乳酸菌素基因PlnE和PlnF在大肠杆菌中的异源表达
乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达的开题报告
乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶基因的克隆及在大肠
杆菌中的表达的开题报告
本文介绍了乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶（Lactobacillus α-acetolactate synthase，ALS）基因的克隆及在大肠杆菌中的表达。
首先通过PCR扩增获得了该基因的完整序列，并将其克隆到表达载体pET28a 中。
随后将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达，通过SDS-PAGE和Western blotting验证了目标蛋白的表达。
最后对重组表达蛋白进行纯化，并进行酶活测定。
该研究的目的是为了进一步探究乳酸乳球菌中该基因的功能以及在工业上的应用价值。
ALS是乳酸菌合成乳酸的关键酶，其在发酵过程中发挥重要作用。
目前已有许多关于ALS基因的研究，但大多数集中于乳酸菌中，鲜有在大肠杆菌中表达的报道。
因此本研究的结果可以为ALS基因在其他细菌中的表达和应用提供一定的参考价值。
未来的研究可以结合结构及遗传学信息进一步探究ALS的生物学功能，同时还可以将该基因应用于其他乳酸发酵产物的合成中，如乳酸、丙酮酸等。
乳酸菌胞外蛋白水解酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
增胞外蛋白水解酶基因。0.8% 琼脂糖凝胶电泳如图 1 所 示，在 1350bp 附近有一条单一的扩增带，与预期大小 相符。PCR 产物经纯化试剂盒纯化后与载体 pMD18-Tsimple 连接、转化，最后进行质粒小量提取。经电泳 选取其中滞后的质粒进行 Sac Ⅰ、Kpn Ⅰ酶切鉴定，琼 脂糖凝胶电泳结果见图 2。
1.4.4 SDS-PAGE分析 将各个时间诱导收获的菌液菌培养至 OD600nm 为 0.7。
取菌液 1.5mL，4℃离心收集菌体，用生理盐水洗涤两 次，在沉淀菌体中加入 100μL 0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)， 重悬细菌沉淀。加入 100μL 2 × SDS 上样缓冲液，100℃ 煮沸 10min，4℃冷却。取上清 15μL 进行 15% SDS-PAGE 电泳[ 1 6 ] 。
理特征、作用机理、提取及合成方法等进行了广泛的 研究。研究表明，除从天然物质中分离提取以外，还 可以利用蛋白酶水解食品蛋白获得。Oshima 等[3]首次通 过蛋白酶水解食品蛋白中获得 ACEIP。随后在几乎所有 的食品蛋白的单一蛋白酶或多种蛋白酶联合水解物中获 得多种 ACE 抑制肽[4-8]，但该方法具有条件苛刻、设备 要求精良、产量低以及副反应多等缺点，因此难以推 广生产。目前除了蛋白酶水解法以外，微生物发酵法 (特别是乳酸菌发酵法)成为获得 ACEIP 的常用方法，并 显示出良好的开发潜力及应用前景。
Cloning of Extracellular Protease Gene from Lactobacillus and Expression in Escherichia coli
乳酸菌素Gassericin T基因的合成及其在大肠杆菌中的融合表达
肠 杆菌 Ｄ Ｈ ５ ａ株 ， Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ诱 导表 达 ， 经 超 声 裂 解 后 获 得 包 涵体 蛋 白， 经 溶解、 变 性、 复 性处 理 后 获 得 Ｇ Ｓ Ｔ － Ｇ ａ ｓ ｓ ｅ ｒ ｉ ｃ ｉ ｎ Ｔ 融合 蛋 白； 用琼脂扩散法测定其对金黄色葡萄球菌 、 大肠杆菌、 李 斯特 菌 、 枯 草 杆 菌 等 的抗 菌 活性 。结 果 与 结 论 ： 采用ｐ Ｇ Ｅ ｘ 一 ４ Ｔ 一 １ 融 合表 达 系统 在 大 肠 杆 菌 中表 达 了有 活 性 的 Ｇ ａ ｓ ｓ ｅ ｒ ｉ ｃ ｉ ｎ Ｔ ， 融 合 蛋 白以包 涵 体 形 式存 在 。 复 性 的 融合 蛋 白对 金 黄 色 葡 萄 球 菌
ａ ｆ ｔ ｅ ｒ ｍｏ ｄ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｏ ｉ ｒ ｇ ｉ ｎ ａ ｌ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ｏ ｐ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ ｃ ｏ ｄ ｏ ｎ ｕ ｓ ａ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｅ． ｃ ｏ ｌ ｉ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｎ ｃ ｌ ｏ ｎ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ ｐ ＧＥ Ｘ Ｔ 一１ ．Ｃ ｌ ｏ ｎ ｅ ｓ ｃ ａ ｒ ｒ ｙ ｉ ｎ ｇ ｐ ＧＥ Ｘ一 ４ Ｔ 一１ 一 ｇ ａ ｔ ｗａ ｓ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄ ｂ ｙ Ｉ Ｐ ＴＧ． Ｔ ｈ ｅ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｉ ｒ ａ ｗｅ ｒ ｅ ｂ ｍｋ ｅ ｎ ｄ ｏ ｗｎ ｂ ｙ ｕ ｌ ｔ ｒ ａ ｓ ｏ ｎ ｉ ｃ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｉ ｎ ｃ ｌ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ ｂ ｏ ｄ ｉ ｅ ｓ
实验七 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化
1 细菌的裂解： 常用方法有：① 高温珠磨法；② 高压匀浆；③ 超声破碎法； ④ 酶溶法；⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方 法① 、② 已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究 中应用较为广泛。 下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。
1、酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳 多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。 主要步骤为： ① 4 ℃ ，5000rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100 mL ）。弃 上清，约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀。 ② 每克菌加8μL PMSF 及80μL 溶菌酶，搅拌20 min ；边搅拌边每克菌加4 mg 脱 氧胆酸（在冷室中进行）。 ③ 37 ℃ ，玻棒搅拌，溶液变得粘稠时加每克菌20μL DNase I。室温放置至溶液不 再粘稠。 2、超声破碎法。声频为15-20 kHz 的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎， 在处理少量样品时操作简便，液体量损失较少，同时还可对染色体DNA 进行剪切 ，大大降低液体的粘稠度。 ① 收集1 L 诱导表达的工程菌，40 ℃ ，5000r pm 离心，15 min ；弃上清，约每 克湿菌加3 mLTE 缓冲液。 ② 按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌；10 000g 离心，15min ，分别收集 上清液和沉淀。 ③ 分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2× 凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS PAGE 。 注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关， 应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经3 -4 次冻溶后更容易破碎。
实验七 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
乳酸乳球菌表达系统的研究进展_王永刚
图 1 NICE 系统蛋白表达示意图
2 乳酸乳球菌表达系统的应用
乳酸乳球菌是肠道内的常见菌种， 其作为一种食 品级的安全微生物已越来越受到科研工作者的青睐。 目前对乳酸乳球菌应用最多的是食品工业和医药行 业。 2.1 L. lactis 表达系统应用于食品工业
目前， 构建乳酸菌乳球菌食品级载体-受体系统， 寻找一些在乳酸乳球菌中的克隆和表达中有价值的基 因已成为乳酸菌分子遗传学研究的趋势并在食品研究 和生产领域具有重大意义。 乳酸菌食品级高效表达系 统 （NICE） 是 现 阶 段 应 用 最 广 的 高 效 诱 导 表 达 系 统 ， 由 于 NICE 系 统 的 诱 导 剂 、 宿 主 菌 和 载 体 都 是 安 全 的 食品级的， 其应用前景相当广阔。 如若在该系统中加 入诱导物乳链菌肽后诱导率可达 1 000 倍以上 。 ［12-13］ 因 此， 在可控蛋白的生产中该系统是首选表达系统， 同 时在生产表达时该系统具有良好的安全性， 所以可用
细菌漆酶LacA在大肠杆菌中的异源表达.
刘艳红、王瑞、姚伟静、张明珠、康兴、程飞、 孙元元、刘燕红、程旭、査倩、潘伟民、傅声祥 汇报人：程飞
实验简介
实验过程
实验原理
实验材料
实验目的
一、实验简介
漆酶（Laccase）是一种含酮的多酚氧化酶，能够催化多种酚类和 非酚类化合物发生氧化，同时伴随由分子氧还原成水。
漆酶一般由500-600个氨基酸组成，不同来源的漆酶氨基酸序列的 相似程度较低，但是其催化位点序列相当保守。对漆酶的晶体结 构进行研究，发现其分子具有3个铜离子结合位点，共结合四个铜 离子。 野生漆酶的产量低，重组表达是提高漆酶产量的一种常用方法。 本实施主要通过由保守区设计简并引物扩增部分漆酶LacA片段， 以及反向PCR扩增已知序列临近的未知序列，并且通过序列拼接获 得完整的LacA基因序列，并转化大肠杆菌，进行异源高效表达。
二、实验目的
1. 获得细菌LacA基因 。 2. LacA在大肠杆菌中异源表达。
三、实验原理
1. 2. 3. 4. DNA重组。 简并引物。 酶。 TA克隆：将3´端具有单个“A”突出末端的PCR产物克隆到3´端具有单个“T”突出末端 的载体的克隆法。 5. 反向PCR: 反向PCR是一种新型的基因扩增方法，它能扩增一段已知序列旁侧的DNA。 6. 载体选择。 7. 蓝白筛选： 质粒载体含有大肠杆菌β -半乳糖苷酶基因（lacz）的启动子（受IPTG诱导）及其 编码α 肽链（β -半乳糖苷酶的氨基末端短片段）的DNA序列（特称为lacz基因）。受体大 肠杆菌细胞的β -半乳糖苷酶发生了突变，失去的氨基末端。当lacz基因编码的α 肽链同 失去了正常氨基末端的β -半乳糖苷酶突变体互补时，便会产生出有活性的β -半乳糖苷酶 分子，在IPTG诱导下，会启动表达，分解X-gal产生蓝色背景。当MCS中插入外源基因后， 会阻断α 肽链合成，不能形成互补，不能产生功能活性的β -半乳糖苷酶，也就不会产生 蓝色背景。所以含有重组质粒载体的克隆是白色的。
乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达
表 1 合成的引物序列及限制性酶切位点
Primer PA1 P2 PV1 PV2 PO1 PO2 PO3 PO4
Table 1 Primer sequence and size
Sequence (5′→3′)
Enzyme site
GCCTCTAGAATTAAATTCTGAAGTTTGTTAGATACAAT
47 卷 4 期 2007 年 8 月 4 日
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica
47 (4) : 604～609 4 August 2007
乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达
徐 波1 ,曹郁生1 3 ,陈 燕1 ,郭兴华1 ,2
(1食品科学教育部重点实验室 南昌大学中德联合研究院 南昌 330047) (2中国科学院微生物研究所 北京 100080)
Xba Ⅰ
TAATCTAGAGCTAGCTTGATTGTTCTATCGAAAGCGAAATCA Nhe Ⅰ
AGCCATGGAACCGAACTTAATGGGAGG
Nco Ⅰ
GAAGCTAGCCGCAAAAAGGCCATCCGTCAGGA
Nhe Ⅰ
ATCGCCATGGGTTGTCATCGGCTCGCTGGTTGC
当aaga基因克隆到其他不能发表达原理以载体praf800pnz8048和pve5524prna48和细胞壁锚定诱导表达载体prnv48用于prnv48均为e型复制的翻译融合型载体分别含有的工作中构建了铜绿假单胞菌oprfoprh的融合外合基因克隆入prna48和prnv48中对诱导方法当l1actisnz9000prna48oprfh和l1actisnz9000prnv48oprfh培养至对数期时分别加入10ngml和1ngml诱导剂nisin使细菌的生长与的代谢负荷位于nisa启动子下游的oprfh基因被激活转录表达出所需的oprfh融合蛋白
干酪乳杆菌胞外多糖基因簇的调控基因在大肠杆菌中异源表达
摘 要 为 研 究 干 酪 乳 杆 菌 胞 外 多糖 的 生 物 合 成 和 转 录 调 控 ， 对 其 生 物 合 成 基 因 簇 中假 定 的 转 录 调 控 因 子
ＬＣ２Ｗ 并在 大肠 杆 菌 （ Ｅ ｓ ｃ ｈ ｅ ｒ ｉ ｃ ｈ ｉ ａ ｃ ｏ ｌ ｉ ） 中异 源 表 达 。 首先 ， 利用 Ｐ Ｃ Ｒ技 术 从 于 酪 乳 杆 菌 Ｌ Ｃ ２ Ｗ 中
扩 增 出 目的 基 因 Ｌ Ｃ ２ Ｗ ＿ ２ １ ７ ０ ， 将 其 插 入 到 大肠 杆 菌 表 达 载 体 ｐ Ｅ Ｔ ２ ４ ａ和 ｐ Ｅ Ｔ ３ ０ ａ中 ， 构建 出 Ｌ Ｃ ２ Ｗ＿ ２ ｊ ７ ０ Ｎ端或 ｃ 端 和 Ｎ端均含有 Ｈ ｉ ｓ 蛋 白标 签 的重 组 质 粒 。含 上 述 质 粒 的 Ｅ ｃ ｏ ｌ ｉ 经 异 丙 基 硫 代 半 乳糖 苷 （ Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ） 诱导后 ， 通 过 聚 丙 烯酰 胺 凝 胶 电泳 （ Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ Ａ Ｇ Ｅ） 分析并 未发 现 Ｌ Ｃ ２ Ｗ一 ２ １ ７ ０蛋 白可 溶 性 表 达 。 对 Ｌ Ｃ ２ Ｗ一 ２ １ ７ ０氨 基 酸 序 列 利 用 Ｐ ｈ ｏ ｂ ｉ ｕ ｓ 服 务器 分 析 ， 发 现该 蛋 白 Ｎ端 存 在 跨 膜 区（ 前２ ７个 氨基 酸 为 跨膜 序 列 ） 。 切 除此 跨 膜 区域 重 新 构建 重 组 表达质 粒后， 在 层ｃ ｏ ｌ ｉ 中成 功 实现 Ｌ Ｃ ２ Ｗ＿ ２ １ ７ ０蛋 白可 溶 性 表 达 。 研 究为 进 一 步纯 化 该 转 录 调 控 因子 ， 并 研 究 其 功 能和 对胞 外 多糖 生 物 合 成 基 因簇 的 转 录调 控 机 制 奠 定 了基 础 。 关 键 词 干 酪 乳 杆 菌 ； 胞 外多糖 ； 转 录调 控 因 子 ； 异源表达 ； 大 肠 杆 菌
乳酸杆菌基因表达系统的研究进展
乳酸杆菌基因表达系统的研究进展徐义刚1,2,崔丽春1(1.东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040; 2.东北农业大学动物医学院,黑龙江哈尔滨150030)摘要乳酸杆菌是人及动物肠道中重要的益生菌,被公认为安全级(generall y recognized as safe,GRA S)微生物。
乳酸杆菌表达系统是近几年发展起来的一种表达系统,随着乳酸杆菌分子生物学的发展、各类表达调控元件的分离,相继发展了乳酸杆菌的克隆载体、表达载体和整合载体。
乳酸杆菌具有免疫佐剂、吸附黏膜、抗胆汁酸能力,以乳酸杆菌为载体,作为外源基因的传递和表达系统,研制口服疫苗,刺激黏膜免疫系统产生有效的免疫应答,具有重要开发前景。
关键词乳酸杆菌;外源基因;表达系统中图分类号Q939.11+7文献标识码A文章编号1005-7021(2007)03-0087-05Progress on G ene E xpressi on Syste m of Lact obacill usXU Y-i gang1,2,C U I L-i chun1(1.N ort h e a stF orest ry Univ.H arbin150040;2.C oll.of Veteri nary M e d.N ort h e a st Agric.Un i v.H arbi n150030)A bstrac t Lactobacill us is a k i nd o f i m portant prob i o ti c i n gastro-i ntesti nal tracts o f hu m an and most an i m a l s,and t hey are conside red to be safe bacter i a w it h a GRA S(generall y regarded as safe)status.T he express i on syste m s o f Lactobacillus is a k i nd of expression sy stem tha t have been deve l oped i n recent yea rs,and as t he deve l op m en t of mo-lecu l ar b i o l ogy o f Lactobacillus,and the sepa ration o f var i ous expressi on regu l a t o ry ele m ents,t he c l on i ng vector,the expressi on vector,and the i ntegrati on v ector have been deve loped one a fter ano t ctobacillus possesses many properties such as i m mune ad j uvant,adsorpti on mucosa,ant-i b ile ac i d capab ili ty;take Lactobacillus as a vector trans-fero r and expressi on syste m s o f exogenous gene to study ora l vacc i ne,sti m u l ate mucosa i m m une syste m to produce e-f fecti ve i m mune responses,a ll o f these possess i m portant deve l op m ent prospect.K eywords Lact obacillus;exogenous gene;expressi on syste m乳酸菌(Lactic ac i d bacteria,LAB)是人及动物肠道中极为重要的益生菌群之一,该菌为兼性厌氧的革兰氏阳性菌,是乳品工业发酵的重要菌类,是在食品、医药工程领域具有重要应用前景的食品级微生物,包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等十几个属。
乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达
乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达徐波;曹郁生;陈燕;郭兴华【期刊名称】《微生物学报》【年(卷),期】2007(47)4【摘要】以α-aga基因为食品级选择标记构建了乳酸乳球菌食品级高效诱导细胞内和细胞壁锚定表达系统,并用这一表达系统表达了铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因OprF/H.首先以pRAF800和pNZ8048构建了含有α-aga、PnisA-MCS-pepN和θ复制子的乳酸乳球菌食品级细胞内诱导表达载体pRNA48,再以pRNA48和pVE5524为出发载体构建了含有α-aga、PnisA-SPUsp45-nucA-CWAM6-t1t2和θ复制子的乳酸乳球菌细胞壁锚定诱导表达载体pRNV48.然后以食品级载体pRNA48和pRNV48为基础,构建了不含抗生素抗性选择标记的铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因的表达质粒pRNA48-OprF/H和pRNV48-OprF/H.利用nisin进行重组乳酸乳球菌菌株的诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot 分析,检测到表达蛋白分别占细胞内可溶蛋白的9.6%和细胞壁锚定蛋白的9.8%,表达产物具有免疫原性,可与含OprF/H的乳球菌以及铜绿假单胞菌发生特异性的凝集反应.【总页数】6页(P604-609)【作者】徐波;曹郁生;陈燕;郭兴华【作者单位】食品科学教育部重点实验室,南昌大学中德联合研究院,南昌,330047;食品科学教育部重点实验室,南昌大学中德联合研究院,南昌,330047;食品科学教育部重点实验室,南昌大学中德联合研究院,南昌,330047;食品科学教育部重点实验室,南昌大学中德联合研究院,南昌,330047;中国科学院微生物研究所,北京,100080【正文语种】中文【中图分类】Q786;Q93【相关文献】1.乳酸乳球菌NICE系统食品级分泌表达载体pRNV48的构建及铜绿假单胞菌融合外膜蛋白的表达 [J], 徐波;曹郁生;陈燕;郭兴华2.多角体包埋异源蛋白杆状病毒表达系统的构建 [J], 郭建军;袁林;曾静;魏国汶;杨一兵3.乳酸乳球菌食品级分泌性表达载体pSQZ的构建及报告蛋白的表达 [J], 孙强正;熊衍文;叶长芸;徐建国4.食品级分泌表达载体的构建及报告蛋白在乳酸乳球菌中的表达 [J], 孙强正;熊衍文;叶长芸;徐建国5.重组植物甜蛋白马宾灵的食品级乳酸乳球菌诱导表达系统的构建 [J], 顾文亮;夏启玉;姚晶;胡新文;符少萍;郭建春因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
植物乳杆菌素plnE和plnF的异源表达方法[发明专利]
![植物乳杆菌素plnE和plnF的异源表达方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/36580e9131b765ce04081434.png)
专利名称：植物乳杆菌素plnE和plnF的异源表达方法专利类型：发明专利
发明人：郦萍,顾青,吴双双
申请号：CN201510776886.3
申请日：20151112
公开号：CN105671061A
公开日：
20160615
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开一种植物乳杆菌素pln E和pln F的异源表达方法，从NCBI上查到pln E和pln F的基因序列，序列号为，并在序列的N-端添加肠激酶位点，设计酶切位点Kpn？I和Nco？I，合成序列；分别质粒pUC57-pln E和pUC57-pln F为模板，设计引物进行pln E和pln F片段的PCR扩增，通过pET-32a质粒和目的片段双酶切后，成功构建重组质粒pET-32a-pln E和pET-32a-pln F，转化至大肠杆菌E.？coli？DH5α并保存。
本发明利用大肠杆菌异源表达体系，构建表达质粒并实现其在大肠杆菌的高效表达，使得大量制备PlnE/F成为可能，从而为其作用机理研究及其今后在食品领域中的应用提供基础。
申请人：浙江工商大学
地址：310012 浙江省杭州市西湖区教工路149号
国籍：CN
代理机构：杭州中成专利事务所有限公司
代理人：冉国政
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一种乳酸菌素plnE的应用[发明专利]
![一种乳酸菌素plnE的应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/3bdeb528a1c7aa00b42acb8c.png)
专利名称：一种乳酸菌素plnE的应用
专利类型：发明专利
发明人：樊倩,周盛昌,肖丽萍,檀新珠,黄彪,汤建平,仲伟迎,李兵,吴有林
申请号：CN201811125569.5
申请日：20180926
公开号：CN109170268A
公开日：
20190111
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种乳酸菌素plnE的应用，该乳酸菌素plnE的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该乳酸菌素plnE可用于杀菌以及提高断奶仔猪的免疫力。
与现有技术相比，本发明利用基因工程技术体外重组表达乳酸菌素plnE，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等细菌具有很强的杀菌作用，可用于饲养猪或家禽，尤其在乳仔猪、断奶仔猪、生长猪或种猪等的饲料中应用可以降低腹泻率、改善肠道功能和提高肠道黏膜免疫力。
申请人：江苏傲农生物科技有限公司,北京慧农生物科技有限公司
地址：223700 江苏省宿迁市泗阳县经济开发区金鸡湖路9号
国籍：CN
代理机构：上海科盛知识产权代理有限公司
代理人：赵志远
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乳酸菌素plnj-k蛋白的串联表达
收稿日期：２０１９－０５－２２㊀㊀修回日期：２０１９－０７－１７基金项目：福建省家禽产业体系项目（２０１９－２０２２）．作者简介：陈立圳（１９９４－），男．研究方向：动物营养与饲料科学．Ｅｍａｉｌ：ｃｌｚｃｍｍ＠１６３．ｃｏｍ．通信作者王长康（１９６２－），男，教授．研究方向：动物营养与饲料科学．Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｃｈａｎｇｋａｎｇｃｎ＠１６３．ｃｏｍ．乳酸菌素ｐｌｎＪ⁃Ｋ蛋白的串联表达陈立圳，王全溪，向思琳，高玉云，许丽惠，王长康（福建农林大学动物科学学院，福建福州３５０００２）摘要：对乳酸菌素ｐｌｎＪ⁃Ｋ基因序列进行优化，利用基因串联表达技术构建重组串联表达载体ｐＥＴ⁃３２ａ⁃ｐｌｎ⁃Ｊ⁃Ｋ，并将ｐＥＴ⁃３２ａ⁃ｐｌｎ⁃Ｊ⁃Ｋ转化到大肠杆菌ＢＬ２１中；对温度㊁时间㊁ＩＰＴＧ浓度等诱导条件进行优化，并与优化前的表达量进行对比．ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ检测结果表明，在ＩＰＴＧ浓度为０．６ｍｍｏｌ㊃Ｌ－１，温度为３７ħ，时间为１２ｈ的诱导条件下，目的蛋白的表达量最多．蛋开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）白质印迹法鉴定结果表明，目的蛋白被正确表达．关键词：乳酸菌；乳酸菌素；重组串联表达中图分类号：Ｑ９３９．１１＋７文献标识码：Ａ文章编号：１６７１⁃５４７０（２０２０）０３⁃０４０７⁃０５ＤＯＩ：１０．１３３２３／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊ．ｆａｆｕ（ｎａｔ．ｓｃｉ．）．２０２０．０３．０１９Ｃｏ⁃ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｌａｎｔａｒｉｃｉｎＪ⁃ＫＣＨＥＮＬｉｚｈｅｎ，ＷＡＮＧＱｕａｎｘｉ，ＸＩＡＮＧＳｉｌｉｎ，ＧＡＯＹｕｙｕｎ，ＸＵＬｉｈｕｉ，ＷＡＮＧＣｈａｎｇｋａｎｇ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＦｕｊｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ３５０００２，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＷｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｔｈｅｇｅｎｅｃｏｄｏｎｏｆｐｌａｎｔａｒｉｃｉｎＪ⁃Ｋ（ｐｌｎＪ⁃Ｋ）ａｎｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｖｅｃｔｏｒｐＥＴ⁃３２ａ⁃ｐｌｎ⁃Ｊ⁃Ｋｕｓｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔａｎｄｅｍｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＴｈｅｎｔｈｅｖｅｃｔｏｒｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｕｎ⁃ｄｅｒｖａｒｉｏｕｓｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ，ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｄｕｒａｔｉｏｎｓａｎｄｉｓｏｐｒｏｐｙｌ⁃β⁃ｄ⁃ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈｅｑｕａｎｔｉｔｙｏｆｔｈｅｉｎｔｅｒｅｓｔｐｒｏｔｅｉｎｐｅａｋｅｄｗｈｅｎｂｅｉｎｇｉｎｄｕｃｅｄａｔ０．６ｍｍｏｌ㊃Ｌ－１ＩＰＴＧｆｏｒ１２ｈａｔ３７ħ．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇｆｕｒｔｈｅｒｃｏｎ⁃ｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔａｎｄｅｍｐｒｏｔｅｉｎｐｌｎＪ⁃Ｋｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｃｏｒｒｅｃｔｌｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ；ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｉｃｉｎ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔａｎｄｅｍｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ相对于传统养殖业的养殖管理模式，现代畜牧集约化养殖具有规范的管理以及较高的产品产出等优势［１］，但集约化养殖同样有其相对应的缺点．高密度的养殖条件使畜禽更容易受到病原微生物的侵袭，使机体长时间处于应激状态，从而影响畜禽健康［２］．抗生素虽然能够有效地控制疾病的发生和传播，但其耐药性以及对环境的污染日趋严重［３］．为此，寻找能够保护畜禽健康的替抗营养添加剂显得尤为重要．正常生理情况下，动物肠道区系微生物与宿主维持着动态平衡，当平衡被打破后，容易诱发各种疾病的产生．因此，维护动物肠道微生态平衡对于机体的健康具有重要的意义．相关研究表明，乳酸菌素能够调整或者维持肠道微生态平衡，具有促进有益菌增殖，抑制有害菌的生长以及增强机体免疫力来预防疾病，从而促进动物生长及提高饲料转化率［４－５］；乳酸菌素能够形成生物屏障，抑制病原菌吸附和侵袭，从而保护动物体的健康，且乳酸菌素具有无耐药性㊁无残留等优点［６］．因此，乳酸菌素可以作为功能性饲料添加剂应用在动物养殖中．目前，密码子的偏好性已被应用于转基因的研究中，在转基因研究过程中通常需要进行基因的外源表达．但由于大肠杆菌密码子的偏好性，人工转入的外源基因在大肠杆菌中常遇到表达效率低㊁表达产物不稳定等问题［７］．乳酸菌素的表达量受到多种因素的影响，不适宜的温度以及发酵时间会造成菌体蛋白的产量不足［８］．先前诸多研究主要集中在其他蛋白表达的研究上，而对优化乳酸菌素表达的研究较少．因此，探究如何提高乳酸菌素的表达具有重要的研究意义．为了更好地提高乳酸菌素ｐｌｎＪ⁃Ｋ在大肠杆菌中的表达效率，本试验采用基因工程技术，通过优化基因序列，构建重组串联质粒ＰＥＴ⁃３２ａ⁃ｐｌｎ⁃Ｊ⁃Ｋ，并探究最佳的福建农林大学学报（自然科学版）第４９卷第３期ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｕｊｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ）２０２０年５月㊃８０４㊃福建农林大学学报（自然科学版）第４９卷㊀诱导条件，旨在为乳酸菌素的应用提供依据．１㊀材料与方法１．１㊀材料１．１．１㊀质粒与菌株㊀ＰＥＴ⁃３２ａ⁃ｐｌｎ⁃Ｊ⁃Ｋ根据ＧｅｎｅＢａｎｋ已有的序列交由生工生物工程（上海）股份有限公司优化．大肠杆菌购于北京全式金生物技术有限公司．１．１．２㊀试剂㊀Ｈｉｓ标签抗体㊁ＢＬ２１㊁蛋白质分子质量标准（１４ １００ｋｕ）㊁氨苄青霉素㊁异丙基⁃β⁃Ｄ⁃硫代半乳糖苷购于北京全式金生物技术有限公司；ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ试剂盒㊁质粒小提试剂盒㊁凝胶回收试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司；转膜液㊁电泳液购于碧云天生物技术公司；ＰＶＤＦ膜购于ＰＡＬＬ公司；ＢａｍＨⅠ㊁ＨａｎｄⅢ限制性内切酶购于宝生物公司；考马斯亮蓝Ｒ２５０购于ＢＢＩ公司；ＴＢＳＴ购于北京索莱宝科技有限公司．１．２㊀方法１．２．１㊀序列优化㊀根据ＧｅｎｅＢａｎｋ中的ｐｌｎＪ㊁ｐｌｎＫ基因序列，通过大肠杆菌对密码子的偏好性设计并优化ｐｌｎＪ⁃Ｋ基因序列，在序列设计和优化的过程中避免使用稀有密码子和构建重组质粒所需的限制性内切酶位点．优化的野生型基因序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并克隆于质粒ｐＵＣ５７中．１．２．２㊀优化后序列重组质粒的构建㊀采用双酶切体系，使用ＢａｍＨⅠ㊁ＨａｎｄⅢ限制性内切酶分别酶切载体质粒ｐＥＴ⁃３２ａ及经过ＰＣＲ扩增并纯化的目的基因，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物，使用２０μＬＴ４连接酶体系进行连接．于４ħ过夜后，将连接产物转入ＤＨ⁃５α感受态细胞中，均匀涂布在含氨苄青霉素的ＬＢ培养平板上，隔天挑选菌株，经ＰＣＲ检测及双酶切鉴定，接种到ＬＢ液体培养基中，于３７ħ摇菌过夜．将菌液交由生工生物工程（上海）股份有限公司测序．１．２．３㊀重组串联表达载体的构建㊀将重组质粒㊁大肠杆菌ＢＬ２１冰浴３０ｍｉｎ，随即放入４２ħ恒温水浴锅中热激４５ｓ后，放入冰水中冷却２ｍｉｎ．经过以上步骤之后，将质粒ｐＥＴ⁃３２ａ⁃ｐｌｎ⁃Ｊ⁃Ｋ转入大肠杆菌ＢＬ２１中，于３７ħ恒温摇床上培养１ｈ．将适量培养液涂布在含氨苄青霉素的ＬＢ平板上培养过夜，经过ＰＣＲ扩增及双酶切鉴定后，接种到ＬＢ液体培养基中，于３７ħ摇菌过夜，再将阳性克隆菌保存于－８０ħ下．１．２．４㊀诱导温度㊁时间的优化㊀将保存的阳性克隆菌复苏，以１ʒ１００的比例接种在含氨苄青霉素的ＬＢ培养平板上，于２００ｒ㊃ｍｉｎ－１㊁３７ħ摇床中培养至Ｄ６００ｎｍ＝０．６时，加入ＩＰＴＧ使其终浓度为１．０ｍｍｏｌ㊃Ｌ－１，分别在不同诱导温度（２５㊁３１㊁３７㊁４３ħ）㊁不同诱导时间（０㊁２㊁４㊁６㊁８㊁１０㊁１２ｈ）的条件下进行诱导表达．取５００μＬ菌液，于８０００ｒ㊃ｍｉｎ－１㊁４ħ条件下离心５ｍｉｎ，收集沉淀，用１００μＬＰＢＳ缓冲液洗涤沉淀，加入１００μＬ１ˑＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ稀释缓冲液，振荡混匀后于沸水中煮沸５ｍｉｎ，冰水中冷却５ｍｉｎ，在低温离心机中，于１２０００ｒ㊃ｍｉｎ－１㊁４ħ条件下离心５ｍｉｎ，取上清液进行ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ电泳检测．１．２．５㊀ＩＰＴＧ诱导浓度的优化㊀在优化得到的最佳诱导温度㊁诱导时间条件下，分别加入０㊁０．２㊁０．４㊁０．６㊁０．８㊁１．０㊁１．２㊁１．５ｍｍｏｌ㊃Ｌ－１ＩＰＴＧ进行诱导．取５００μＬ菌液，于８０００ｒ㊃ｍｉｎ－１㊁４ħ条件下离心５ｍｉｎ，收集沉淀，用１００μＬＰＢＳ缓冲液洗涤沉淀，加入１００μＬ１ˑＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ稀释缓冲液，振荡混匀后于沸水中煮沸５ｍｉｎ，冰水中冷却５ｍｉｎ，在低温离心机中，于１２０００ｒ㊃ｍｉｎ－１㊁４ħ条件下离心５ｍｉｎ，取上清液进行ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ电泳检测．１．２．６㊀蛋白质印迹法鉴定㊀菌液在优化后的条件下进行培养，取适量提取菌体蛋白．电泳㊁转膜后，使用带Ｈｉｓ标签的鼠抗作为一抗，置冰箱（４ħ）中孵育过夜．以ＨＲＰ标记的羊抗鼠ＩｇＧ作为二抗，于３７ħ恒温箱中孵育２ｈ后使用超敏ＥＣＬ发光液，置化学发光成像系统中检测．２㊀结果与分析２．１㊀序列优化前后的对比密码子优化前后的序列如图１㊁２所示．序列优化后提高了ＧＣ含量的百分比，消除不利的峰，调整密码子使用偏差以适应目标宿主基因适应度值的最高表达谱，使最终的蛋白表达效率大大增加．图１㊀优化前的密码子序列Ｆｉｇ．１㊀Ｓｅｑｕｅｎｃｅｂｅｆｏｒｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ红色部分表示优化后的密码子．图２㊀优化后的密码子序列Ｆｉｇ．２㊀Ｓｅｑｕｅｎｃｅａｆｔｅｒｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ２．２㊀重组质粒的鉴定ｐｌｎＪ⁃Ｋ基因经ＰＣＲ扩增可以得到与预期大小一致的片段，大小约为３４０ｂｐ（图３Ａ）；分别对ｐｌｎＪ基因（上㊁下游）㊁ｐｌｎＫ基因（上㊁下游）㊁ｐｌｎＪ⁃Ｋ基因（上㊁下游）的引物进行ＰＣＲ扩增，在１７９㊁１７９㊁３４０ｂｐ处能看到特异性条带（图３Ａ）．对重组质粒进行双酶切鉴定，质粒在３４０ｂｐ处能明显看到ｐｌｎＪ⁃Ｋ基因片段（图３Ｂ），表明ｐｌｎＪ⁃Ｋ基因已成功连接到载体中．Ａ：（Ｍ：ＤＮＡ分子质量标准；１ ３分别为ｐｌｎＪ㊁ｐｌｎＫ㊁ｐｌｎＪ⁃Ｋ基因）；Ｂ：［Ｍ：ＤＬ１００００ＤＮＡ分子质量标准；１：重组质粒双酶切（ＰＥＴ⁃３２ａ⁃ｐｌｎＪ⁃Ｋ）］．图３㊀目的基因的扩增及重组质粒的鉴定Ｆｉｇ．３㊀Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ２．３㊀最佳诱导条件的筛选图４显示，当诱导温度为３７ħ时，诱导的菌体蛋白表达量最多．图５显示，当诱导时间为１２ｈ时，诱导的菌体蛋白表达量最多．Ｍ：蛋白质分子质量标准；１ ４分别为２５㊁３１㊁３７㊁４３ħ．图４㊀不同温度诱导的ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ检测结果Ｆｉｇ．４㊀ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｎｔｈｅｑｕａｎｔｉｔｙｏｆｉｎｄｕｃｅｄｐｒｏｔｅｉｎａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｂｙＳＤＳ⁃ＰＡＧＥＭ：蛋白质分子质量标准；１ ８分别为０㊁２㊁４㊁６㊁８㊁１０㊁１２㊁２４ｈ．图５㊀不同时间诱导的ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ检测结果Ｆｉｇ．５㊀ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｎｔｈｅｑｕａｎｔｉｔｙｏｆｉｎｄｕｃｅｄｐｒｏｔｅｉｎｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｕｒａｔｉｏｎｓｂｙＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ㊃９０４㊃㊀第３期陈立圳等：乳酸菌素ｐｌｎＪ⁃Ｋ蛋白的串联表达㊀㊀图６显示，当ＩＰＴＧ浓度为０．６ｍｍｏｌ㊃Ｌ－１时，诱导的菌体蛋白表达量最多．２．４㊀蛋白质印迹法鉴定结果由于目前市面上没有商品化的ｐｌｎＪ㊁ｐｌｎＫ抗体，本试验采用原核表达载体上自带的标签蛋白Ｈｉｓ的抗体进行蛋白质印迹法鉴定．图７显示，在诱导温度为３７ħ㊁诱导时间为１２ｈ，ＩＰＴＧ浓度为０．６ｍｍｏｌ㊃Ｌ－１的条件下，通过用带Ｈｉｓ标签蛋白的抗体进行孵育，可见在４８ｋｕ处有明显的特异性条带，相对于优化前，表达量显著提高．Ｍ：蛋白质分子质量标准；１ ８分别为０㊁０．２㊁０．４㊁０．６㊁０．８㊁１．０㊁１．２㊁１．５ｍｍｏｌ㊃Ｌ－１．图６㊀不同ＩＰＴＧ浓度诱导的ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ检测结果Ｆｉｇ．６㊀ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｎｔｈｅｑｕａｎｔｉｔｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＩＰＴＧｂｙＳＤＳ⁃ＰＡＧＥＭ：蛋白质分子质量标准；１：优化前；２：优化后．图７㊀蛋白质印迹法鉴定结果Ｆｉｇ．７㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｎｔｅｒｅｓｔｐｒｏｔｅｉｎｂｙＷｅｓｔｅｒｎ⁃ｂｌｏｔ３㊀讨论研究表明，组成二肽类细菌素ｐｌｎＥＦ的两个二肽ｐｌｎＥ和ｐｌｎＦ，当它们单独作用时抑菌效果不是很显著，但这两个二肽细菌素以１ʒ１的摩尔浓度混合的时候，抑菌活性可以增强至少１０００倍［９］．乳酸菌素虽然有较好的应用前景，但由于野生型乳酸菌分泌乳酸菌素的量极为有限，且野生型乳酸菌在生长过程中产生大量的酸，降低了培养液的酸度，抑制了乳酸菌自身的生长．现有研究表明，菌株的不同以及同一菌株在发酵中的培养时间㊁培养温度㊁培养基的ｐＨ㊁菌液的接种量，甚至培养基的成分，如碳源㊁氮源㊁磷酸盐等，都会影响乳酸菌素的产量．其中，培养基的成分㊁培养时间㊁培养温度对乳酸菌素产量影响的研究是最早的［１０－１９］，这些因素主要影响着菌株的生长及乳酸菌素的分泌．因此，探究提高乳酸菌素产量的方法对于其在实际生产中的应用具有重要的意义．本试验通过构建重组串联表达载体，探索不同温度㊁时间㊁ＩＰＴＧ浓度对菌体蛋白表达量的影响．结果表明：相对于其他诱导温度，３７ħ诱导菌体蛋白的表达量最多，这与杨阳等［２０］的研究结果一致；相对于其他诱导时间，１２ｈ诱导菌体蛋白的表达量最多，这与陈金峰等［２１］的研究结果一致；相对于其他ＩＰＴＧ的诱导浓度，０．６ｍｍｏｌ㊃Ｌ－１ＩＰＴＧ诱导菌体的效果最佳，这与焦翠翠等［２２］的研究结果一致．先前对目的蛋白表达量的研究中，目的蛋白表达量的最佳诱导条件不尽相同，这可能与菌种以及诱导条件不适合目的蛋白的表达有关［２３］，其具体机制还有待进一步探索．全长基因片段对宿主的表达负荷过大，通常会导致表达量不高等问题．本试验根据大肠杆菌密码子的偏好性，对密码子进行了优化，提高了密码子的表达量，使得其更适合在大肠杆菌ＢＬ２１中表达，且目的蛋白具有更高的表达量．因此，本试验选用优化后的时间㊁温度㊁ＩＰＴＧ浓度诱导菌体并通过蛋白质印迹法检测菌体蛋白的表达量．相对于优化前，诱导温度为３７ħ，诱导时间为１２ｈ，ＩＰＴＧ浓度为０．６ｍｍｏｌ㊃Ｌ－１时，菌体蛋白的表达量显著提高．虽然本试验在优化密码子后，筛选了合适的诱导时间㊁温度㊁ＩＰＴＧ浓度能够使ｐｌｎＪ⁃Ｋ蛋白得到最大的表达量，但ｐｌｎ⁃Ｊ⁃Ｋ在生产实践中的应用效果还需要进一步探索．参考文献［１］魏晓军．加强畜禽规模养殖场管理㊀促进畜牧业健康稳步发展［Ｊ］．中兽医学杂志，２０１４（１２）：８２－８２．［２］王伟伟．我国集约化畜禽养殖场污染治理障碍分析及对策［Ｊ］．中国畜牧兽医文摘，２０１８，３４（３）：４３．［３］王凯．抗生素胁迫条件对土壤微生物生态结构的影响及耐药细菌污染控制初步探讨［Ｄ］．扬州：扬州大学，２０１１．［４］蒲博．降胆固醇乳酸菌菌制剂的制备及应用［Ｄ］．成都：西华大学，２０１５．［５］权春善，徐洪涛，王军华，等．乳酸菌素 安全㊁天然的食品防腐剂［Ｊ］．微生物学杂志，２００６，２６（３）：８６－８９．㊃０１４㊃福建农林大学学报（自然科学版）第４９卷㊀［６］王娟．饲用乳酸菌的筛选及其抑菌功能物质的初步研究［Ｄ］．无锡：江南大学，２０１６．［７］张乐，金龙国，罗玲，等．大豆基因组和转录组的核基因密码子使用偏好性分析［Ｊ］．作物学报，２０１１，３７（６）：９６５－９７４．［８］张秀丽，杨啸，刘庆慧，等．发酵条件对细菌工程菌产ＷＳＳＶ⁃ＶＰ３７的影响［Ｊ］．渔业科学进展，２００９，３０（２）：６０－６５．［９］ＥＲＬＥＮＤＬＡ，ＤＺＵＮＧＢＤ，ＩＮＧＯＬＦＦ，ｅｔａｌ．ＡｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣ１１：ｔｗｏｎｅｗｔｗｏ⁃ｐｅｐｔｉｄｅｂａｃ⁃ｔｅｒｉｏｃｉｎｓ，ｐｌａｎｔａｒｉｃｉｎｓＥＦａｎｄＩＫ，ａｎｄｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｐｌａｎｔａｒｉｃｉｎＡ［Ｊ］．ＡｐｐｌａｎｄＥｎｖｉｒＭｉｃｒｏ，１９９８，６４（６）：２２６９－２２７２．［１０］ＢＩＳＷＡＳＳＲ，ＰＵＲＢＩＴＡＲＡＹ，ＪＯＨＮＳＯＮＭＣ，ｅｔａｌ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｇｒｏｗｔｈｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ，ｐｅ⁃ｄｉｏｃｉｎＡｃＨ，ｂｙＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉＨ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ＆ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９１，５７（４）：１２６５－１２６７．［１１］ＣＨＥＩＧＨＣＩ，ＣＨＯＩＨＪ，ＰＡＲＫＨ，ｅｔａｌ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｇｒｏｗｔｈｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｎｉｓｎ⁃ｌｉｋｅｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｂｙＬａｃ⁃ｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓＡ１６４ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｋｉｍｃｈｉ［Ｊ］．ＪＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００２，９５（３）：２２５－２３５．［１２］ＭＡＴＡＲＡＧＡＳＡＭ，ＭＥＴＡＸＯＰＯＵＬＯＳＡＪ，ＧＡＬＩＯＴＯＵＢＭ，ｅｔａｌ．ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｐＨａｎｄｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｇｒｏｗｔｈａｎｄｂａｃｔｅｒｉｏ⁃ｃｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓＬ１２４ａｎｄＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃｕｒｖａｔｕｓＬ４４２［Ｊ］．ＭｅａｔＳｃｉｅｎｃｅ，２００３，６４（３）：２６５－２７１．［１３］ＭＡＴＳＵＳＡＫＩＨ，ＥＮＤＯＮ，ＳＯＮＯＭＯＴＯＫ，ｅｔａｌ．ＬａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｎｉｓｉｎＺｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓＩＯ⁃１：ｒｅｌａ⁃ｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃａｎｄｌａｃｔａｔｅａｎｄｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６，４５（１／２）：３６－４０．［１４］ＭＩＮＤＥＲＳＪＷ，ＢＯＥＲＲＩＧＴＥＲＩＪ，ＲＯＬＥＭＡＨＳ，ｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｎｉｓｉｎ，ａｎａｔｕｒａｌｎｉｓｉｎｖａｒｉａｎｔ［Ｊ］．ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ，１９９１，２０１（３）：５８１－５８４．［１５］ＴＯＤＯＭＶＳＤ，ＤＩＣＫＳＬＭ．ＢａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｅｎｔｏｓｕｓＳＴ７１２ＢＺｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｂｏｚａ［Ｊ］．ＢｒａｚＪＭｉｃｒｏ⁃ｂｉｏｆ，２００７，３８（１１）：１６６－１７２．［１６］ＴＯＤＯＲＯＶＳＤ，ＤＩＣＫＳＬＭ．ＥｆｆｅｃｔｏｆｍｅｄｉｕｍｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｎｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍｓｔｒａｉｎｓＳＴ２３ＬＤａｎｄＳＴ３４１ＬＤｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｓｐｏｉｌｅｄｏｌｉｖｅｂｒｉｎｅ［Ｊ］．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲｅｓ，２００６，１６１（２）：１０２－１０８．［１７］石金舟，陈丽园，张明．植物乳杆菌Ｒ２６０产细菌素发酵条件的研究［Ｊ］．中国微生态学杂志，２００６，１８（５）：３４１－３４２．［１８］ＤＥＬＧＡＤＯＡ，Ｌ ＰＥＺＦＮ，ＢＲＩＴＯＤ，ｅｔａｌ．ＯｐｔｉｍｕｍｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ１７－２ｂｒｅｑｕｉｒｅｓａｂ⁃ｓｅｎｃｅｏｆＮａＣｌａｎｄａｐｐａｒｅｎｔｌｙｆｏｌｌｏｗｓａｍｉｘｅｄｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｋｉｎｅｔｉｃｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，１３０（２）：１９３－２０１．［１９］ＰＡＹＮＴＥＲＭＪ，ＢＲＯＷＮＫＡ，ＨＡＹＡＳＡＫＡＳＳ．ＦａｃｔｏｒｓａｆｅｃｔｉｎｇｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｎａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌａｇｅｎｔｐｌａｎｔａｒｉｃｉｎＦ，ｂｙＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＢＦ００１［Ｊ］．ＬｅｔｔＡｐｐＩＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９７，２４（３）：１５９－１６５．［２０］杨阳，王世立．ＩＰＴＧ诱导时间㊁温度对ＧｎＲＨ类似物蛋白表达量的影响［Ｊ］．世界最新医学信息文摘，２０１５，１５（１５）：１５９，１６１．［２１］陈金峰，胡斌杰，王宫南．大豆过氧化氢酶同源基因在大肠杆菌中融合表达［Ｊ］．中国油料作物学报，２０１３，３５（４）：３８４－３８８．［２２］焦翠翠，金宏丽，蒋天琪，等．委内瑞拉马脑炎病毒Ｅ２蛋白的原核表达㊁纯化及多克隆抗体的制备［Ｊ］．中国兽医学报，２０１７，３７（１１）：２１１４－２１２０．［２３］丁军颖，伊瑶，卢学新，等．不同温度㊁时间㊁ＩＰＴＧ和菌种浓度对丁肝抗原蛋白表达量的影响［Ｊ］．医学研究杂志，２０１２，４１（５）：３１－３４．（责任编辑：施晓棠）㊀㊀㊃１１４㊃㊀第３期陈立圳等：乳酸菌素ｐｌｎＪ⁃Ｋ蛋白的串联表达。
紫色杆菌素在谷氨酸棒状杆菌中异源表达
紫色杆菌素在谷氨酸棒状杆菌中异源表达孙宏年;毕昌昊;张春枝【期刊名称】《大连工业大学学报》【年(卷),期】2017(036)002【摘要】验证了以产L-色氨酸的谷氨酸棒状杆菌为底盘细胞异源表达紫色杆菌素的可行性.从天然产紫色杆菌素的Janthinobacterium lividum获得了相关生物合成途径的结构基因vioA、vioB、vioC、vioD、vioE,并且在每个基因前面添加谷氨酸棒状杆菌的保守SD序列元件,与穿梭表达型质粒pEC-XK99E通过Golden-gate DNA装配方法构建,转化到能够产L-色氨酸Corynebacterium glutamicum CICC 20192,实现了紫色杆菌素在谷氨酸棒状杆菌中的异源表达.通过对发酵过程中诱导时间的优化,最终90 h的摇瓶分批发酵获得了(1 243士207)mg/L紫色杆菌素,结果表明,谷氨酸棒状杆菌是异源表达紫色杆菌素的合适宿主.【总页数】5页(P79-83)【作者】孙宏年;毕昌昊;张春枝【作者单位】大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034;中国科学院天津工业生物技术研究所,天津 300308;大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034【正文语种】中文【中图分类】Q789【相关文献】1.乳酸菌素基因PlnE和PlnF在大肠杆菌中的异源表达 [J], 杨芳;余占桥;张日俊2.蛹虫草中异源表达天蚕菌素抗菌肽 [J], 黄开华;吴莹莹;唐庆九;李燕;茅文俊;候贝贝;汪滢3.超高效液相色谱-三重四极杆/线性离子阱复合质谱法测定鸡蛋中黏菌素残留的研究 [J], 尹晖;王亦琳;叶妮;孙红洋;孙雷;王鹤佳4.液相色谱-串联三重四级杆质谱法测定果蔬中的阿维菌素 [J], 石红霞;魏万彩;雒淑雯;张亚丽;葛秀琴;闫碗云5.链霉菌SH-62中肠菌素生物合成基因簇的克隆及异源表达 [J], 张怡;鲁洲;黄胜;何璟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
乳酸菌细菌素plantaricin JK的异源表达、分离纯化及抗菌活性
乳酸菌细菌素plantaricin JK的异源表达、分离纯化及抗菌活性蒋晗;刘娇;郦萍;顾青【摘要】In order to obtain the high-yield two-peptide bacteriocin plantaricin JK, pln J and pln K were successfully heterologously expressed in Escherichia coli BL21 (DE3), and were induced by IPTG.Then the two peptides were expressed as His6-tag fusion proteins and were separated by Ni2+ chelating affinity chromatography.The fusion proteins were cleaved by enterokinase and further purified.The yields of pln J and pln K were around 2-3 and 5-8 mg·L-1.The antibacterial activity of the peptides against 4 indicator strains, i.e.Staphylococcus citreus, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Listeria monocytogenes, was analyzed by agar diffusion method.It was shown that pln J and pln K both could inhibit the growth of the 4 indicator strains, but plantaricin JK had larger inhibition zone than pln J or pln K alone.%为获得高产双肽细菌素plantaricin JK,通过PCR扩增获得pln J和pln K基因,构建表达载体pET32a(+)-pln J-BL21(DE3)和pET32a(+)-pln K-BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,利用镍亲和层析柱进行分离纯化,重组蛋白经肠激酶酶切纯化后,细菌素pln J和pln K的产量分别为2~3、5~8 mg·L-1.利用牛津杯平板抑菌法研究抗菌活性,结果显示细菌素pln J和pln K对柠檬色葡萄球菌(Staphylococcus citreus)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)和单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)都有明显抑制作用,且双肽细菌素plantaricin JK的抑菌圈直径大于单独的细菌素pln J或pln K.【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2017(029)002【总页数】6页(P332-337)【关键词】plantaricinJK;异源表达;分离纯化;抗菌活性【作者】蒋晗;刘娇;郦萍;顾青【作者单位】浙江工商大学浙江省食品微生物技术研究重点实验室,浙江杭州310018;中国计量大学浙江省海洋食品品质及危害物控制技术重点实验室,浙江杭州 310018;浙江工商大学浙江省食品微生物技术研究重点实验室,浙江杭州310018;浙江工商大学浙江省食品微生物技术研究重点实验室,浙江杭州 310018;浙江工商大学浙江省食品微生物技术研究重点实验室,浙江杭州 310018【正文语种】中文【中图分类】Q786Heterologous expression and purification of plantaricin JK and analysis of its antibacterial乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是美国食品与药品监督管理局(FDA)认定的食品级微生物，乳酸菌及其代谢产物一般被认为是安全的(generally regarded as safe，GRAS)[1]。
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乳酸菌素基因PlnE和PlnF在大肠杆菌中的异源表达杨芳,余占桥,张日俊(中国农业大学饲料生物技术实验室,动物营养学国家重点实验室,北京 100193)摘要:为获得高产量纯品植物乳杆菌素PlnE和PlnF,研究其开发生物兽药的可能,试验通过人工合成植物乳杆菌素基因PlnE和P lnF,构建表达载体pG EX 4T E和pGEX 4T F,经IPT G诱导表达条件优化后,进行亲和层析纯化融合表达蛋白,并使用SDS PA GE进行鉴定。
试验结果表明,pGEX 4T E和pGEX 4T F构建成功,纯化后获得2种产量高达30%的纯品融合蛋白,SDS PA G E鉴定两融合蛋白表达正确。
说明PlnE和P lnF基因片段编码的多肽能在原核细胞中正确表达,为进一步研究该细菌素的生物活性奠定了基础。
关键词:植物乳酸杆菌;细菌素;原核表达;融合蛋白中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:1671 7236(2010)12 0055 05细菌素是由某些细菌通过基因编码、核糖体途径合成的一类具有抗菌活性的多肽、蛋白质及其衍生物,产生菌对其细菌素具有自身免疫性(Ander s son等,1998;Riley等,2002;T orkar等,2003;Car o lissen M ackay等,1997)。
由于细菌素与抗生素相比无抗药性和残留性,目前国内外对细菌素的研究多数集中在开发替代抗生素治疗使用的生物保健剂和兽药上。
NCBI数据库中确定基因和蛋白质序列的细菌素有数百种,然而仅有一种羊毛硫细菌素Nisin用于食品防腐,绝大多数处于试验阶段,究其原因主要是产细菌素的野生菌株产量低,分离纯化困难,距离产业化生产还有很长距离。
研究结果发现,细菌素异源表达对象多为 a类单肽链非修饰细菌素,最终获得的产物活性产量差异较大(余占桥等,2009)。
低水平异源表达的主要原因是直接表达的细菌素肽链对宿主细胞具有毒害作用,抑制其生长。
若使用 b类双肽链非修饰细菌素(即双肽链共同存在才有抑菌效果的细菌素)进行异源表达,则不存在此问题。
作为自然界中来源广泛、国外使用最多的益生菌乳酸菌,其产生的 b类双肽链非修饰细菌素研究相对较少。
目前发现多数植物乳酸杆收稿日期:2010 04 29作者简介:杨芳(1985-),女,湖北人,硕士生,研究方向:微生物基因工程。
通信作者:张日俊,男,博士生导师,研究方向:饲料生物技术。
基金项目:国家自然科学基金高产广谱细菌素工程菌的构建表达和特性研究!(30972124);国家高技术研究发展计划(863计划)重大项目生物兽药新产品研究与创制!(2006AA10A208)。
菌都产生多种双肽链细菌素,如L.p lantarum J23、L.p lantar um N C8、L.p lantarum J51、L.p lanta r um WCF S1、L.p lantarum C11,这5株植物乳酸杆菌表达的细菌素中,PlnE和PlnF是活性最强、序列最保守的1对,其他几种细菌素均有序列差异。
PlnE和PlnF分别有33和34个氨基酸,当各自以相等数量互补时在纳摩尔浓度即表现出最佳抑菌活性,比各自单独时高1000倍以上,互补肽链的相互作用非常特异,与其他种细菌素互补均不能达到此效果(Erlend等,1998)。
本试验对异源表达 b类双肽链非修饰乳酸杆菌细菌素PlnE和PlnF进行了分离,并构建了原核表达载体,为进一步研究该细菌素的生物活性及探索生产绿色生物兽药奠定了基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株和载体 宿主菌E.coli DH5 和表达菌株BL21(DE3)购自T IAN GEN公司;表达载体pGEX 4T 1质粒由中国农业大学饲料生物技术实验室保存。
1.1.2 试剂 质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自T IA NGEN公司;DNA聚合酶、T4DNA连接酶及限制性核酸内切酶Bam H∀、Sal∀均购自TaKa Ra公司;Glutathione Sepharose4B纯化介质购自GE H ealthcare公司。
引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
1.2 方法1.2.1 基因片段设计与合成 根据NCBI中报道的PlnE和P lnF基因片段,使用软件优化,选择Bam H∀、Sal∀作为基因片段的5∃端和3∃端内切酶位点,在质粒本身携带的GST(谷胱甘肽 S 转移酶)纯化标签后加入一组6个组氨酸的H is tag,增加一种纯化方法;由于pGEX 4T 1质粒携带的凝血酶蛋白位点在切割GST融合蛋白后保留有多余的Gly和Ser,可能会影响细菌素的抗菌作用,故在细菌素结构基因前加入肠激酶位点,蛋白表达后完全切除融合蛋白,得到纯的细菌素PlnE、PlnF。
PlnE (33个氨基酸):FNRGGYNFGKSVRH VVDAIGS VA GIRGILKSIR;PlnF(34个氨基酸):V FH AY SARGVRNNYKSAV GPADWVISAVRGFIH G。
合成基因的碱基序列为:PlnE(160bp):CGC(保护碱基)GGATCC(B am H∀酶切位点)CAT CA T CAT CATCAT CAT(H is tag)GGT ACCGAT GA T GAT GA TAAA(EK位点)TT TAA CCGTGGCG GCTA TAACT TT GGCAAAAGCGT GCGTCAT G TGGTGGA TGCGAT TGGCA GCGTGGCGGGCA TT CGT GGCAT TCT GAAAAGCATT CGTT AAG TCT AC(Sal∀酶切位点)GTCG(保护碱基);PlnF (163bp):CGC(保护碱基)GGATCC(B am H∀酶切位点)CAT CA TCAT CAT CATCAT(H is tag) GGTA CCGAT GAT GA TGATAAA(EK位点)GT GTT TCATGCGTATAGCGCGCGTGGCGTGCGTAA CAACTATAAAAGCGCGGTGGGCCCGGCGGATTG GGTGATTAGCGCGGTGCGTGGCT TTATTCATGG CT AAGTCGAC(Sal∀酶切位点)GT CG(保护碱基)。
1.2.2 引物设计及PCR扩增 PlnE引物:P15∃ CGCGGA TCCC ATC ATC 3∃,P25∃ CGACGTCGACTTA ACGAA TGCTTTTCAGAA TG 3∃;PlnF引物:P35∃ CGCGGA TCCC ATC ATCA TCA TCA TCA TGG 3∃,P45∃ CGACGTCGACTTAGCC ATGAATAAAGCCACGC ACC GC 3∃。
扩增模板为含有合成基因序列的PCR2.1 TO PO E、PCR2.1 T OPO F质粒(上海英骏生物技术有限公司提供)。
扩增程序为:95%预变性5m in; 95%变性1min,58%退火30s,72%延伸30s,30个循环;72%延伸10m in。
PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,检测纯度和大小。
1.2.3 原核表达载体的构建 PCR扩增获得的PlnE和PlnF片段与pGEX 4T 1质粒分别进行Bam H∀、Sal∀双酶切,产物纯化回收在T4DNA 连接酶的作用下16%连接10h,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,涂布于氨苄抗性琼脂平板上,37%培养过夜,选择阳性克隆进行菌落PCR鉴定,抽提质粒后进一步用B am H∀、S al∀双酶切鉴定,阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序。
1.2.4 融合蛋白表达条件的优化 将2个正确的阳性BL21(DE3)表达菌株和含空白质粒pGEX 4T 1的BL21(DE3)菌株分别接种于3mL含50 g/mL氨苄青霉素的LB培养基中,37%,150r/ m in振荡过夜培养。
将活化菌液以0.5%比例接种至培养基,在不同培养温度(25、30、37%)、不同IPT G诱导浓度(0.1、0.3、0.5、0.7mm ol/L)及不同表达时间(1~8h)条件下诱导表达,4%离心收集菌体,超声波破碎后进行SDS PAGE电泳。
1.2.5 融合蛋白的亲和纯化 将含有正确重组质粒的表达菌进行诱导表达后,离心收集菌体。
用PBS缓冲液按1&20的比例重悬菌体后超声波处理,300W,超声4s,间歇6s,60个循环。
4%条件下,10000r/min离心20min,取上清液重复离心1次,上清液经0.45 m过滤器滤过备用。
将10mL Glutathio ne Sepharose4B纯化介质装柱,使用10倍柱体积的PBS流洗,3倍柱体积PBS平衡柱体,样品上清液用PBS稀释一定倍数后过柱,使用10倍柱体积PBS洗柱,最后用5倍柱体积的10m mol/L谷胱甘肽(50mm ol/L T ris H Cl溶解)洗脱目标融合蛋白。
洗脱出的溶液进行SDS PAGE电泳分析。
2 结果与分析2.1 原核表达质粒的鉴定 PCR产物和质粒的酶切产物进行连接并转化E.coli BL21(DE3)细菌后,获得阳性克隆并提取质粒。
重组的质粒经Bam H∀、S al∀酶切后得到大小约为4.9kb和160bp电泳条带,均与pGEX 4T 1和目的基因片段预期值相符,表明PlnE和PlnF基因均已正确插入到表达质粒中。
测序结果表明基因合成正确(图1、2)。
2.2 目的融合蛋白表达条件的优化2.2.1 目的融合蛋白在不同IPTG浓度和温度条件下的表达 将含阳性表达载体的E.coli BL21 (DE3)进行IPT G诱导表达,菌液破裂后取全细胞蛋白质样品进行SDS PAGE电泳,可见目标融合蛋白为30ku,在其条带下方有GST蛋白26ku。
pGEX 4T E、pGEX 4T F表达菌株最佳表达温度均为30%,最佳IPTG浓度为0.5mmo l/L。
两者受不同IPT G浓度和温度影响变化趋势相同,同一温度下,随IPT G浓度增高,目的融合蛋白会有所增高,但非线性变化(图3、4)。
2.2.2 目的融合蛋白不同诱导时长的表达 在30%、IPTG浓度为0.5mm ol/L条件下,pGEX 4T E、pGEX 4T F表达菌株分别在6、7h后达到平稳,在此之前目的融合蛋白的表达与时长呈正相关(图5、6)。
通过Tanon2500软件评估SDS PAGE 电泳每条蛋白带的密度,确定目的融合蛋白最高可占全细胞蛋白的30%。
2.3 目的融合蛋白的纯化 经超声波破碎后的可溶性蛋白质样品液经谷胱甘肽亲和层析纯化后进行SDS PAGE电泳,蛋白凝胶染料显色(灵敏度20ng),得到呈2条带的蛋白质,较大蛋白质为30ku的目的融合蛋白,较小的蛋白质为26ku的GST蛋白,说明目的蛋白得到较好纯化(图7)。