酶标抗体技术(完整资料).doc
酶标抗体抗原
雅安职业技术学院
HRP催化的反应式为：
DH2十H2O2—D十2H20
DH2为供氢体，习惯称为底物，H2O2为受氢体 HRP对受氢体的专一性很高，作用底物有多种。
雅安职业技术学院
邻苯二胺 OPD
HRP常用底物
四甲基联苯胺 TMB 5-氨基水杨酸5-ASA
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑 啉磺酸-6)铵盐 ABTS
雅安职业技术学院
二、酶联免疫吸附试验的类型
（一）双抗体夹心法检测抗原 1.原理
将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相 应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合 成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成 固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后 的显色程度确定待检抗原的含量。
雅安职业技术学院
雅安职业技术学院
（一）辣根过氧化物酶
（horseradish peroxidase ,HRP）
1.ELISA中应用最为广泛的标记用酶
2.糖蛋白（主酶） 主酶与酶活性无关
亚铁血红素（辅基） 辅基是酶的活性中心
3.RZ值：403nm(辅基)与275nm(主酶)OD值之比
4.RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要
雅安职业技术学院
2．戊二醛交联法 戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与 酶和抗体（抗原）分子上的氨基结合。该法有一 步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶 标记物质量较均一。
雅安职业技术学院
（二）酶标记物的纯化与鉴定
1．酶标记物的纯化 标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游
离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物， 避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原) 的竞争作用。
双抗体夹心法检测抗原
酶标记抗体
酶标记抗体
产品概述：
酶标记抗体,是一类广泛用于生物学和医学科学的许多领域，具有高特异性、高敏感性和安全的免疫化学试剂。
目前较为常用的辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体就是其中的一种，它是经过化学方法将辣根过氧化物酶（HRP）标记在抗体IgG分子上而制成的HRP－抗体结合物。
我公司向用户提供的各类辣根过氧化物酶标记产品均为本公司自主研发的产品，HRP 购于美国SIGMA公司的产品，根据本公司建立的目前较先进的过碘酸钠氧化法标记技术而成。
每种成品已加入一定浓度的BSA作为稳定剂。
产品的工作浓度根据方法不同而别，用前最好-20℃冻存，避免反复冻融。
应用范围：
应用于抗原决定族的抗原性分析鉴定，各种抗原、抗体的定量、定性及定位分析测定等。
工作中应注意的问题：
1、包被抗体或抗原不适，易产生阳性值较小，或产生变异，即跳管现象。
2、用抗血清不纯化，或纯化程度太低的抗体包被，则阳性值较小，或没有阳性梯度。
3、封闭不好或标记物过浓可产生对照较高。
主要性能：
每只0.1ml液体，内含IgG约1mg/ml，1% BSA，0.01%庆大霉素。
-20℃保存，稳定期一年。
4℃保存约3～6个月，4℃可30天左右。
稀释液为：0.01mol/L pH7.4PBST。
工作效价：
ELISA法：1：5000～10000
免疫印迹法：1：500～5000。
抗原、抗体酶标记技术
抗原、抗体酶标记技术-转自博升生物酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体，酶标记的抗原或抗体称为结合物（conjugate）。
抗原由于化学结构不同，可用不同的方法与酶结合，如为蛋白质抗原，基本上可参考抗体酶标记的方法。
酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，作为抗体标记的酶常用的有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP），不同的酶标记方法也不相同。
1、辣根过氧化物酶（HRP）标记辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）广泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉（辅基）构成一种糖蛋白（含糖18%）。
此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。
由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。
辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。
为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。
标记步骤：(1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4)加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。
(5)加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混匀，再置4℃2小时。
(6)将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜。
ELISA检测方法操作要点
ELISA检测方法操作要点ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫化学检测方法，用于检测体液或体内细胞中的特定抗原或抗体。
ELISA技术的成熟和广泛应用使得它成为临床、生物学和分子生物学研究中常用的检测方法之一、以下是ELISA检测方法操作要点的详细说明：1.样品准备：-合理选择样品：根据实验目的，选择合适的样本类型，如血清、血浆、尿液、细胞提取物等。
-样品储存：样品应储存在适当的温度下，并避免反复冻融，以防止抗原或抗体的降解。
2.酶标板涂层：-选择合适的酶标板：常用的有96孔和384孔酶标板，根据实验需要进行选择。
-涂层溶液制备：根据实验方案中的要求，配制相应浓度的涂层溶液，如抗体或抗原。
-涂层操作：将涂层溶液加入酶标板孔中，静置一段时间，使其充分吸附在孔壁上，再进行废液排空和孔洗涤。
3.酶标抗体制备：-选择合适的酶标抗体：根据实验目的和需要，选择适当的酶标抗体。
-酶标抗体质量控制：酶标抗体应经过质量控制，并充分稀释到合适的浓度。
4.样品孔加样：-样品孔设置：根据实验设计，将需要检测的样品和相应质控品按照实验要求加到酶标板中。
-操作要点：如实验要求，控制加样量、加样顺序和均匀性，避免交叉污染。
5.洗涤步骤：-洗涤缓冲液：选择适当的洗涤缓冲液，用于洗涤酶标板孔，去除非特异性结合物质。
-洗涤方法：进行洗涤时，操作要轻柔而均匀，避免产生气泡。
6.标记抗体操作：-选择合适的标记抗体：标记抗体一般选择与目标抗原或抗体不同的免疫球蛋白。
-标记抗体质量控制：标记抗体应经过质量控制，并充分稀释到合适的浓度。
7.显色反应：-底物选择：根据实验方案，选择合适的底物，以产生特定的颜色反应。
-反应时间：根据实验方案，控制好反应时间，过长过短都可能对结果造成影响。
8.反应终止：-反应终止剂选择：根据实验要求，选择合适的反应终止剂，以停止酶反应。
-反应终止时间：反应终止剂一般在反应完成后加入，在规定的时间内进行终止。
酶标抗体技术
酶标抗体制备技术基本要求是将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的生物化学活性。
用于标记抗体的酶较多，常用的有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和β-半乳糖苷酶等。
（一）辣根过氧化物酶标抗体制备技术辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）广泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉（辅基）构成一种糖蛋白（含糖18%）。
此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。
HRP分子量较小（40kDa），标记物容易穿透入细胞内部；作用底物为H2O2，以二氨基联苯胺（DAB）为供氢体的反应产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光镜观察；在～12范围内稳定，对热及有机溶剂的作用亦较稳定，能耐受63℃加热15min；用甲苯与石腊包埋切片处理或用纯乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影响其活性；溶解性好，100mL缓冲盐溶液中可溶解5gHRP，并可溶解于62%饱和度以下的硫酸铵溶液中，故常用硫酸铵分级沉淀法分离纯化；氰化物、硫化物、氟化物、及叠氮化物等对HRP的活性有抑制作用，应避免使用NaN3作为酶标试剂的防腐剂，以防止失活。
凡能在HRP和H2O2存在时被酶催化H2O2反应而和成有色产物的化合物（供氢体）都可以用显色剂。
供氢体的产物分不溶性和可溶性两类。
前者最常用的为3，3‘二氨基联苯胺(3,3’diaminobenzidine,DAB)，适用于免疫组化法；反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物；这种多聚物还能还原和螯合四氧化饿，形成具有电子密度的产物，适用电镜检查；此外还有饱和联苯胺溶液，氧化后产物呈黄褐色，多用于酶免疫扩散的深沉线显色。
后者最常用的为邻苯二胺(O-phenylene diamine,OPD)，产物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值为490nm，可用肉眼判别；易被浓酸终止反应，颜色可数小时不变，是ELISA中最常用的一种；但对光敏感，使用时要避光，并发现有致癌作用。
免疫双标技术资料-酶标
免疫双标技术资料：（酶染色法——一般选择HRP和AP）1.石蜡片先脱蜡至水。
2、将切片浸在3％H2O2甲醇溶液（新鲜配制）中15分钟，PBS冲洗2分钟×3次3.根据抗原和标本需要进行适当修复。
4、加血清封闭溶液，室温孵育20分钟，孵育后甩掉多余液体即可。
5、加入一抗一般4度过夜。
6、使用含有0.05％吐温20的PBS，冲洗8分钟×3次7、加入生物素化的二抗，37度孵育30分钟8、使用含有0.05％吐温20的PBS冲洗5分钟×3次9、加入链霉亲和素-AP（Avidin-AP），37度孵育20-30分钟10、使用含有0.05％吐温20的TBS（PH 7.2-7.4）冲洗5分钟×3次11、加配好的AP底物溶液，镜下检测孵育时间12、使用去离子水冲洗终止反应13、加双染阻断剂，室温孵育15分钟。
14、用含有0.05％吐温20的PBS，冲洗2分钟×3次15、加血清封闭溶液，室温孵育20分钟，孵育后甩掉多余液体即可。
16、滴加稀释好的一抗，可以选择37度孵育2个小时。
17、用含有0.05％吐温20的PBS，冲洗5分钟×3次18、加生物素化的二抗，室温孵育30分钟19、使用含有0.05％吐温20的PBS冲洗5分钟×3次20、加链霉亲和素-HRP（Avidin-POD），室温孵育20-30分钟21、使用含有0.05％吐温20的PBS冲洗7分钟×3次22、加DAB，镜下观察，控制显色时间23、显色后去离子水冲洗终止反应24、使用复染试剂染色（根据需要选择）25、脱水，透明，封片，显微镜观察结果。
大鼠心内神经节雌激素受体和免疫因子白介素6的共存[摘要] 目的：研究雌激素受体(ER)和免疫因子白介素6(IL广6)在心内神经节的表达，并证实它们共存的可能性。
方法：免疫细胞化学双重标记技术。
结果：切片上观察到3种细胞：①ER单标细胞，胞核呈棕褐色；②IL-6单标细胞，胞浆呈红色；③ER／IL-6双标细胞，胞核棕褐色，胞浆为红色。
酶标抗体实验报告
一、实验目的1. 掌握酶标抗体实验的基本原理和方法。
2. 学习抗原抗体反应的原理和检测方法。
3. 提高实验操作技能，培养严谨的实验态度。
二、实验原理酶标抗体实验是一种基于抗原抗体反应的免疫学检测方法。
其基本原理是：抗原与抗体特异性结合，形成抗原抗体复合物。
通过酶标记的抗体与抗原抗体复合物结合，使酶催化底物产生颜色变化，从而实现对抗原的定量或定性检测。
三、实验材料1. 试剂：酶标抗体、底物、抗体稀释液、抗原、洗涤液等。
2. 仪器：酶标仪、移液器、培养皿、微量板等。
四、实验方法1. 准备工作（1）将酶标抗体、底物、抗体稀释液、抗原、洗涤液等试剂准备好，并按照说明书配制。
（2）将微量板放置在酶标仪上，设置好实验参数。
2. 实验步骤（1）将抗原加入微量板孔中，每孔加入100μl。
（2）加入酶标抗体，每孔加入100μl，室温孵育30分钟。
（3）加入洗涤液，每孔加入200μl，洗涤3次。
（4）加入底物，每孔加入100μl，室温孵育15分钟。
（5）加入终止液，每孔加入50μl，终止反应。
（6）将微量板放入酶标仪，测定各孔的吸光度（OD值）。
五、结果分析1. 将实验数据输入计算机，进行统计分析。
2. 以抗原浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
3. 根据标准曲线，计算未知抗原的浓度。
六、实验讨论1. 实验过程中，应注意避免交叉污染，确保实验结果的准确性。
2. 实验操作应规范，严格控制时间、温度等条件。
3. 酶标抗体实验具有较高的灵敏度和特异性，但易受外界因素影响，如温度、pH值等。
4. 实验结果受多种因素影响，如抗原质量、抗体质量、底物浓度等，应注意实验条件的优化。
七、实验总结通过本次实验，我们掌握了酶标抗体实验的基本原理和方法，提高了实验操作技能。
同时，我们也认识到实验过程中应注意的问题，为今后的实验研究奠定了基础。
在今后的实验中，我们将继续努力，不断提高实验水平，为我国生物医学事业做出贡献。
酶联免疫标记技术
影响因素
ELISA是利用抗体的选择性和标记酶的化学放大灵敏性而建立起来的,因此,影响ELISA测定结果的因素主要包 括:
1.抗原包被:包被的质量是影响抗原-抗体反应的重要因素。目前蛋白质类抗原的包被技术已经相当成熟,但 是对半抗原,通常采用以半抗原-载体结合物的形式包被。蛋白质(如牛血清白蛋白、卵白蛋白)是最常见的载体, 但存在重现性不好、易和抗体发生交叉反应的缺陷。Verschoor报道用尼龙作为半抗原载体,效果会更好。
2.多项目标物快速测定:利用酶联免疫技术同时对待测样本中的多项目标物进行快速测定,可节省测定时间。 可通过以下两种方法来达到这一目的: ( 1)通过基因工程技术表达特定的融合蛋白质将多种不同蛋白质的功能构 建在一起,可以快速方便地同时检测多项目标物; ( 2)采用几种能够催化各自底物产生不同显色反应的酶分别标 记具有不同特异性的抗体或抗原,反应后用各自的酶底物显色,从而达到同时检测多项目标物。
农药残留检测
应用ELISA检测食品中的残留农药主要为除草剂、杀虫剂和杀菌剂。1993年,王勇等建立了测定三唑酮的 ELISA方法,应用于黄瓜、梨等食品的检测,其最低检出限为40 ng/g,回收率为92.44% ～98.18%,与用气相色谱检 测的结果吻合。1995年,余万俊等用抗杀虫脒单克隆抗体为试剂,建立了间接竞争法、直接竞争法和标记抗原竞争 法3种检测大米中杀虫脒的ELISA,使用直接竞争法的检出限为0.05 ng/g,相对标准偏差为5.1% ～16%。2000年 Watanabe E等用合成的烯菌灵半抗原偶联蛋白质形成大分子免疫原进行免疫生产单克隆抗体,建立了测定柑橘类 水果中烯菌灵的ELISA法。对日本柠檬、柑橘和葡萄柚中烯菌灵的检测限为5 μg/g。
1.高度免疫原性的重组抗原:通过基因工程技术可以快速、批量生产出具有高度免疫原性的重组抗原,用来替 代某些无法从天然材料中分离的抗原物质,进一步扩大了ELISA检测范围。重组抗原在纯度上要高于通过裂解病原 体所提取的抗原。用于检测的重组抗原有可能最终达到以下两个标准: ( 1)包括所有能引起机体强免疫应答的病 原体抗原决定簇; ( 2)不含或尽可能少含非特异性抗原或共同抗原。
酶标记抗体的制备技术
酶标记抗体的制备技术（一）酶标抗体的条件1．纯度高、含杂蛋白少,用IgG优于血清抗体，用Fab优于IgG。
2．特异性强即抗IgG与IgG在免疫电泳上只有一条沉淀线,与IgG的全血清也只有一条沉淀线,这才算是特异性的单价抗体。
3．效价高一般琼脂扩散鉴定为1︰64以上才算合格。
抗体的可供标记的位点结构图（二）酶标记方法1．交联法交联法通常用的交联剂是戊二醛，戊二醛商品大多为25%的水溶液，利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。
标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的OD235nm/OD280nm＜3时，即为好的交联剂。
戊二醛交联法又分为一步法和二步法。
⑴一步法：即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。
然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。
由于抗体分子量大(16万)，酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多，结果生成的抗体－戊二醛或抗体－戊二醛－抗体多而造成酶标物的活性小。
一步法操作：①抗IgG－AKP的制备：将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中，在冰浴中缓缓搅拌，尽量避免气泡产生，完全溶解后，缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的最终浓度为0.2%，移至室温中静置2h~3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4℃充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊二醛，4℃保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱)；②抗IgG－HRP的制备：将12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL，置室温2h~3h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分装后保存于低温冰箱，避免反复冻融。
或冷冻干燥保存。
⑵二步法：是先使酶与戊二醛反应,除去未反应的戊二醛，再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合，最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。
临床免疫学：酶标抗体最佳工作浓度的确定
实验目的
掌握ELISA试验酶标抗体最佳工作浓度 的确定方法。
实验原理
在ELISA试验中，反应试剂工作浓度对结果影ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ响较大，因此必须进行最佳工作浓度的选择。 本实验用人IgG包被酶标板后，加入不同稀释度 的酶标抗人IgG进行ELISA试验，从而确定酶标 抗体的最佳工作浓度。
思考题
在ELISA检测方法中，包被、封闭、洗 涤分别代表什么实验过程，其主要作用是 什么？
试剂与器材
1、酶标板 2、人IgG 3、pH9.6的碳酸盐缓冲液
4、1％BSA
5、HRP-兔抗人IgG 6、ELISA浓缩洗涤液 7、ELISA底物液(分A、B二瓶) 8、ELISA终止液
实验操作
1、用pH9.6的碳酸盐缓冲液将抗原（人IgG）稀释至 1μg/ml，加入酶标板中，每孔100μl，4℃包被过夜；
注意事项
1、洗涤时各孔需加满洗涤液，每次浸泡或振荡1min后 弃去拍干，防止不能洗净。
2、加样时不可太快，避免加在上部和产生气泡。不可重 复加和漏加，或加在两孔之间。
3、蛋白质包被条件的选择：包被PH、温度、时间及蛋 白量对包被效果均有影响。一般多采用pH9.6的碳酸 盐缓冲液4℃包被18～24h,蛋白质包被的最适浓度需 预实验滴定，对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml 。
2、用蒸馏水按1:25稀释浓缩洗涤液;
3、用洗涤液洗涤3次，甩去孔内液体，拍干； 4、每孔中加入1％BSA（用洗涤液配制）200μ1进行封
闭，37℃孵育30 min，用洗涤液洗涤3次，拍干； 5、各孔加入用洗涤液稀释的不同稀释度HRP-兔抗人IgG
（（空白、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、 1:640、1：1280）100μl，37℃孵育30min，洗涤5 次，拍干； 6、显色：每孔先加显色剂A 50μ1，再加显色剂B 50μ1 ，混匀后置37℃孵育10分钟; 7、加终止液终止反应，测定OD450nm,取OD值为1.0左 右的浓度为酶标抗人IgG工作浓度。
酶标抗体技术原理
酶标抗体技术原理酶标抗体技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种广泛应用于生物学和医学研究中的免疫分析技术，用于检测和定量特定抗原或抗体的存在。
ELISA的原理可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA 等几种不同的变体，但它们都遵循相似的基本步骤和原理：1.固定抗原：首先，在实验容器（如酶标板）的表面上固定特定抗原。
这可以通过将抗原直接吸附在容器表面上或使用化学交联剂来完成。
2.样品处理：样品（可能含有待检测抗原或抗体）与固定抗原接触，使待检测物质与抗原结合。
这样，如果待检测的是抗原，那么抗原将与固定的抗体结合；如果待检测的是抗体，那么抗体将与固定的抗原结合。
3.第一次抗体结合：添加与待检测物质特异性结合的第一次抗体。
这个抗体会与样品中的待检测物质结合，形成抗原-抗体复合物。
4.第二次抗体结合：添加与第一次抗体特异性结合的酶标记的第二次抗体。
这个酶标记的抗体将与第一次抗体结合，形成一个二抗-一抗-抗原复合物。
5.酶标记物检测：加入适当的底物，使酶标记的第二次抗体产生染色反应。
底物的选择取决于所使用的酶标记，常见的酶标记有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）。
产生的染色反应可以通过光密度测量仪（spectrophotometer）进行定量测量。
6.结果分析：根据染色反应的强度，可以确定待检测物质的存在和浓度。
一般来说，反应的光密度与待检测物质的浓度成正比。
通过酶标抗体技术，可以检测和定量多种抗原或抗体，广泛应用于医学诊断、药物研发、免疫学研究等领域。
酶标抗体抗原
固相载体
要求
•结合抗体或抗原的容量大 •抗体或抗原牢固地固定在其表面 •不影响免疫反应性 •利于反应充分进行 •固相方法简便易行，快速经济
种类
•塑料制品 •微颗粒 •膜载体
免疫吸附剂
免疫吸附剂 是指与固相载体结合的抗原或抗体
5-氨基水杨酸5-ASA
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并 噻唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS
酶和酶作用底物
HRP的常见底物
OPD反应后显橙 黄色，加酸终止 反应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。
TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中 应用最广泛的底物。
非均相
液相酶免疫测定
均相酶免疫测定
homogenous enzyme immunoassay
用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定
原理 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，
标记酶的活性会发生改变，不用分离结合 和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性 的改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
第一节 酶免疫技术的特点
三三大经大典经标典记标技术记技术
放 射 免 疫 技 术
荧 光 免 疫 技 术
酶 免 疫 技 术
原理及特点
抗原抗体反应的特异性
+
酶高效催化反应的专一性
• 主要试剂: 酶标记的抗体或抗原
• 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性
原理及特点
原理：
酶标抗体（抗原）与抗原 （抗体）的特异性反应
e抗体(HBeAb)的检测
酶标抗体制作
原理：利用交联剂合成抗体—交联剂—HRP 复合物HRP标记抗体的方法酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。
对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。
尤以简易过碘酸钠法更为常用。
戊二醛二步法1.原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。
2.标记步骤：(1)称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜。
(2)反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。
流速控制在1ml/1分钟，收集棕色流出液。
如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。
放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。
(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
(4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。
(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
(7)3000rpm离心半小时，弃上清。
沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
3.结果判定：(1)定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。
然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。
最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节(三)工作浓度的选择)。
(2)定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。
酶量(mg/ml)=OD403nm×0.4IgG量(mg/ml)=OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62酶量(mg/ml)IgG量(mg/ml) 酶量克分子比值=────────÷───────= ───×440,000 160,000IgG量(3)本法标记步骤比较简单，重复性好。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
【最新整理，下载后即可编辑】酶标抗体制备技术基本要求是将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的生物化学活性。
用于标记抗体的酶较多，常用的有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和β-半乳糖苷酶等。
（一）辣根过氧化物酶标抗体制备技术辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）广泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉（辅基）构成一种糖蛋白（含糖18%）。
此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。
HRP分子量较小（40kDa），标记物容易穿透入细胞内部；作用底物为H2O2，以二氨基联苯胺（DAB）为供氢体的反应产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光镜观察；在pH3.5～12范围内稳定，对热及有机溶剂的作用亦较稳定，能耐受63℃加热15min；用甲苯与石腊包埋切片处理或用纯乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影响其活性；溶解性好，100mL缓冲盐溶液中可溶解5gHRP，并可溶解于62%饱和度以下的硫酸铵溶液中，故常用硫酸铵分级沉淀法分离纯化；氰化物、硫化物、氟化物、及叠氮化物等对HRP的活性有抑制作用，应避免使用NaN3作为酶标试剂的防腐剂，以防止失活。
凡能在HRP和H2O2存在时被酶催化H2O2反应而和成有色产物的化合物（供氢体）都可以用显色剂。
供氢体的产物分不溶性和可溶性两类。
前者最常用的为3，3‘二氨基联苯胺(3,3’diaminobenzidine,DAB)，适用于免疫组化法；反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物；这种多聚物还能还原和螯合四氧化饿，形成具有电子密度的产物，适用电镜检查；此外还有饱和联苯胺溶液，氧化后产物呈黄褐色，多用于酶免疫扩散的深沉线显色。
后者最常用的为邻苯二胺(O-phenylene diamine,OPD)，产物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值为490nm，可用肉眼判别；易被浓酸终止反应，颜色可数小时不变，是ELISA中最常用的一种；但对光敏感，使用时要避光，并发现有致癌作用。
用HRP标记抗体需借助交联剂的作用，将酶连接在抗体分子上。
常用的交联剂为过碘酸钠和戊二醛(glutaraldehyde,CHO-(CH2)3-CHO)。
1、改良过碘酸钠法HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成schiff碱。
为了防止酶蛋白的氨基与醛基反应发生自身偶联，在标记前先用2，4-二硝基氟苯（DNFB）封闭酶蛋白中残存的α-和ε-氨基。
酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠(NaHB4）还原成稳定的结合物。
[标记步骤]（1）取5mg HRP溶于0.5mL蒸馏水，加入1%2，4而二硝基氟苯（DNFB）无水乙醇溶液0.1mL，室温（20℃±）下轻微搅拌作用1h。
（2）加入1mL 0.06mol/L NaIO4，室温下避光轻搅30min，溶液呈黄绿色。
（3）加入1mL0.16mol/L乙二醇，室温（20℃±）下轻搅作用1 h，终止氧化反应。
（4）加入5mg抗体（Ig），装入透析袋，置0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液（无水碳酸钠1.5g，碳酸氢钠2.93g,蒸馏水加至1 000 mL）1 000 mL中，4℃透析过夜，更换3次。
（5）取出透析袋中液体（约3 mL），加入5mg/mLNaHB4 0.2 mL 4℃ 2h或过夜。
（6）加50%饱和硫酸铵（NH4）2SO4溶液（硫酸铵850g，蒸馏水加至1 000 mL，以30%氨水调pH7.2）6 mL沉淀结合物，置4℃30min后，3 000r/min离心30min，取深沉（SPA 不需要进行此步）。
（7）将沉淀物溶于PBS（0.02M pH7.4）中，装入透析袋，并以此缓冲液透析平衡6-12h，换液3次。
（8）在结合物内加入BSA至蛋白浓度为10mg/ mL，或加等量60%甘油，测定工作效价后，小量分装（或冻干，不需加甘油），低温保存备用。
2、戊二醛交联法戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂，通过它的两个醛基分别与HRP和抗体蛋白的氨基结合，形成HRP-戊二醛-Ab蛋白结合物。
反应可在4-40℃温度范围，pH6.0～8.0 的缓冲溶液中进行，分为一步法和二步法，戊二醛一步法是将酶和待标记抗体混合，同时加入戊二醛进行交联反应。
戊二醛二步法是将酶先与戊二醛作用，形成酶-戊二醛结合物，结过透析或层析除去未结合的戊二醛，然后再与抗体结合。
[标记步骤]（1）取10mgHRP溶于0.2 mL1.25%戊二醛(用0.01mol/L、pH6.8PB将25%戊二醛稀释为1.25%)，室温（20℃左右）反应结合18h。
（2）用0.15mol/LNaCl平衡过的Sephadex G-50凝胶柱洗脱，除去游离的戊二醛，或用0.01mol/L，pH7.2PBS，4℃透析过夜。
（3）将5mg抗体IgG溶于1mL0.15mol/L NaCl，再与醛化HRP溶液（10mg/mL）混合。
（4）加入0.1mL 1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液（调节pH 至9.0～9.6），4℃，电磁搅拌下结合24h。
（5）加入0.1mL0.2mol/L赖氨酸（0.29g溶于10mL蒸馏水），4℃放置2h，以封闭残留的醛基，终止反应。
（6）装入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2 PBS，4℃透析过夜，或通过Sephadex G-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集第1峰洗脱液，加入等量60%甘油，测工作效价后，小量分装，4℃或-20℃保存。
（二）过氧化物酶简介抗过氧化物复合物制备技术Stemberger(1970)等，首先报道了过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物（peroxidase-antiperoxidase,PAP）法，此法也称为非标记抗体酶法（unlabelled antibody enzymemethod）。
PAP法不需用任何化学交联剂处理酶和抗体，二者活性不受化学反应的影响，可大大提高免疫酶法的灵敏度。
标记步骤（1）取5mL抗HRP血清，16 000r/min 4℃离心20min，取上清液。
（2）加入1mL HRP(2mg/mL)溶液混匀，室温（20℃±）静置1h，16 000r/min，4℃离心20min，取沉淀物。
（3）加冷生理盐水反复洗涤-离心（16 000r/min，4℃离心20min）3次，弃上清，取沉淀物。
（4）加入过量HRP溶液4mL（2mg/mL）混匀后，移至小烧杯内。
（5）在pH计监控下，边搅拌边加入0.1及0.01mol/L HCl 调至pH2.4左右，使沉淀完全溶解。
（6）立即加入0.01mol/LnaOH,调pH7.4，16 000r/min，4℃离心20min，取上清液。
（7）加入1/10体积的0.075mol/L醋酸钠和0.15mol/L 醋酸铵的等量混合液后混匀。
（8）电磁搅拌下逐滴加入等量饱和硫酸铵溶液，并继续搅拌10min，4℃放置20min，16 000r/min，4℃离心20min，去上清，取深沉物。
（9）以50%饱和硫酸铵洗涤，4℃、16 000r/min×20min，离心2次，取深沉物。
（10）加5mL蒸馏水将深沉物溶解后装入透析袋，用Ph6.75醋酸盐缓冲液（13.5L生理盐水、1.5L蒸馏水、75mL 1.5mol/L醋酸钠及75mL粉酶3moL/L醋酸铵）4℃透析3d，每天换液2次。
（11）17 000r/min，4℃离心20min，取上清液进行工作效价鉴定。
（12）加等量60%甘油，小量分装，-20℃保存。
（三）McAb-PAP制备技术用抗HRP McAb制备PAP复合物的工艺条件较为简便，而且不需严格的条件限制。
用小鼠抗HRP McAb制备的腹水，按一定的HRP/IgG克分子比混和，置37℃水浴反应2h，即成鼠PAP复合物。
以按HRP/IgG克分子比为4︰1制备为宜。
（四）碱性磷酸酶标抗体制备技术简介碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP），系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶，由多个同功酶组成。
从小牛肠粘膜提取的AP分子量为100kDa，酶作用的最适pH为9.6；从大肠杆菌中提取酶分子量为80kDa，最适pH为8.0。
它的作用底物较多，常用的酶底物有对硝基本磷酸盐（PNP）、β-甘油磷酸钠、磷酸萘酯等。
AP主要用作双标记染色，研究递质共存及酶名疫测定。
AP标记抗体，一般采用戊二醛作交联剂一步法，使酶和抗体蛋白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。
标记步骤（1）取抗体（2～5mg/mL）1mL，加入AP 5mg溶解。
（2）装入透析袋，用0.01mol/L、Ph7.2PBS4℃透析18h，换液3次。
（3）加入2.5%戊二醛20uL，室温（20℃±）放置2h。
4℃0.01mol/L、pH7.2PBS透析过夜，换液3次。
（4）移入0.05mol/L、pH8.0Tris-HCl缓冲液中，4℃透析过夜，换液3次。
（5）取出标记抗体，用含%BSA和0.02%NaN3的Tris-HCl 缓冲液稀释至4mL，即为酶标记物原液。
（6）加入1/3量纯甘油，测定工作效价后，小量（0.1mL）分装，4℃保存（使用前以pH7.4PBS-吐温溶液将结合物适当稀释）。
（五）碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物制备技术Mason等（1978），用碱性磷酸酶代替过氧化物酶，建立了碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物（APAAP）桥联酶标技术。
但以AP作为抗原用常规免疫方法制备的抗血清，很难达到APAPP桥联酶标技术的质量要求，在一定程度上限制了此项技术的推广使用。
杨志刚等（1989）利用抗AP的McAb建立了一种制备APAAP复合物的简便方法。
只需将AP和抗AP 的McAb以适当比例混合，4℃结合过夜即可使用。
采用改良的ELISA方法检测APAAP复合中AP的最适含量。
具体方法是：用羊抗鼠Ig包被微量滴定板；加入一定量的抗APMcAb；分别加入不同量的AP作用后经过洗涤；加底物显色，测定光密度值（OD）。
在一定范围内，APAAP复合物溶液中AP含量增加的同时，相应的OD值也随之增大；当AP增加到一定量时（约6～8mg/mL）、OD值保持稳定。