免疫学方法联合检测血吸虫病的初步研究

免疫学方法联合检测血吸虫病的初步研究[摘要] 目的了解血吸虫病血清学检测方法的联合应用的效果，为制定防治对策提供科学依据。

方法选择46例慢性血吸虫病患者及42例健康人作为研究对象，采用间接血凝法（IHA）、金标渗滤法（DIGFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）分别检测其抗原和抗体，了解3种方法的敏感性与特异性，以及3种方法不同组合的检出阳性差别。

结果IHA抗体检测敏感性为76.09%，特异性为95.24%；DIGFA抗体检测敏感性为69.57%，特异性为97.62%；ELISA循环抗原检测敏感性为32.61%，特异性为92.86%；任意2种方法阳性联合判定总的敏感性为65.22%，特异性为97.62%；3种方法同时阳性联合判定的敏感性为23.91%，特异性为100%。

结论血吸虫病血清学检测循环抗原敏感性和特异性较差；任意2种方法联合阳性判定总的敏感性与特异性与单独IHA、DIGFA相似，无实际意义；检测抗体的IHA、DIGFA和检测循环抗原的ELISA 3种方法联合阳性判定的敏感性与循环抗原ELISA相似，但特异性高，似与病原学诊断有相仿的意义，可在流行病学调查研究中结合运用。

自20世纪80年代以来，血吸虫病免疫诊断已逐渐整合到我国防治规划和防治工作中，对我国取得的血吸虫病防治进展，起了非常重要的作用[ 1]，但检测抗体的各种免疫学方法在现场应用的结果大多都显示假阳性较高[ 2]，而检测抗原的方法又因为免疫复合物在体内的变化大多敏感性和特异性较差，因此用检测抗原与抗体的方法对同一血清样品进行联合检测，以达到降低假阳性，提高特异性的目的，同时对宝贵的血清资源进行充分利用，以期得到更多的流行病学信息，为此，设计了下列试验。

1.材料与方法1.1试剂盒的选择选择目前现场应用最多最为成熟经典抗体法IHA（日本血吸虫抗体检测试剂盒，安徽安吉医药有限公司生产，批号20090420）、现场应用较为方便的金标渗滤法DIGFA（日本裂体吸虫Ab测试盒，深圳康百德生物科技有限公司生产，批号20100807）以及有疗效考核价值的循环抗原免疫酶法ELISA（血吸虫循环抗原（scAg）测定试剂盒，四川迈克生物科技股份有限公司生产，批号0810091）作为试验研究的组合方法。

1.2样本量的估计3种试剂盒的报道灵敏度和特异度均在90%以上[3-5]，故评价的所需样本量为40以上。

1.3分组选择病原学确诊的46名慢性血吸虫病患者为研究对象，采集治疗前血清；选择42名某单位职工（主要为临床后勤人员）体检时健康血清，排除血吸虫病感染史，且B超显示无血吸虫性肝损伤的作为对照。

病例平均年龄39.5岁（最大63岁，最小16岁），对照平均年龄36岁（最大60，最小25），经检验年龄分布差异无统计学意义（t=0.66，P>0.05）,病例与对照基本齐同。

1.4实验过程于2010-08开始实验，对采集的慢性血吸虫病患者血清及健康人血清样本重新编号，双盲法进行实验，详细操作方法均按试剂盒的说明书进行。

IHA以血清稀释度1：10作为本试剂盒的阳性参考值，被测血清阳性反应稀释度≥1：10判为阳性。

DIGFA以反应板中央出现“+”字红线为阳性。

ELISA采用酶标仪读取OD450nm 值，Cutoff值=0.12+阴性对照OD450nm均值，样本OD450nm≥Cutoff值为阳性。

1.5联合判定方式试验结果判定按试剂盒要求，每个样本可用3种方法检测出现3种结果，以出现2项以上阳性为阳性判定,即任意2种阳性为二联，3种方法同为阳性为三联，见表1。

2结果2.1联合判定与3种方法的检出效果比较试验结果表明IHA敏感度为76.09%，特异度为95.24%；DIGFA敏感度为69.57%，特异度为97.62%；ELISA敏感度为32.61%，特异度为92.86%；以IHA联合DIGFA共同阳性敏感度为60.87%，特异度为97.61；以IHA联合ELISA共同阳性敏感度为26.09%，特异度为100%；以DIGFA联合ELISA共同阳性敏感度为26.09%，特异度为100%；以出现两种阳性就作为阳性总的二联判断的敏感性为65.22%，特异度为97.62%；以3种方法同为阳性作为阳性的三联判断的敏感性为23.91%，特异度为100%，见表2。

2.2 联合判定与3种方法的一致性（符合度、相关性）及差异性分析用双阳联合判定的结果分别与3种方法相关性及差异性的分析，结果表明，双阳联合判定与3种方法均相关（χ2=16.95，P<0.01；χ2=26.35，P<0.01；χ2=4.51，P<0.01），与IHA、DIGFA的检出阳性没有区别（χ2=2.28；P>0.05；χ2=0.25，P>0.05），但与ELISA的检出阳性有区别（χ2=11.84，P<0.01），见表3。

用三阳联合判定的结果分别与3种方法相关性及差异性的分析，结果表明，三阳联合判定与3种方法均相关（χ2=5.82，P<0.01；χ2=4.57，P<0.05；χ2=25.98，P<0.01），与IHA、DIGFA的检出阳性有区别（χ2=17.05；P<0.01；χ2=19.05，P<0.01；），但与ELISA的检出阳性没有区别（χ2=2.25，P>0.05），见表4。

3 讨论血吸虫病免疫诊断方法具有较高的敏感性和特异性以及疫区群众的依从性较高等优点, 已为广大专业人员和疫区群众所接受, 并在对疫区化疗对象的大规模筛查和血清流行病学调查以及防治效果的评价等方面起到了极为重要的作用[1]。

经典的抗体检测方法敏感性和特异性尚好，但有效治疗后，感染者血清中的抗体可以长期存在，无法区分既往感染和现症感染，难以用抗体检测的一项指标判定当地血吸虫病的流行率。

且用单一的抗体检测指标确定化疗对象，势必造成大量治疗病人反复用药，增加社会经济负担，浪费医疗资源，也可能潜在的造成吡喹酮的耐药性。

国内对联合检测的研究不多，在血吸虫病诊断方面管晓虹[6]首先提出这个思想,谢红歌[7]等曾经使用3种免疫学方法联合诊断结核病，证实联合检测同时阳性比单独法检测低或相当，但特异性提高了。

余轶婧[8] 等曾尝试过循环抗原及血清抗体的联合检测诊断日本血吸虫病两项的联合，证实在检测粪检阳性血吸虫患者血清中, 循环抗原和血清抗体检测均存在漏检，因此采用联合检测具有互补价值。

谢朝梅[9] 、陈军虎[3]等曾做过3种血清学方法在血吸虫病重度流行区的检测效果比较，但多为平行检测等，蒋斌[10]等也曾做过联合检测，但仅是两种抗体检测的联合。

何伟[11] 也做过这方面的研究，证实在山丘型流行区粪检方法尤其是Kato-Katz 法漏检率较高，以其作为评价免疫诊断方法的标准似不合适。

而以DD IA、EL ISA 和CO PT 法检测同为阳性并且从未用过抗血吸虫药物者作为阳性者, 以3 法检测结果同为阴性者作为阴性者。

提出了3种同为阳性的联合判定方式，但他们所选择的3种均为检测抗体的方法，故设计了以循环抗原检测结合抗体检测的设计思路，在现有技术尚不能提高循环抗原敏感性的状态下，是否能先提高特异性作为短期目标，设想是在不增加现场查病的工作量的前提下，充分利用采集的血清样本，以及充分利用目前建立参比实验室条件，能够更准确的锁定化疗对象，提供有力的化疗依据，达到合理利用化疗药物，提高群众查病的依从性，有效锁定目标人群的目的，故试用了联合检测的方法。

联合检测, 理论上可提高检测的灵敏性或特异性, 增加检测结果的可行度。

根据概率的乘法原理，并联一般可提高灵敏度，串联可提高特异度，以诊断心肌梗死的3种酶CPK,SGOT,LDH 为例，其灵敏度分别为：96%，91%和78%；特异度分别为：57%，74%和91%。

没有一种是很特异的，如单独使用其中一种试验，则许多人将被误诊为心肌梗死。

如采用系列试验，即当3种酶测定都显示阳性才诊断为心肌梗死，此时灵敏度为68%，但特异度为99%，减少了误诊的机会[12]。

由此设计了血吸虫病的3项血清学检测技术的联合检测，采用2种抗体检测结合1种循环抗原检测的串联方法，在国内尚属首次，对联合判定的结果与各项单独判定的结果进行了统计学分析。

该研究发现，IHA及及金标的敏感性及特异性均没有研究人员及其他研究报告的高，由于病例数太少具体原因仍有待进一步分析。

而循环抗原ELISA检测试剂盒的敏感度和特异度均确实较差，敏感性仅32.61%，特异性仅92.86%，约登指数仅0.25，与常规试剂盒要求0.6的相差甚远，故达不到现场应用的要求，尤是特异度仅92.86%，即假阳性有7.2%左右，高于一般试剂盒要求的5%以下，故单独应用循环抗原试剂盒进行现场调查是不恰当的。

但若以循环抗原结果两项循环抗体同时进行联合判定，则特异性可达到100%，理论上可等同与粪检的特异性。

而以IHA、DIGFA分别结合ELISA联合检测的特异度也可达到100%，但考虑到单独3个方法均有假阳性存在，且IHA联合DIGFA的检测也存在假阳性，故认为抗体结合抗原的二联检测方法在现场工作中可以结合应用并加以验证。

经配对卡方检验，以双阳判定联立检测总检出阳性的结果与常规的IHA和DIGFA差不多，与IHA和DIGFA和ELISA均相关(χ2=16.95 P<0.01，χ2=26.35 P<0.01，χ2=4.51 ，P<0.05，)，但检出的阳性率和特异性与IHA和DIGFA没有统计学差别(χ2=2.28 P>0.05，χ2=0.25 P>0.05)，而与循环抗原ELISA检测有差别(χ2=11.84 P<0.01)，故若以3种方法联合检测但以双阳作为阳性判定似乎没有多大意义，若以三阳判定，检验结果仍与3种方法相关（χ2=5.82，P<0.01, χ2=4.57, P<0.05, χ2=25.98, P<0.01）,但检出阳性与IHA和DIGFA有区别（χ2=17.05，，P<0.01, χ2=19.05, P<0.05, ）但与循环抗原ELISA没有区别（χ2=2.25, P>0.05），检验效率与循环抗原相似，虽灵敏度低于各个单独的方法，但特异性可达100%，这是目前没有一种免疫学方法可以达到的。

王显红[13]等采用贝叶斯（Bayes）统计方法，利用2005年云南省洱源县现场调查资料，对2种方法（ELISA 和Kato-Katz）在流行区和非流行区的检测效果分别进行了评价：在流行区，ELISA 灵敏度较高（0．913，中位数，下同）而特异度较低（0．584），Kato－Katz 法灵敏度低（0．148）而特异度很高（0．994）。