Touchdown-PCR的退火温度设计原则
PCR条件中退火温度
PCR条件中退火温度引言聚合酶链反应（PCR）是一种重要的分子生物学技术，它用于扩增DNA片段。
PCR 的成功与否与许多因素有关，其中之一就是退火温度的选择。
本文将探讨PCR条件中退火温度的重要性以及如何选择适当的退火温度。
PCR的原理PCR是一种体外扩增DNA片段的技术，它通过反复进行三个步骤来实现：变性、退火和延伸。
其中退火是PCR过程中非常重要的一个步骤，它决定了扩增产物的特异性和产量。
退火温度对PCR的影响退火温度是指PCR反应中退火步骤发生的温度。
它的选择对PCR的成功起着至关重要的作用。
如果退火温度过高，会导致非特异性引物结合，扩增产物不准确。
反之，如果退火温度过低，可能导致引物无法结合，扩增效率低下。
如何选择适当的退火温度选择适当的退火温度是关键。
下面是一些选择退火温度的关键考虑因素：引物设计合适的引物设计是PCR成功的基础。
引物的长度、碱基组成以及Tm值（解离温度）都会影响退火温度的选择。
通常，引物的Tm值会与退火温度相差约5°C。
引物之间的Tm值差异过大可能会导致扩增产物的偏倚，因此需要确保引物的设计合理。
目标序列的碱基组成目标序列的碱基组成可能导致退火温度的微调。
富含GC的序列通常需要较高的退火温度，而富含AT的序列需要较低的退火温度。
因此，在选择退火温度时，需要对目标序列的碱基组成进行分析，并进行适当的微调。
目标产物的长度目标产物的长度也会影响退火温度的选择。
通常情况下，较长的DNA序列需要更高的退火温度，而较短的序列可以使用较低的退火温度。
因此，在选择退火温度时，需考虑目标产物的长度，并根据需要进行调整。
使用缓冲液和酶的要求不同的PCR缓冲液和酶对退火温度的要求可能不同。
因此，在进行PCR反应时，建议参照所使用的缓冲液和酶的说明书，以选择最佳的退火温度。
总结选择适当的退火温度是PCR成功的关键之一。
合适的退火温度可以保证扩增产物的特异性和产量。
在选择退火温度时，需要考虑引物设计、目标序列的碱基组成、目标产物的长度以及使用的缓冲液和酶的要求。
PCR程序设计原则
PCR程序设计原则PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于基因检测、疾病诊断和基因工程等领域。
对于PCR实验，一个良好设计的程序可以提高反应效率、准确性和重复性。
以下是一些PCR程序设计的原则。
温度和时间的优化PCR反应在不同的温度下进行，其中最重要的是变性、退火和延伸的温度。
变性温度通常设定在94至98摄氏度，以使DNA双链解开成为单链。
退火温度根据引物设计的熔解温度（Tm值）确定，通常为50至65摄氏度。
延伸温度则为50-75摄氏度，具体取决于扩增片段长度和聚合酶的反应特性。
此外，在PCR反应中，温度保持和时间控制也是非常重要的。
温度过低会导致引物无法结合到目标DNA上，温度过高会使引物结合不稳定。
时间控制则可以在特定的阶段完成DNA复制的不同步骤。
通过优化温度和时间，可以提高PCR反应的效率和特异性。
引物设计引物是PCR反应中的关键因素之一。
引物设计要求具有独特性和特异性，避免与非目标DNA序列结合。
引物应具有合适的长度、Tm值和碱基组成，以确保在PCR反应中的特异性和稳定性。
通常情况下，引物的长度应在18-25个碱基对之间，Tm值应在50-65摄氏度之间。
合理的引物设计可以提高PCR反应的特异性和灵敏性，减少非特异扩增的产生。
DNA模板的选择和纯化DNA模板是PCR反应的起始物质，其质量和纯度对PCR反应结果至关重要。
选择高质量的DNA模板可以减少PCR反应中的假阳性和假阴性结果。
通常使用基因组DNA、cDNA或质粒DNA作为模板，并通过DNA提取和纯化技术去除潜在的PCR抑制物质和杂质。
防止污染和交叉污染在PCR实验中，污染和交叉污染是常见的问题。
为了避免这些问题，实验操作需要严格按照无菌操作的要求进行。
使用无菌工具和试剂，定期换手套和使用单次性试剂，以防止样品之间的交叉污染。
此外，为了避免污染，可以设置阴性对照组，确保反应管中没有外源性DNA污染。
必要时，还可以使用UV辐射消毒仪器和试剂等措施。
PCR的退火温度选择
熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT,对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
退火温度取决于引物长度及序列，GC含量越高退火温度越高，引物的Tm值减去5-8度即是引物的退火温度，引物的Tm值一般都会在引物合成单上体现，如果没有的话可以在网上搜个引物退火温度计算器输入序列就可以了。
退火时间一般都是30秒。
试试下载一个Oligo6.0，这个软件挺不错的，在计算出来的退火温度基础上上下幅度一点是没有什么问题的bioxm2.6 更专业软件很小很方便更能还挺强大我们刚做了PCR实验，当引物长度小于25bp时，退火温度通过（Tm-5）℃计算，Tm=4（G+C）+2（A+T）增加PCR的特异性：1. primers design这是最重要的一步。
退火温度的选择
另一种说法：熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。
具体从多少度到多少度，要看你这对引物的Tm值，如果两个引物Tm值不高，可以设置48-60的梯度；否则可以设置58-70度的梯度；如果两个引物的Tm中等，则可以设置53-65的梯度范围，具体情况灵活掌握。
传统梯度PCR仪中是可以放置12个样品进行梯度的，需要注意的是每个相邻两孔间的温度差异是不等的，尤其是第2、3孔与第1孔接近，第10、11孔与第12孔接近。可以舍弃第2、2、10、11孔，只在第1、4、5、6、7、8、9、12孔中放置共8个样品，孔间温度变化几乎呈真正的梯度状。
或者为了提高特异ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
另外，由于PCR仪的不同，注意其退火温度的设定：一般的PCR仪允许设置跨度12-15度的梯度范围，所以你的梯度范围尽可能设置宽一点，争取一轮梯度就可以确定最佳可用退火温度。
引物退火温度
1、退火温度低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值（Tm值=4(G+C)
+2(A+T)）为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。
然后在此次实验基础上做出预估。
退火温度对PCR的特异性有较大影响。
2、延伸时间：1min/kb(10kb内）。
引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。
但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。
扩展资料
PCR的过程：
1、DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA
2、退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。
pcr退火温度和tm值
pcr退火温度和tm值PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于基因克隆、基因组测序、疾病诊断等领域。
在PCR过程中，PCR退火温度和Tm值是两个关键参数，对PCR反应的结果和放大的片段长度有重要影响。
本文将简要介绍PCR退火温度和Tm值的概念、影响因素以及如何选择合适的退火温度和Tm值。
一、PCR退火温度PCR退火温度是指PCR反应中的退火步骤中的温度。
在PCR反应中，退火温度用于使引物与待扩增DNA模板进行特异性的结合。
合适的退火温度可以提高特异性，同时避免非特异性扩增产物的形成。
退火温度的选择通常是根据引物的长度、碱基组成和突变位点等因素来确定的。
一般来说，引物长度越长、碱基组成越高，退火温度就应该相应增加。
此外，PCR反应的离子浓度和缓冲液的成分也可以影响退火温度的选择。
在实际操作中，可以通过温度梯度PCR或退火温度优化实验来确定最适合的退火温度。
通过逐渐改变退火温度，可以找到一个在特异性和产物产量之间达到平衡的温度。
这个温度就是最适合的退火温度。
二、Tm值Tm值是DNA的熔解温度，也称为退火温度或中间温度。
在PCR反应中，Tm值用于估计引物与模板DNA的相互结合和解离的温度。
Tm值的计算可以根据引物的碱基组成、长度和盐离子浓度等来进行。
常用的计算公式包括Wallace公式、Nearest-neighbor公式等。
这些公式根据碱基对之间的热力学参数进行计算，并给出引物的Tm值。
Tm值的选择也需要考虑到实验条件和所需的PCR产物。
通常情况下，选择的Tm值应该比PCR退火温度稍高，以确保引物在退火步骤中与目标DNA模板充分结合。
如果Tm值过高，可能导致引物与非特异性DNA序列结合，从而产生非特异性扩增产物。
三、选择合适的退火温度和Tm值选择合适的退火温度和Tm值是进行PCR实验的关键。
从前面的介绍中可以看出，退火温度和Tm值的选择需要考虑引物、模板DNA的特性，以及实验条件等。
PCR的退火温度选择
熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT,对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
退火温度取决于引物长度及序列，GC含量越高退火温度越高，引物的Tm值减去5-8度即是引物的退火温度，引物的Tm值一般都会在引物合成单上体现，如果没有的话可以在网上搜个引物退火温度计算器输入序列就可以了。
退火时间一般都是30秒。
试试下载一个Oligo6.0，这个软件挺不错的，在计算出来的退火温度基础上上下幅度一点是没有什么问题的bioxm2.6 更专业软件很小很方便更能还挺强大我们刚做了PCR实验，当引物长度小于25bp时，退火温度通过（Tm-5）℃计算，Tm=4（G+C）+2（A+T）增加PCR的特异性：1. primers design这是最重要的一步。
PCR的退火温度选择
熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT,对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
退火温度取决于引物长度及序列，GC含量越高退火温度越高，引物的Tm值减去5-8度即是引物的退火温度，引物的Tm值一般都会在引物合成单上体现，如果没有的话可以在网上搜个引物退火温度计算器输入序列就可以了。
退火时间一般都是30秒。
试试下载一个Oligo6.0，这个软件挺不错的，在计算出来的退火温度基础上上下幅度一点是没有什么问题的bioxm2.6 更专业软件很小很方便更能还挺强大我们刚做了PCR实验，当引物长度小于25bp时，退火温度通过（Tm-5）℃计算，Tm=4（G+C）+2（A+T）增加PCR的特异性：1. primers design这是最重要的一步。
PCR的退火温度选择
熔解温度(Tm）是引物的一.个重要参数..这是当50。
％的引物和互。
补序列表现为双链DNA 分子时的。
温度.Tm对于设。
定PCR退火温度是必。
需的。
在理想状态。
下，退火温度足.够低，以保证引物。
同目的序列。
有效退火，同时还要足够高，以减少非特。
异性结合。
合理的退火。
温度从55℃到70℃。
退火温度一.般设定比引.物的 Tm低5℃.设定Tm有。
几种公式。
有的是来源。
于高盐溶液中的杂交，适用于小于。
18碱基的.引物。
有的是根据.GC含量估.算Tm.确定引物T。
m最可信的方法是近邻。
分析法.这种方法从.序列一级结。
构和相邻碱。
基的特性预。
测引物的杂交稳定性.大部分计算。
机程序使用。
近邻分析法.根据所使用.的公式及引.物序列的不.同,Tm会差异。
很大。
因为大部分公式提供一。
个估算的T。
m值,所有退火温度只是一个。
起始点。
可以通过分.析几个逐步.提高退火温.度的反应以。
提高特异性。
开始低于估。
算的Tm5。
℃,以2℃为增量，逐步提高退。
火温度.较高的退火。
温度会减少。
引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳。
结果，两个引物应.具有近似的.Tm值。
引物对的T。
m差异如果.超过5℃，就会引物在循环中使用。
较低的退火温度而表现。
出明显的错。
误起始。
如果两个引。
物Tm 不同,将退火温度。
设定为比最.低的Tm低.5℃或者为了提。
高特异性,可以在根据。
较高Tm设。
计的退火温。
度先进行5个循环，然后在根据.较低Tm设计的退火温度进行剩余。
的循环。
这使得在较为严紧的条.件下可以获。
得目的模板.的部分拷贝。
当引物长度.低于20个。
bp可以根据Tm=3GC+2AT，对于更长的。
寡聚核苷酸。
，Tm计算公.式为：Tm = 81.5 + 16。
6 x Log10。
［Na+] + 0.41 (%GC）– 600/size公式中，Size = 引物长度.退火温度取.决于引物长.度及序列，GC含量越。
高退火温度。
越高，引物的Tm。
值减去5—8度即是引物的退火温。
递减PCR
在刚下降到特异性结合可以进行的最高温度时，特异 性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的 循环中继续扩增占据优势,并会将扩增的非特异性产物 排挤出去。
应用
递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度 的方法较为有用，如AFLP DNA指纹分析。 递减合使用， 用来推出一段已知肽链的氨基酸序列所对应的DNA碱 基序列。
热启动： 通过抑制一种基本成分延迟DNA合 成， 直到PCR仪达到变性温度。
尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶 在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程 中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会 产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就 会被有效扩增。 Platinum Taq DNA聚合酶的成分为复合有抗Taq DNA聚 合酶单克隆抗体的重组Taq DNA聚合酶。抗体在PCR配 制，以至于在室温的延时保温过程中抑制酶的活性。 Taq DNA聚合酶在变性步骤的94℃保温过程中被释放到 反应中，恢复了完全的聚合酶活性。
递减PCR （TouchDown PCR）
递减PCR
定义 原理 应用 比较
定义：递减PCR(touchdown PCR)是一种 PCR优化方法。用来避免非特异性序列 的扩增。
原理：PCR中引物的退火温度决定了退火的特异 性，温度越高特异性越强，但过高则不能实 现引物和模板的结合，而过低会产生大量非 特异性产物。因此进行PCR时需要寻找合适的 退火温度。 递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严紧的 退火条件提高特异性。循环开在比估算的Tm 高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环 降低1℃到2℃，直到退火温度低于Tm 5℃。
与其他PCR比较
梯度PCR：就是按温度梯度将多个的PCR反应放在一 起做。可以很快的找出最适合的退火温度。 巢式PCR：巢式PCR使用两对PCR引物扩增完整的片 段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相 似。第二对引物称为巢式引物同第一套引物内侧的 靶序列结合。 巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性， 因为同两套引物都互补的靶序列很少因此，巢式PCR 的扩增非常特异，同时减少了错误片段的产生。 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA） 的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5' RACE）的特 异性。
Touchdown-PCR的退火温度设计原则
Touchdown-PCR的退火温度设计原则Touchdown PCR退火温度的设计原则①降落PCR是在同一个pcr管内进行PCR，只是每个循环的温度不同(如每个循环降1度)。
一般兼并引物用这种方法多些。
②设计多循环反应的程序，以使相连循环的退火温度越来越低。
由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平，用于确保第一个引物—模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。
尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后(非特异)PCR产物的地位。
③由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在TD—PCR中最好应用热启动技术。
设计时，退火温度的范围应跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃。
④例：一对没有简并的引物—模板的计算Tm值为62℃。
则：从65℃—>50℃(每2cycles降退火温度1℃)，再在50℃退火温度下做15个循环。
实验中如持续出现假象带(杂带)，则是因为起始退火温度太低，或目的扩增产物和非目的产物的Tm值相差无几，或非目的扩增物以更高的扩增效率扩增，可把退火温度每降低1℃所需的循环数增加到3或4。
⑤touchdown PCR是为了增加反应的特异性，降低非特异产物的产生。
在整个反应过程是一个温度由高到低的过程，在温度降低的过程中，会出现一个温度是上下游引物最适的退火温度，大量引物与模板结合，由此产生特异性产物；温度继续降低时，未结合的引物已很少或没有，非特异性产物就很少或没有。
设置温度时，高温以Tm较高的引物为准，低温以Tm较低的引物为准.我常用的程序是：65C----50C, 1C/2s(2s 降低1度）⑥降落PCR（touchdown PCR），一种PCR技术，主要用于PCR的条件的优化。
在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行，例如特异性不够易错配等。
PCR的退火温度选择
PCR的退火温度选择熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。
这是当％的引物和互补序列表现为双链A分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从℃到7 ℃。
退火温度一般设定比引物的 Tm低℃。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据G C含量估算Tm。
确定引物m最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的m 值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的T m值。
引物对的m差异如果超过℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm 低℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
当引物长度低于20个b p可以根据Tm=3GC+2AT,对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
退火温度取决于引物长度及序列，GC含量越高退火温度越高，引物的值减去5-8度即是引物的退火温度，引物的值一般都会在引物合成单上体现，如果没有的话可以在网上搜个引物退火温度计算器输入序列就可以了。
退火时间一般都是秒。
试试下载一个o6.0，这个软件挺不错的，在计算出来的退火温度基础上上下幅度一点是没有什么问题的2.6 更专业软件很小很方便更能还挺强大我们刚做了P CR实验，当引物长度小于2 p时，退火温度通过（Tm-5）℃计算，Tm=4（G+C）+2（A+T）增加的特异性：n这是最重要的一步。
PCR的退火温度选择
熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT,对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
退火温度取决于引物长度及序列，GC含量越高退火温度越高，引物的Tm值减去5-8度即是引物的退火温度，引物的Tm值一般都会在引物合成单上体现，如果没有的话可以在网上搜个引物退火温度计算器输入序列就可以了。
退火时间一般都是30秒。
试试下载一个Oligo6.0，这个软件挺不错的，在计算出来的退火温度基础上上下幅度一点是没有什么问题的bioxm2.6 更专业软件很小很方便更能还挺强大我们刚做了PCR实验，当引物长度小于25bp时，退火温度通过（Tm-5）℃计算，Tm=4（G+C）+2（A+T）增加PCR的特异性：1. primers design这是最重要的一步。
PCR的退火温度选择
熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT,对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
退火温度取决于引物长度及序列，GC含量越高退火温度越高，引物的Tm值减去5-8度即是引物的退火温度，引物的Tm值一般都会在引物合成单上体现，如果没有的话可以在网上搜个引物退火温度计算器输入序列就可以了。
退火时间一般都是30秒。
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PCR的退火温度选择
熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT,对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
退火温度取决于引物长度及序列，GC含量越高退火温度越高，引物的Tm值减去5-8度即是引物的退火温度，引物的Tm值一般都会在引物合成单上体现，如果没有的话可以在网上搜个引物退火温度计算器输入序列就可以了。
退火时间一般都是30秒。
试试下载一个Oligo6.0，这个软件挺不错的，在计算出来的退火温度基础上上下幅度一点是没有什么问题的bioxm2.6 更专业软件很小很方便更能还挺强大我们刚做了PCR实验，当引物长度小于25bp时，退火温度通过（Tm-5）℃计算，Tm=4（G+C）+2（A+T）增加PCR的特异性：1. primers design这是最重要的一步。
退火温度的选择1则
退火温度的选择1则以下是网友分享的关于退火温度的选择的资料1篇，希望对您有所帮助，就爱阅读感谢您的支持。
PCR的退火温度选择（1）熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT,对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
退火温度取决于引物长度及序列，GC含量越高退火温度越高，引物的Tm值减去5-8度即是引物的退火温度，引物的Tm值一般都会在引物合成单上体现，如果没有的话可以在网上搜个引物退火温度计算器输入序列就可以了。
pcr退火温度范围
pcr退火温度范围PCR（聚合酶链反应）是一种在分子生物学领域广泛应用的技术，它能够在体外快速复制DNA序列。
在PCR过程中，退火温度是一个非常重要的参数，它决定了引物与目标DNA序列的匹配情况，从而影响了PCR反应的特异性和产物的质量。
本文将探讨PCR退火温度的范围以及对PCR反应的影响。
PCR反应通常由三个步骤组成：变性、退火和延伸。
在退火步骤中，引物与目标DNA序列结合，从而为DNA聚合酶提供合成新链所需的起始点。
在PCR反应中，退火温度是一个关键参数，它必须选择得恰到好处，以确保引物与目标DNA序列的特异性结合。
退火温度的选择取决于引物的长度、碱基组成和目标DNA序列的特性。
一般来说，退火温度应该略低于引物的熔解温度（Tm），以确保引物能够与目标DNA序列完全匹配。
引物的Tm可以通过计算公式来估算，其中包括引物长度、碱基组成和盐离子浓度等因素。
根据实际经验，退火温度通常在50-65摄氏度之间。
如果退火温度选择过高，引物可能会与非特异性DNA序列结合，导致PCR反应的特异性下降。
此外，高温还可能引发引物的非特异性延伸，从而产生错误的PCR产物。
因此，在选择退火温度时，需要谨慎考虑引物的特异性和PCR反应的特殊要求。
相反，如果退火温度选择过低，引物与目标DNA序列的结合可能不稳定，从而影响PCR反应的效果。
此外，低温下引物的特异性结合能力可能降低，使得非特异性引物也能与目标DNA序列结合，从而产生错误的PCR产物。
因此，在选择退火温度时，需要确保引物与目标DNA序列的稳定结合。
除了引物与目标DNA序列的特异性结合外，退火温度还会影响PCR 反应的产物质量。
一般来说，较高的退火温度有助于增加PCR产物的特异性和纯度，从而提高PCR反应的准确性。
但是，过高的退火温度可能会导致PCR产物的数量减少，因此需要在保证特异性的前提下选择合适的退火温度。
PCR退火温度的选择对于PCR反应的特异性和产物质量至关重要。
引物设计退火温度,gc含量,长度
引物设计退火温度,gc含量,长度
本文将讨论如何设计引物的退火温度、GC含量以及长度。
引物
是PCR反应中的重要组成部分，其设计质量直接影响PCR反应的成功率和特异性。
因此，合理的引物设计对于PCR实验的成功至关重要。
首先，引物的退火温度是影响PCR反应特异性的重要因素。
退火温度过高会导致引物与非特异性的DNA结合，从而降低PCR反应特异性。
退火温度过低则会导致引物无法与目标DNA结合，影响PCR反应的灵敏度。
因此，引物的退火温度应该在50℃-65℃之间，一般情况下，引物的退火温度应该以引物的长度、序列及GC含量等因素为基础，根据实验者的经验和调整，最终确定。
其次，引物的GC含量也是影响PCR反应特异性的重要因素。
GC
含量过高或过低都会影响引物与目标DNA的互补性，从而影响PCR反应的特异性和灵敏度。
一般情况下，引物的GC含量应该在40%-60%
之间，如果引物长度较短，可降低GC含量，反之，则可增加GC含量。
需要注意的是，引物序列中不应该出现连续的GC或AT碱基，这会影响引物的互补性。
最后，引物的长度也是影响PCR反应特异性和灵敏度的重要因素。
引物长度过短会导致引物与非特异性DNA结合，影响PCR反应的特异性。
引物长度过长则会影响PCR反应的灵敏度。
一般情况下，引物长度应该在18-24个核苷酸之间。
综上所述，引物的退火温度、GC含量和长度是影响PCR反应特
异性和灵敏度的关键因素，实验者需要根据引物设计的目的和实验需
求，合理设计引物的这三个参数。
PCR退火时间怎么确定
PCR退火时间怎么确定PCR（聚合酶链式反应）是生物学和分子生物学中常用的实验技术，能够对DNA进行扩增，从而大量产生目标片段。
PCR的一个重要步骤是退火（Annealing），它决定了引物与DNA模板的结合，并且在PCR的成功与否以及所需的信噪比方面起着至关重要的作用。
要确定PCR退火时间，需要考虑以下几个因素：1. 引物设计引物是PCR扩增的关键。
在设计引物时，需要考虑引物的长度、碱基组成、引物之间的配对和反向互补性等因素。
引物的Tm值（退火温度）是一个重要参数，它表示引物与DNA模板的结合和解离的平衡温度。
通常，引物的退火温度（也就是PCR反应的退火温度）要比引物的Tm值略低2-5℃。
2. DNA模板PCR反应需要一定的DNA模板作为扩增的起点。
不同的DNA模板可能对退火时间有不同的要求。
对于模板含量较高的样品，退火时间可以相对较短。
而对于模板含量较低的样品，为了增加目标片段的信号强度，退火时间可能需要相对较长。
3. 聚合酶的选择在PCR反应中，聚合酶是起到扩增DNA段的关键因素。
不同的聚合酶适用于不同的PCR反应条件。
一些高保真性的聚合酶可能需要较高的退火温度和较长的退火时间，以确保特异性扩增。
而一些热稳定性较差的聚合酶可能需要较短的退火时间，以防止失活。
4. 初始退火温度和退火时间的优化对于确定退火时间，可以进行一系列的实验来优化反应条件。
可以根据引物的Tm值和初始反应条件，尝试不同的退火温度和退火时间的组合。
然后通过检测PCR产物的强度和特异性来评估退火条件的效果。
在这个过程中，可以逐渐缩小退火时间的范围，以找到最佳的退火时间。
总之，PCR退火时间的确定需要考虑引物设计、DNA模板、聚合酶选择以及通过实验优化退火条件。
合理确定退火时间可以提高PCR反应的特异性和产物的信噪比，进而保证实验结果的准确性。
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Touchdown PCR退火温度的设计原则
①降落PCR是在同一个pcr管内进行PCR，只是每个循环的温度不同(如每个循环降1度)。
一般兼并引物用这种方法多些。
②设计多循环反应的程序，以使相连循环的退火温度越来越低。
由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平，用于确保第一个引物—模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。
尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后(非特异)PCR产物的地位。
③由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在TD—PCR中最好应用热启动技术。
设计时，退火温度的范围应跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃。
④例：一对没有简并的引物—模板的计算Tm值为62℃。
则：从65℃—>50℃(每2cycles降退火温度1℃)，再在50℃退火温度下做15个循环。
实验中如持续出现假象带(杂带)，则是因为起始退火温度太低，或目的扩增产物和非目的产物的Tm值相差无几，或非目的扩增物以更高的扩增效率扩增，可把退火温度每降低1℃所需的循环数增加到3或4。
⑤touchdown PCR是为了增加反应的特异性，降低非特异产物的产生。
在整个反应过程是一个温度由高到低的过程，在温度降低的过程中，会出现一个温度是上下游引物最适的退火温度，大量引物与模板结合，由此产生特异性产物；温度继续降低时，未结合的引物已很少或没有，非特异性产物就很少或没有。
设置温度时，高温以Tm较高的引物为准，低温以Tm较低的引物为准.
我常用的程序是：65C----50C, 1C/2s(2s 降低1度）
⑥降落PCR（touchdown PCR），一种PCR技术，主要用于PCR的条件的优化。
在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行，例如特异性不够易错配等。
退火温度过高会使PCR效率过低，但退火温度过低则会使非特异扩增过多。
这虽然可以通过反复尝试来优化，但费时费力。
降落PCR提供了一个较为简易的优化方法。
其原理大致是这样的。
首先在较高的温度下扩增，此时虽然扩增效率低，但非特异扩增基本没有。
随着退火温度的降低，非特异扩增会逐步增多。
但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势，因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制，从而大幅提高PCR的特异性和效率。
PCR加产物平末端加Ａ方法
背景：高保真PCR酶利用自身的3’→5’外切酶活性（pfu DNA Polymerase，PrimeSTAR HS DNA Polymerase等）能保证PCR产物的保真度，但扩增的PCR产物为不带A尾的平末端DNA片段，不能直接TA克隆。
因此，平末端DNA片段需要进行加A后方可TA克隆。
平末端DNA加A的步骤一般是先纯化PCR产物，加入dATP Buffer利用Taq DNA polymerase在平末端片段后加上A尾后才能与T载体的T头互补连接TA克隆。
步骤较为烦锁，要购买特定的dATP Buffer。
方法改进：平末端DNA片段加A方法根据实验者的技能程度推荐两种方法：（1）保守法，先对平末端PCR产物纯化后，浓度要求至少20ng/ ul（大概就好，跑胶图像条带清晰，明亮），取14.5 ul PCR产物，加入2 ul Taq Buffer，3ul dNTP，0.5 ul Taq酶，在72度反应10~20min, 后直接回收纯化加A尾的DNA片段可用于TA克隆，此方法操作容易，成功率高；（2）快速法，高保真酶PCR后的管子（体系为50ul）不用先纯化直接加入3ul dNTP 和0.5 ul Taq酶继续72度反应10~20min，此后直接回收或跑胶回收纯化加A尾的DNA片段可用于TA克隆，此方法操作步骤较少和方便，节省实验时间和实验经费。
结果：推荐的两种方法均能使平末端DNA片段加A尾，方便TA克隆。
另外，使用dNTP 代替dA TP，节省实验经费.。