鹅细小病毒的分子生物学研究进展_蒋运博

2012年3月（上）收稿日期：2011-05-09；修回日期：2012-01-29基金项目：吉林省科技厅发展计划项目（20040206－2－2）作者简介：蒋运博（1985－），女，硕士研究生，bobo_jyb@163．com．通信作者：胡桂学（1963－），男，教授，博士，huguixue901103@163．com．鹅细小病毒的分子生物学研究进展蒋运博，董浩，马磊，徐楠楠，段小波，胡桂学（吉林农业大学动物科技学院，长春130118）中图分类号：S852．65+9．2文献标识码：A文章编号：1004-7034（2012）03－0031－03关键词：鹅细小病毒；分子生物学；小鹅瘟摘要：鹅细小病毒（GPV ）病是危害养鹅业的主要传染病之一。

文章根据国内外对鹅细小病毒的分类地位、分子生物学特性、基因组的结构特点、非结构蛋白与结构蛋白的功能以及分子生物学诊断与防治等方面的研究作一综述，以期为鹅细小病毒及小鹅瘟的防控提供参考。

小鹅瘟是由鹅细小病毒（goose parvovirus ，GPV ）引起的雏鹅和雏番鸭的一种急性或亚急性败血性传染病。

该病主要侵害3 20日龄的雏鹅和雏番鸭，以渗出性肠炎、小肠黏膜表层大面积坏死脱落、肠道栓塞为特征性病变，是一种主要侵害肠、肝脏、肾脏、心脏等实质脏器的急性、高度接触性传染病。

1956年，小鹅瘟病毒首次由中国学者方定一在江苏扬州市发现并分离，是一类无囊膜的DNA 病毒。

1974年，国际禽病学会（WPSA ）将其命名为Derzsys 氏病。

近年来，许多国内外学者从不同角度，对鹅细小病毒进行了分子水平上的研究，更好地认识了鹅细小病毒的生物学特性，促进了对该病的有效防制，文章仅对鹅细小病毒分子生物学方面的研究进展作一综述。

1分类地位及一般特性鹅细小病毒属于细小病毒科细小病毒亚科细小病毒属成员，国际病毒分类委员会将细小病毒科分为2个亚科，即细小病毒亚科和浓核病毒亚科，细小病毒亚科又分为细小病毒属、红病毒属和依赖病毒属。

小鹅瘟病毒即鹅细小病毒属于单链线状DNA 病毒，外观呈圆形或六角形，是一种无囊膜的20面体对称病毒，直径为20 25nm 。

该病毒只有1个血清型，与本属其他成员无交叉免疫反应，但区别于本属其他成员的一个显著特点是，迄今尚未发现其有凝集红细胞的性能。

研究表明，该病毒能凝集黄牛的精子［1－2］。

鹅细小病毒对外界因素的抵抗力很强，对乙醚、氯仿、胰酶的处理有抵抗力，对紫外线敏感，56ħ加热1h ，病毒仍能使鹅胚死亡，在50ħ条件下经3h或37ħ条件下经7d 对感染效价无影响。

鹅细小病毒初代分离，只能应用鹅胚和番鸭胚，是自主性细小病毒，无需辅助病毒便可自行复制，复制过程在细胞核内完成，并形成大型包涵体［3］。

鹅细小病毒体外培养具有很强的专一性，除可在鹅胚组织细胞内增殖外，在猪肾上皮、小鼠胎儿成纤维细胞、鸡胚成纤维细胞、兔肾上皮细胞、PK －15细胞、鸭胚的成纤维细胞、肝细胞及睾丸细胞中均未见增殖。

2分子生物学特性2．1基因组结构特征小鹅瘟病毒基因组全长5106nt ，病毒粒子为正链DNA 或负链DNA ，两者的数目基本相等［4］。

基因组包括左右2个开放阅读框［5］，间隔18个碱基，两端含有末端倒置重复序列（ITR ）；左侧的ORF 编码非结构蛋白，即NS1和NS2，产生于病毒复制的早期，也称ReP 蛋白；右侧的ORF 编码3种结构蛋白，即VP1、VP2、VP3，编码3种结构蛋白的核苷酸数目分别为2199nt 、1764nt 和1605nt ，其中VP2和VP3为主要的结构蛋白，VP3是主要的衣壳蛋白，约占总蛋白的80%。

VP1和VP3的起始密码子为2个比较常见的AUG ，VP2基因是以不典型的起始密码子ACG 起始的，而鹅细小病毒的所有毒株都是以ACG 起始的，具有高度的保守性。

2．2复制机理鹅细小病毒的基因组含有发夹结构，其复制是以3'端发夹结构的3'－OH 为引物合成基因组的互补链，形成复制型（RF ）分子，切断亲代链以切口处的3'－OH 为引物，延伸被中断的亲代链，此时3'端发生了倒置重排；在拓扑异构酶的作用下，线性双链分子发生重分异构化，使每条链的两端均形成发夹结构；以一条链的3'端发夹结构为引物，另一条链为模板合成一个新的RF 分子；同时形成基因组DNA ，RF 分子进入新一轮的DNA 复制。

新合成的基因组即可以作为模板复制新的子代基因组，也可被包装进入衣壳13《黑龙江畜牧兽医》科技版形成子代病毒粒子。

2．3蛋白及功能VP1基因全长为2199nt，起始密码子位于2439nt处。

VP1蛋白多肽由732个氨基酸组成，含有VP2、VP3的全部氨基酸序列，VP1、VP2、VP3具有相同的羧基端。

VP1可协助病毒或DNA通过核孔转运至细胞核内，还可与宿主细胞的特殊受体结合，使病毒粒子进行有效感染［6］。

VP2和VP3蛋白是主要的结构蛋白，起始密码子分别位于2874nt和3303nt处。

VP2是主要免疫功能区，具有免疫原性，能刺激机体产生抗体，其起始密码是ACG，终止密码是TAA，基因大小为1764nt。

VP3基因全长1605nt，编码534个氨基酸，具有高度的保守性。

有学者对鹅细小病毒氨基酸序列进行配对分析，结果表明VP3内含有鹅细小病毒主要抗原决定簇成分，是决定病毒毒力的基因。

在病毒的致病性中，基因起重要作用，由1884个核苷酸组成，编码627个氨基酸，起始密码子为GTG，在病毒复制早期产生NS1基因，NS1蛋白参与病毒对细胞的毒性作用、基因表达及病毒的复制。

NS2基因由1356个核苷酸组成，编码451个氨基酸，NS2蛋白能够促进NS1蛋白对细胞的毒性作用，NS2蛋白还可能与蛋白和病毒DNA的有效合成以及病毒的增殖有关［7］。

2．4分子生物学检测技术目前，鹅细小病毒的检测方法有很多，包括琼脂扩散实验、免疫荧光技术、电镜技术、PCR技术、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫组织化学技术、免疫酶扩散试验等，但是近几年，用来检测鹅细小病毒的技术有了新的进展。

研究表明，应用直接免疫过氧化物酶染试验，检测细胞培养物和雏鹅组织中的鹅细小病毒，具有特异、快速、敏感等优点，并可进行抗原定位。

潘玉民等建立了用于诊断小鹅瘟感染的免疫荧光技术，对各脏器检出率依次为肾脏＞肝脏＞胰脏＞脾脏＞心脏＞肺脏＞脑，具有特异、快速、敏感、简便等优点，也可进行抗原定位。

2006年，布日额等首次应用鹅细小病毒的VP3基因重组原核表达产物建立了检测鹅细小病毒抗体的间接ELISA及Dot－ELISA方法，为准确、快速地检测鹅细小病毒及流行病学调查提供了有效的方法［8］。

2009年，贺云霞等应用鹅细小病毒的VP3基因以外的基因片段原核表达多肽作为检测抗原，建立了VP3亚单位抗体的Dot－ELISA 方法及鉴别鹅细小病毒全病毒抗体，该方法检测鹅细小病毒血清抗体的阳性率为100%，为鹅细小病毒VP3基因工程疫苗的成功应用和推广提供了可靠的技术支撑。

鲜思美等［9］建立了鉴别番鸭细小病毒（MDPV）与鹅细小病毒的PCR诊断方法，对鹅细小病毒、番鸭细小病毒培养物及其核酸进行了扩增。

结果发现，该方法可以有效区分番鸭细小病毒和鹅细小病毒，从而为鹅细小病毒和番鸭细小病毒的鉴别提供了一种简捷而快速的方法。

2008年，付薇等采用SYBR GreenⅠ荧光染料建立了小鹅瘟病毒荧光定量PCR检测方法，该方法具有成本低和精确定量的优点。

还有学者利用地高辛标记核酸探针，建立了检测病料中番鸭细小病毒核酸的斑点杂交法，该法较常规的血清学方法快速、敏感，其灵敏度可达3pg，从而又为小鹅瘟的诊断提供了更加有效的技术手段。

此外，动物保护试验、对流免疫电泳法和透射电镜法也可用于小鹅瘟的检测和诊断。

2．5基因工程预防技术小鹅瘟传统疫苗在该病的防治中起到了关键的效果，但还存在很多缺点，开展基因工程预防技术研究将成为未来发展的趋势。

2．5．1原核表达研究在各种表达系统中，原核表达系统是最早被采用和目前掌握最为成熟的表达系统。

原核表达技术的主要方法是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，以构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达，其优点在于能够在较短的时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。

2002年，李雪梅等［10］将主要结构蛋白VP2－VP3基因克隆到原核表达载体PET28（a）上，构建了原核表达载体Pegvp1，转化到宿主菌BL21，经IPTG诱导检测到表达的蛋白，利用Western－blot进行分析，结果表明表达蛋白具有很好的特异性。

2006年，王静等将鹅细小病毒的衣壳蛋白基因分出2个基因片段，分别为从VP1的5'端到662位核苷酸和从VP3的3'端到864位核苷酸，并将其连入原核表达载体pPROEXtxuHTb和PET30（a），再将重组质粒分别转入大肠杆菌DH5α和BL21中进行表达，用表达产物免疫新西兰兔，制备兔抗血清，利用Western－blot进行检测。

结果表明，重组质粒表达的蛋白具有良好的抗原性，但原核表达系统还存在许多难以克服的缺点，如通常使用的表达系统无法对表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难，而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的活性较低，为了克服原核表达系统的不足，许多学者将原核基因调控系统引入了真核基因调控领域。

2．5．2核酸免疫研究核酸疫苗被看作是极具发展潜力的第3代疫苗。

核酸免疫已成为预防和治疗传染病的一种有希望的基因治疗方法，将带有病原体抗原基因的质粒DNA直接导入宿主细胞，可激发出针对编码抗原的特异性细胞免疫应答和体液免疫应答，在短短的几年中核酸免疫已取得了长足的进展。

2008年，许洪洁等［11］将鹅细小病毒的VP3基因克隆23Heilongjiang Animal Scienceand Veterinary Medicineɴ320122012年3月（上）到真核表达载体pVAXI上，成功构建了含VP3基因的鹅细小病毒真核表达载体pVAXI－VP3，将此真核表达载体和空载体pVAXI分2组肌肉注射免疫小鼠。

间接ELISA检测结果表明，该真核表达载体质粒免疫组小鼠血清中鹅细小病毒特异性抗体水平显著高于空载体组，并可以诱导小鼠产生明显的体液免疫，为小鹅瘟核酸疫苗的研究奠定了基础。

卢菲等［12］将小鹅瘟VP3基因制成了小鹅瘟VP3基因疫苗（pcDNA－GPV－VP3），将其按6μg/只基因枪轰击和100μg/只肌肉注射免疫Balb/c小鼠，然后用流氏细胞仪和淋巴细胞转化试验检测小鼠外周血液中T淋巴细胞的动态变化，用间接ELISA方法检测小鼠特异性IgG抗体水平。