艺研究首先，凝结芽孢杆菌的筛选是研究的第一步。
目前主要的筛选方法有传统的培养方法和分子生物学方法。
传统的培养方法是基于形态学特征和代谢产物的产生情况进行筛选，但是这种方法耗时且效果不稳定。
而分子生物学方法则是通过采用特定基因的引入或剔除来筛选出产生或不产生胞外聚合物的菌株。
这种方法可以更准确地筛选出胞外聚合物产生量高的菌株，但需要一定的基因工程技术支持。
在获得高胞外聚合物产生菌株后，需要进一步研究其高密度培养工艺。
高密度培养是指在同一培养容器中培养细胞达到较高的细胞密度。
目前主要的培养方式有批量发酵、连续发酵和条件发酵等。
其中批量发酵是最常用的培养方式，可以通过调节培养基的成分和培养条件来提高胞外聚合物的产生量。
连续发酵则是将废液连续引出，新培养基连续加入，使细胞在养分过剩的状态下维持较高的细胞密度。
条件发酵则是通过在特定条件下培养菌株来提高产物的产生速率或产量。
例如，可以调节温度、pH值、氧气和碳源的浓度等来优化培养条件。
在高密度培养的过程中，酸碱度、氧气和碳源的供给等都会影响细菌的生长和产物的产生。
因此，需要对培养过程中的各种因素进行优化研究。
例如，可以通过反应动力学和代谢通量分析来优化培养菌株的条件。
通过调整培养基和培养条件，可以最大化胞外聚合物的产生量，并提高培养速率和产量。
此外，培养菌株的细胞稳定性也是高密度培养过程中需要考虑的问题。
在培养过程中，菌株可能会发生突变或丢失产物的能力。
因此，需要采取相应的措施来保持菌株的稳定性，例如进行定期的转接和冻存备份。
综上所述，凝结芽孢杆菌的筛选及高密度培养工艺的研究对于进一步发展其产业应用具有重要意义。
通过选择合适的筛选方法获得高产的菌株，并通过优化培养条件和培养基，最大化胞外聚合物的产生量和培养速率，可以为凝结芽孢杆菌的应用提供更好的支持。
高密度培养
基因工程菌高密度培养
High Cell-Density Culture
浙江工业大学 杭州
课前思考：
1、为什么凉开水养不活鱼？
2、为什么菜市场卖鱼的地方需 要一个鼓气设备？ 3、什么物质在水中的溶解度随 着温度的升高而降低？ 4、进一步增加鱼的密度，而且 要保证鱼不死，你能想出其它办法 吗？
c、磷：磷是DNA的组成成分
酵母膏、蛋白胨等可以提供全面的营养
3、解决环境毒性问题 部分微生物代谢产物对细胞有 一定的毒性。比如乙酸（酵解产物） pH改变
4、防止质粒丢失
丢失质粒的细胞具有生长优 势，但是它不含目的基因，所 以不能合成产物。
解决方案
1、关于供氧：
a、通入空气、搅拌
b、提高搅拌速度
关于质粒丢失：
在培养基中添加抗生素，丢失质 粒的细胞不能生长或死亡，即给予 适当的选择压力。
氨苄青霉素易失活，培养中 期补加氨苄青霉素，维持选择压 力
诱导时机的选择也非常重要 在生长前期，无诱导剂可以使 细胞快速生长，加入诱导剂诱导目 的基因表达会抑制细胞的增殖能力。 所以，过早诱导会影响细胞密度。 在细胞达到一定密度以后加入 诱导剂，可以得到高密度发酵液。 一般选在对数生长期的中后期诱导
高密度培养：
单位体积内细胞数量高于 常规的培养模式。 E.coli最高密度理论值：400g/L （DCW Dry Cell Weight） 国外达到：200g/L
国内小于50g/L
高密度培养的意义：
1、节约诱导剂的用量：摩尔浓度
相同，体积越小，诱导剂用量越少。
微生物的高密度培养
How
1、选取最佳培养基成分和各成分含量 2、补料
3、提高溶解氧的浓度
多肽类药物：人生长激素、胰岛素、包细胞介素 类、人干扰素等
why
1、提高产物的比生产率（单位体积单位时间内产物的产量） 2、减少培养容器的体积
3、培养基的消耗
4、提高下游工程中分离、提取的效率
5、缩短生产周期、减少设备投入和降低生产成本
下游工程（down-stream processing）：
下游工程指生化产品的分离纯化阶段的工作。
4、防止有害代谢What 2、Where 2、Why 3、How
what
高密度培养（high cell-density culture，HCDC)有 时也称高密度发酵，一般是指微生物在液体培养中细胞 群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技 术。
where
现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌 生产多肽类药物中实践中逐步发展起来的
2022年四川农业大学生物技术专业《微生物学》期末试卷B(有答案)
2022年四川农业大学生物技术专业《微生物学》期末试卷B(有答案）一、填空题1、用孔雀绿和复红作细菌芽孢染色时，可使菌体呈______色，使芽孢呈______色。
2、不同病毒在不同的宿主细胞上可形成不同特征的聚集体，如在动物细胞内的______，细菌苔上的______，植物叶片上的______，昆虫细胞内的______，以及动物单层细胞上的______等。
3、微生物在糖酵解生成丙酮酸基础上进行的其他种类的发酵有丁二醇发酵、混合酸发酵、______发酵和______发酵等。
丁二醇发酵的主要产物是______，______发酵的主要产物是乳酸、乙酸、甲酸、乙醇。
4、按照对培养基成分的了解，培养基可分为______、______和______。
5、真核微生物包括______、______、______和______等几个大类。
6、著名的微生物学家Roger Stanier提出，确定微生物学领域不应只是根据微生物的大小，而且也应该根据有别于动、植物的______。
7、与单批发酵相比，微生物的连续发酵具有许多优点，如______、______、______和______等；同时，也还存在某些缺点，如______， ______和______等。
8、植物根际微生物对植物有害的方面有______和______等。
9、遗传信息翻译成多肽链起始于mRNA上的______，它是指起始密码子AUG上游30～40核苷酸的一段非译区。
10、人体的白细胞种类很多，它们在免疫防御中具有重要作用，例如，具有吞噬功能的如______、______、______和______；无吞噬功能但在特异性免疫中作用极其重要的有两种，即______与______。
二、判断题11、由于支原体细胞膜上含有甾醇，因此，它们对于抗真菌的抗生素很敏感。
（）12、在促进扩散过程中，载体蛋白对被运输物质具有较高的专一性，一种载体蛋白只能运输一种物质。
（）13、凡能利用乙酸作为唯一碳源的微生物，必然存在着乙醛酸循环。
2022年四川师范大学生物科学专业《微生物学》期末试卷B(有答案)
2022年四川师范大学生物科学专业《微生物学》期末试卷B(有答案）一、填空题1、在没有显微镜的条件下，通过观察生长在______上的______形状或生长在______上的______现象，可推测某细菌可能长有鞭毛。
2、病毒的非增殖性感染有______、______和______3种类型。
3、微生物的4种糖酵解途径中，______是存在于大多数生物体内的一条主流代谢途径；______是存在于某些缺乏完整EMP途径的微生物中的一种替代途径，为微生物所特有；______是产生4碳、5碳等中间产物，为生物合成提供多种前体物质的途径。
4、无氮培养基是用来分离______、按用途它属于______培养基、按成分属于______培养基。
5、真核生物细胞中核糖体附着在______的表面。
6、微生物在其体制等方面具有一系列的优势，如______、______、______、______和______等。
7、描述指数期的三个重要参数分别是：______、______和______。
8、磷的生物地球化学循环包括3种基本过程：______、______、______。
9、四种引起细菌基因重组的方式是______、______、______和______。
10、IgG在木瓜蛋白酶的作用下，可产生2个相同的______（符号为______）和1个______（符号为______）。
二、判断题11、细菌的异常形态是细菌的固有特征。
（）12、大多数真菌需要高碳氮比的营养物，而动物致病细菌需要低碳氮比的营养物。
（）13、微生物的次生代谢物是微生物主代谢不畅通时，由支代谢途径产生的。
（）14、植物病毒一般均无包膜。
（）15、厚垣孢子是由有隔菌丝的真菌产生的。
（）16、根据16S和18S rRNA测序和统计结果所提出的三域学说来看，真核生物域与古生菌域更为接近。
（）17、细菌分裂繁殖一代所需时间为倍增时间。
（）18、在自然界氮元素循环的8个环节中，有6个是只有微生物才能运转，因此可以认为微生物是氮素循环中的核心生物。
2022年南京工业大学浦江学院食品科学与工程专业《微生物学》期末试卷A(有答案)
2022年南京工业大学浦江学院食品科学与工程专业《微生物学》期末试卷A(有答案）一、填空题1、立克次氏体是一类______、______的原核生物，它与支原体的区别是______和______，与衣原体的区别是______、______和______。
专性寄生于植物韧皮部的立克次氏体，称作______。
2、纯化的病毒制备物应保持其______和______。
3、发酵工业的生产菌种主要来源：______、______和______。
4、按照对培养基成分的了解，培养基可分为______、______和______。
5、真菌无性孢子主要包括______、______、______、______、______、______和______，有性孢子主要包括______、______、______ 和______。
6、细菌分类鉴定的主要文献是______。
7、常用的活菌计数法有______、______和______等。
8、微生物将空气中的N2还原为NH3的过程称为______。
该过程中根据微生物和其他生物之间相互的关系，固氮体系可以分为______、______ 和______3种。
9、检出营养缺陷型一般有四种方法：① ______，② ______，③ ______和④ ______。
10、生理上的屏障结构有______和______。
二、判断题11、G＋菌的细胞壁结构只有一层，通常含有磷壁酸；G－菌细胞壁结构有两层，不含磷壁酸。
（）12、基团移位是借助于酶或定向酶系统实现的主动输送，因此不需要消耗能量。
（）13、化能自养微生物的产能效率、生长速率和生长得率都很低。
（）14、利用噬菌斑的形态和特点，可进行噬菌体的鉴定、分离和计数。
（）15、真核微生物染色质中的组蛋白，都是以八聚体形式存在于核小体中。
（）16、菌株的概念与克隆的概念相差甚远。
（）17、细胞大小相同的同种微生物可用来进行同步培养。
（）18、大量服用抗生素的患者同时要服用维生素，这是为了补充因肠道微生物受抑制减少维生素的合成。
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高密度培养
应用领域为生物制药，其代表为人生长激素。
现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌生产多肽类药物的实践中逐步发展起来的。
基本信息
中文名高密度培养
发展基础基因工程菌生产多肽类药物
应用领域生物制药
代表人生长激素
技术介绍
现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌（尤其是 E.coli）生产多肽类药物的实践中逐步发展起来的。
例如，人生长激素、胰岛素、白细胞介素类和人干扰素等。
具体方法
（1）选取最佳培养基成分和各成分含量。
（2）补料，这是工程菌高密度培养的重要手段之一。
（3）提高溶解氧的浓度，提高好氧菌和兼性厌氧菌培养时的溶氧量也是高密度培养的重要手段之一。
（4）防止有害代谢产物的生成。
高密度培养过程中培养基成份及作用：
根据微生物对营养的要求，培养基包括水分、碳源、氮源、无机元素和生长素等五大类物质，此外还应有一定的酸碱度和渗透压。
一般来讲，不同种类的微生物对培养基的要求是不同的，甚至同一种类的微生物在不同的生长阶段及使用目的时，对培养基的要求也不完全相同。
有三种类型的培养基：合成培养基、复合培养基和半合成培养基。
当营养物浓度可知并且在培养过程中可控制，合成培养基通常用于获得高细胞密度。
在复合培养基中的营养物，比如蛋白胨和酵母粗提物，可以在成分和质量上有所变化，这使得用复合培养基的发酵可重复性低。
然而。
半合成或复合培养基有时对于促进产物形成是必需的，即在合成培养基中加入少量酵母粉、蛋白胨等，以及少量无机盐和氨基酸有助于菌体的生长及产物的形成。
碳源
Escherichiacoli可以利用葡萄糖、乙醇、甘油、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源，当培养基中含有葡萄糖和乳糖时，细菌优先使用葡萄糖，当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过短时间适应，就能利用乳糖作为碳源。
还原型的碳化合物常用于构建细胞和形成产物。
除了葡萄糖，也可采用一些其他天然有机化合物做为碳源，用于生长和生产。
培养基中的碳源浓度相当重要。
如培养基中碳源含量超过5%，细菌的生长因细胞脱水而开始下降。
使用不同的碳源对菌体生长及外源基因表达有影响。
葡萄糖和甘油相比，它们所导致的菌体比生长速率及呼吸强度相差不大，但甘油的菌体得率较小，而葡萄糖所产生的副产物较多。
用甘露
糖作碳源时，不产生乙酸，但比生长率和呼吸强度较小。
对tac启动子的表达系统，使用乳糖作碳源较有利，乳糖同时起诱导作用，葡萄糖对lac启动子有抑制作用，原因有：(1)降低胞内cAMP水平，(2)诱导物排外作用。
采用流加措施，控制培养液中葡萄糖浓度在低水平，可减弱或消除葡萄糖的阻遏作用。
氮源
氮源的作用主要是提供氨基酸、蛋白质、核酸等合成所需的元素氮，氮源可分为有机氮源和无机氮源，有机氮源主要是一些含氮有机物的水解产物，含有丰富的氨基酸、小肽和其他营养物，其中的氨基酸和其它一些小分子有机物可被工程菌直接利用，而不需要再从糖代谢的中间代谢产物合成了，因而对工程菌的生长和外源蛋白的合成都有利，在工程菌培养中被广泛使用，但有机氮一般价格较高，而且，工程菌对有机氮源中各成分的利用是不均衡的，因而过量使用会使某些成分发生积累，产生抑制作用或影响后续纯化工作。
常用的有机氮源有：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆等。
无机氮源主要是一些含有氮的化合物，如氨水、铵盐等。
无机氮源的优点是价格低廉且成分确定，易于按需补加。
其中氨水在工程菌培养过程中还可同时起到调节pH的作用。
无机盐和维生素
工程菌培养基中所需的无机盐主要为磷酸盐、Mg、Fe、Ca和一些微量元素如S、Zn、Co、Cu、Mn、Ni等的盐类，其作用是提供菌体生长所需的各种元素，同时还有维持渗透压和控制pH的作用。
大多数工程菌都能合成所需的各种维生素，可以在不含有维生素的培养基中生长，但在培养基中含适量的维生素往往对菌体的生长是有利的，而有些工程菌的宿主菌为维生素营养缺陷型，这些菌的培养基中必需含相应的维生素。
酵母提取物、玉米浆等有机氮源中含有丰富的无机盐和维生素，因而当培养基中含有较高浓度的上述成分，且菌密度较低时，除加入20-100mmol/L的磷酸盐用于维持pH和渗透压外，不需另外补加无机盐和维生素。
但当培养基中不含有机氮源或培养的菌密度较高时，则应考虑补加无机盐和维生素。
对一个合适的发酵培养基，上述各成分的量应以满足或略多于菌体生长和产物合成所需为度，不宜过多加入，以免产生抑制效应和浪费原料，另外各成分的配比也很重要，以利于菌体均衡利用各成分。
表1.1为基本培养基中一些主要营养元素的得率系数，表1.2为一些营养成分产生抑制效应的浓度。
但对每个工程菌，其发酵培养基最终应通过实验筛选。
任何发酵培养基的优化是一个高强度劳动的过程，需要实验大量的营养化合物种类及其浓度。
工程菌高密度培养基设计原理如下：（1）使用基本培养基以便精确设计营养成分之间的定量关系，同时避免任何不利于细菌生长的营养限制性因素；（2）利用碳源限制的方法直接阻断细菌对数生长期间抑制性代谢产物的合成；（3）依据细菌细胞的元素组成确定培养基各成分的精确配比。
培养基中的碳氮比（C/N）是相当重要的，如果碳氮比偏小，会导致菌体生长旺盛，造成菌体提前衰老自溶；如果碳氮比偏大，菌体则会生长缓慢，产率下降。
即使碳氮比合适，浓度的大小也会影响菌体的生长。