生物技术制药：4-抗体工程制药-2

VL
VH
VL
VH
Humanized Antibody with Mouse Loops
VL
VH
Mouse Human
CDR序列 CDR序列
鼠单克隆抗体
人抗体
人源化抗体（该型抗体） 鼠单克隆V区人源化（CDR移植）
➢ 经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原 结合能力保持不变，到现在已有数百种人源化抗 体。
➢ Herceptin(贺赛汀):针对HER-2/neu原癌基因产 物的人/鼠嵌合单抗，特异地作用于HER-2受体过 度表达的乳腺癌细胞
（2）改型抗体（人源化抗体）
1. 将小鼠的CDR（互补决定区）序列移植到人 抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移 植抗体。
重构抗体 (Reshape d Antibody)
鼠VH 人CHБайду номын сангаас
鼠VL 人CL
人-鼠嵌合基因工程抗体
现临床应用的嵌合抗体
➢ Rituxan (美罗华,利妥昔单 抗 ) : 第一个人源化单抗， 针对CD20的人/鼠嵌合单抗， 含人IgG1κ恒定区,用于治疗 低度恶性B 淋巴瘤; 抗淋巴 瘤作用主要可能来自于补体 作用、ADCC和诱导肿瘤细 胞凋亡
Rituximab（1997）
已上市人源化改型抗体
➢ 1997年美国批准第一个人源化抗体药物上市，如 今总数已达10个，占上市抗体药物总数的50%， 如
➢ 曲妥珠单抗 (Trastuzum):重组DNA人单克隆抗 体,选择性作用于HER－2
➢ 贝伐珠单抗(Bevacizumab):重组DNA人单克隆 抗体,选择性作用于VEGF
➢ 为了减少嵌合抗体中鼠源性序列，人们又将鼠抗 体V区（H、L链）中的3个超变区基因插入人抗 体的V区的框架（FR）基因中，这样构建的抗体 保留了鼠抗体与抗原结合的特异性。这种抗体几 乎百分之百人源化了。
➢ 异源单抗上六个CDR通过PCR等方法克隆到人抗 体相应的框架区(FR) 上构建成新抗体
Humanizing Antibodies
H链表达载体
L链表达载体
共转染细胞
Fab 抗体分子的制备
抗体分泌细胞
VH
VL
CH1
CL
-S-S-
Fab 抗体分子的制备
➢ Fab抗体易于穿透血管壁和组织屏障进入病灶 ➢ 无Fc段，减少了非特异反应和排斥反应 ➢ 无ADCC和细胞毒CDC ➢ 主要作为载体分子用于导向诊断和治疗
(２)单链抗体(single chain antibody)
MabThera for the treatment of non-Hodgkin-lymphomas
➢ Simulect；（basiliximab 舒莱，巴利西单抗， 诺华)：嵌合性人/鼠抗IL-2受体(CD25)单克隆抗 体,
➢ Remicade：（infliximab,英利昔单抗,抗TNFa 的单克隆抗体），治疗炎性肠症(Crohn氏病),类 风湿性关节炎
（4－3）小分子抗体
➢ 小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最 小识别单位等几种。
➢ 基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的 V区片段，其相对分子质量仅为原抗体的1/801/3。
单区抗体
Fab
最小识别单位
Fv
ScFv
(1)Fab片段抗体：VH+CH1
(2)FV抗体：VH+VL
(3)单链抗体：VH-Linker-VL
第四节 基因工程抗体 (Genetic engineering antibody)
概念：采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球 蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体 细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌 合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体 和双特异性抗体。
目的：一是降低免疫源性； 二是降低相对分子量， 三增加组织通透性。
➢ 人源性可达90%以上
➢ 现在以及未来几年，人源化抗体药物将占有主体 地位。
➢ 目前该方法是人源化单抗最常用、最基本的方法
问题
➢ 改型单抗亲和力仅为原来鼠抗体的亲和力的1/40 ➢ 亲和力下降，亲和力是影响改型单链抗体应用于
临床的重要因素 ➢ 人Ig分子的框架区一些氨基酸与鼠Ig的CDR区不
协调 ➢ 三维蛋白结构等需进一步丰富
VH或VL基因
克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分离， 也可用PCR技术分离。
人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略
启动子
Pr 鼠VH 人 CH
Pr 鼠VL 人 CL
免疫球蛋白 基因载体的构建
H链嵌合载体
L 链嵌合载体
VH+人Igr1载体
VL+人IgCL载体
共转染细胞
➢共转染SP2/0细胞
抗体分泌细胞
➢ 特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了 亲本抗体特异性结合抗原的能力。人源化程度达到 70%左右
➢ 1984年出现嵌合重组技术，1994年批准第一个嵌 合抗体药物上市，至今总数已达6个如：rituxan , simulect ,remicade
可变区基因的获得
杂交瘤细胞
mRNA分离 cDNA RT PCR
(4)单域抗体：VH或VL
小分子抗体有很多优点: ➢ 可以用细菌或酵母菌发酵生产，成本低; ➢ 分子小，穿透力强; ➢ 不含Fc，没有Fc带来的效应; ➢ 在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出; ➢ 易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒
素或酶标抗体等。
(１)Fab
由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下Fab进 入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。
一、单克隆抗体人源化(humanized antibody)
➢ 降低ＨＡＭＡ反应 人一鼠嵌合抗体是将 鼠源单抗的可变区与 人抗体的恒定区融合 而得到的抗体。
（1）嵌合抗体(chimeric antibody)
➢ 从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒 定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞， 表达人-鼠嵌合抗体。
➢ 重组Fab片断是单价的VH-CH（Fd）和轻链的VLCL两个片断由二硫键连接而成。它具有与抗体相 同的抗原结合活性，其特点是结构稳定，制作简
便。细菌表达的Fab与酶解Ig后所获得的Fab具有
相同的功能。
Fab antibody molecule
Pr VH CH1
Pr
VL CL
免疫球蛋白 基因载体的构建