细胞培养10
细胞实验的基本操作
细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。
细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。
1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。
通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
细胞培养的方法与步骤
细胞培养的方法与步骤1．开紫外灯前先擦超净台，台内紫外30分钟，室内紫外10分钟。
同时将放在4℃内的培养液提前放置到室温。
（可放在抽屉中，防止紫外照射）换液2．先将培养液打开（开一层烧一层），放置在酒精灯旁。
3．将细胞从培养箱中拿出，进超净台前先要喷酒精。
4．打开培养瓶，烧瓶口，而后弯脖朝后，倒液，注意瓶口不要残留液体，若有残液要用纱布擦净。
5．倒培养液（之前要烧瓶口），注意量（5ml）不要再瓶口有残留液体是烧瓶口，否则碳化的培养液会对细胞的生长有毒害作用。
6．倒一瓶封一瓶，迅速放平，培养瓶口拧紧后再松一下，放入培养箱中。
传代2．拿出细胞，开口，烧，倒液。
3．（5ml大枪加3ml）用PBS洗2~3遍（洗净血清，放置血清钝化胰酶）。
4．胰酶消化，37℃5分钟（时间可自控）。
消化程度是细胞不能滑落，要吹落。
500微升胰酶（4×，1%）+1.5mlPBS→工作浓度0.25%（此时要用大枪）。
5．（大枪）加入3mlDMEM完全培养液终止消化，用吸管缓慢吹打壁上的细胞（不要让吸管的嘴端接触到瓶壁）6．将混合物吸入离心管，加封口膜，离心500g 5分钟（此时洗去胰酶）在此期间PBS 洗培养瓶3遍，PBS一定要吸净，否则加入培养液后会产生沉淀（培养瓶要重复使用，至少100次）7．倒掉上清，此时动作要轻或用大枪吸，加入3mlDMEM完全培养液重悬细胞，用吸管吹掉（再洗，清除胰酶）。
8．离心完毕，加入3ml新鲜培养液，再次吹打（约50~100下，视细胞情况而定），防止起泡沫，至细胞单个，圆球状为宜。
9．在培养瓶中加入新鲜培养液4ml，将吹打起来的细胞分配至各培养瓶中（量依需要而定）。
80微升，100微升都可以。
冻存8．在冻存管中加入200微升冻存液，在离心管中加入1000微升冻存液，吹打（防止起泡），移入冻存管中，此段时间不宜过久（DMSO对细胞伤害很大）。
9．封口膜封紧冻存管，可多封几层，用胶布缠紧，只缠一层就行，然后写字。
第十章植物细胞培养的基本过程和方法ppt课件
二、通过愈伤组织诱导获取植物细胞
愈伤组织的概念--P173 形成过程： 1、起始期； （诱导期） 准备进行分裂 2、分裂期；细胞体积变小→分生状态 3、形成期。大小稳定 内部深层细胞开始分裂
怎样从愈伤组织分离得到细胞？
P175 获得愈伤组织后，挑选质量好的愈伤组 织块，用无菌的镊子或小刀分割得到植物小 细胞团，也可以将愈伤组织转移到液体培养 基中，加入经过灭菌处理的玻璃珠，进行振 荡培养，使愈伤组织分散成为小细胞团或单 细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤， 除去大细胞团和残渣，得到一定体积的小细 胞团或单细胞悬浮液。
份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平
铺于培养皿中，厚度约1~2mm。 封口：用石蜡膜封培养皿。
2、看护培养
看护培养（nurse culture）：是由Muir1954年设计的。
操作方法： 在固体培养基上置入一块 活跃生长的愈组织，再在愈 伤组织上放一小片滤纸，待 滤纸湿润后将细胞接种于滤 纸上。当培养细胞长出微小 细胞团以后，将其直接转至 琼脂培养基上让其 迅速生长
第四节 单细胞培养
悬浮培养不能对某一细胞进行定点观察 和分析，也就不能进行定点选择。因此，在 进行细胞株（种子细胞）选择和需要对细胞 活动跟踪观察的情况下，必须进行真正意义 上的单细胞培养。由于植物细胞的团聚性， 单细胞培养还比较困难。
1、平板培养 2、看护培养 3、微室培养 4、条件培养（双层滤纸培养）
细胞生长指标
1、细胞生长计量: 细胞计数 细胞密实体积 细胞鲜重 细胞干重
2、细胞活力测定
悬浮细胞培养的同步化
细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
植物细胞在悬浮培养中的游离性较差， 容易团聚进入不同程度的分化状态，因此 要达到完全同步化相当困难。
细胞培养操作规范
细胞传代方法： 传代指针： 观察培养基颜色：当培养基的颜色由红色渐渐褪成橙黄色，颜色清亮，无杂质，无浑浊 显微镜观察细胞生长状态：细胞生长状态良好，铺满培养瓶80%以上，细胞透亮，形态清晰，间隙无杂质，确认无细菌真菌污染
传代方法：
将新的培养皿、吸管、废液缸放入工作台开启细胞培养房及工作台紫外消毒20分钟， 开启恒温水浴箱，培养液、消化液预热 关毕紫外灯，开灯，通气，点燃酒精灯 吸弃培养基，PBS清洗两次 加入2ml消化液晃动培养瓶使消化液覆盖整个细胞界面后吸弃培养液 肉眼观察细胞培养瓶底部出现一层云雾状，轻轻敲打底部有块状物脱落，显微镜下观察看到细胞间隙变大，细胞回缩变圆少量漂浮后加入10ml含血清培养基终止消化，吹打管吹打数次 将细胞悬液吸至离心管，1000rpm离心5分钟 吸弃上清，加入PBS吹打混匀， 1000rpm再次离心5分钟 吸弃上清，加入新鲜培养基，吹打混匀，按比例接种到细胞培养瓶
细胞消化时间的控制：Leabharlann 细胞冻存：胰酶消化
细胞计数
贰
壹
叁
细胞计数
细胞计数板计数室构造 数红色边框标记的四个方格内的细胞总数（如有压线则计上不计下，计左不计右） 细胞数/ml=（4个大方格细胞总数/4）×104×稀释倍数
四、细胞培养注意事项
实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射20-30分钟灭菌，以75 %酒精 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。
每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以75 %酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作
细胞培养—传代—冻存—western blot等实验相关步骤
围绕siRNAs的相关实验详细步骤及总结实验一：细胞传代培养材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、培养瓶、含10%FBS 的RPMI—1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、PBS、trypsin等步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（SKOV-3）1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；含10%FBS的RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。
2、取一个生长良好的细胞培养瓶（密度适中，细胞成梭形连接，贴壁良好），弃旧培养基，PBS 2ml 清洗2次（切勿用力吹打）。
3、用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入，然后放平培养瓶，使贴壁细胞与trypsin充分接触，置于CO2培养箱2min左右（时间不能太长，以免损伤细胞）。
4、往培养瓶中加入1640 1~2ml，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心1000 r/min，5min。
5、弃上清液，加入少量10%FBS的1640培养基使成细胞悬液。
6、分装，按1:2~3传代，每瓶4~5ml。
倒置显微镜下观察（细胞突起消失变圆形，细胞间隙等距），标记。
7、放入CO2培养箱中培养，第二天观察生长状况。
总结：1、在用离心机时，看清楚是RCF还是RPM；调节Temp.以及Time。
2、在用移液枪吸出trypsin充分消化后的细胞后，须知用少量培养液清洗一下培养瓶，并将清洗液移入离心管中。
3、每取用一个容器，拧开或者拧上盖子时，注意在酒精灯上旋转一圈。
另外，记住用酒精棉球经常擦拭台面。
4、在用移液枪或者吸管混匀细胞悬液过程中，动作轻柔，避免产生气泡等。
实验二：细胞冻存材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、冻存管、RPMI —1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、FBS、PBS、trypsin、DMSO等步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（OVCAR-3）1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；FBS、RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。
细胞培养试剂及操作流程
实验规范化流程一、细胞培养所需1、10%FBS 1640培养液。
2、10%FBS DMEF/12培养液。
3、10%FBS DMEM/High Glucose 培养液。
4、PBS ：商品化的粉末，一袋溶于2L 去离子水中，高压后4℃保存。
5、胰酶6、冻存液：10%DMSO 、>10%FBS ，其余成分为16407、真核抗生素：G418: 50mg/mlMDA-MB-231 800ug/mlMCF-7 800ug/ml SK-BR3 100ug/mlT47D 400ug/ml)嘌呤霉素（Puromycin ）:10mg/mL 、MCF-7 4ug/ml T47D 1ug/mlMDA-MB-231 5ug/ml潮霉素（Hygromycin B ）:50mg/mL T47D 200ug/mlMDA-MB-231 800ug/mlMCF-7 50ug/ml 8、原核抗生素：双抗（抗青霉素、链霉素）（使用浓度：1%原液）环丙沙星左氧氟沙星（储存浓度5mg/ml ，使用浓度5ug/ml ）9、细胞因子：IL-6、EGF （10ug/ml ）10、抗肿瘤药物：阿霉素（储存浓度50Mm,使用浓度0.01mM ）一、细胞培养相关技术1、细胞复苏准备：37℃水浴锅、培养液、15ml 离心管、滴管、培养瓶或培养皿试验流程：（1）将细胞从-80℃或液氮取出，遵”慢冻速溶“的原则，迅速在37℃下使其液化。
（2）将融化的细胞悬液加入适量新鲜培养液稀释吹匀，转移到15ml 离心管内。
（3）将离心管以1000rpm 转速离心5min 。
（4）小心弃去上清，最好用枪头除尽，加入新鲜的培养液6ml ，重选吹匀后转移到细胞培养瓶或培养皿，放入37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。
2、细胞传代准备：胰酶、培养液、培养瓶或培养皿、15ml离心管、滴管实验流程：（1）将覆盖率达80-90%的对数生长期细胞弃去培养液，尽量将培养液洗净，必要时加PBS冲洗，以防止培养液对胰酶的终止作用。
细胞培养操作指南
细胞培养操作指南1，原代细胞培养原代培养需要严格要求：（1）取材时需要去除脂肪和坏死的组织(2)为减少对组织的损伤，需用锋利的器具(3)适度离心以去除用于解离的酶（4）由于原代培养组织细胞的存活率很低，故用于原代培养的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度。
（5）营养丰富的培养基比单一的培养基更可取，如果要添加血清，胎牛血清比牛马的血清更好。
(6)对于取材部位易于感染（如皮肤）应先用70%乙醇消毒，在无菌条件下切除组织，尽快转移入BSS或培养基中。
不要再培养室取材，因为动物可引入微生物污染。
若必须推迟，可保存在4℃，72h。
1. 剪切组织先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除粘附的结缔组织等非培养所需组织。
再次清洗后，用手术剪将组织剪成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。
静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。
2. 消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。
3. 培养细胞悬液用计数板进行细胞计数，用培养液将细胞数调整为2～5×105 cells／m1，或实验所需密度。
分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。
置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。
一般3～5d，原代培养细胞可以粘附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3 d后换液，一般7～14 d可以长满瓶壁，进行传代。
注意事项：1. 无菌操作细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般是很难消除。
2. 培养液所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。
由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。
细胞培养用营养液及溶液配制方法
细胞培养用营养液及溶液配制方法
1.平衡盐溶液
1.1汉氏液(Hank’s液）
10倍浓缩液每1000ml中含
甲液氯化钠80g
氯化钾 4.0g
氯化钙 1.4g
硫酸镁（7个结晶水） 2.0g
乙液磷酸氢二钠（12个结晶水） 1.52g
磷酸二氢钾0.6g
葡萄糖10g
1%酚红溶液16ml
将甲液与乙液中的各种试剂按顺序分别溶于注射用水450ml中，然后将乙液缓缓加入甲液中，边加边搅拌。
补注射用水至1000ml，用滤纸过滤后，加入氯仿2ml，置2~8℃保存。
使用时，用注射用水稀释10倍，经116℃灭菌15min。
使用前，以7.5%NaHCO3溶液调PH之至7.2~7.4。
1.2依氏液(Earle’s液）
10倍浓缩液每1000ml中含
氯化钠68.5g
氯化钾 4.0g
氯化钙 2.0g
硫酸镁（7个结晶水） 2.0g
磷酸氢二钠（1个结晶水） 1.4g
葡萄糖10g
1%酚红溶液20ml
其中，氯化钙应单独用注射用水100ml溶解，其他试剂按顺序溶解后，加入氯化钙溶液，然后补足注射用水1000ml。
用滤纸过滤后，加入氯仿2.0ml，置2~8℃保存。
使用时，用注射用水稀释10倍，经116℃灭菌15min。
使用前，以7.5%NaHCO3溶液调PH之至7.2~7.4。
1.2依氏液(Earle’s液）。
细胞培养实验报告
细胞培养实验报告细胞培养实验报告细胞培养主要包括细胞复苏、细胞传代和细胞冻存三个过程。
一、实验仪器及用品（一）超净台：1.枪头：10 mL、5 mL、1 mL、200 μL、10 μL；2.移液枪：同上，及相应的支架；3.离心管：50 mL、15 mL、1.5 mL，及相应支架与盛皿；4.记号笔；5.PBS缓冲液；6.酒精棉；7.废液杯×2：一个装枪头，一个装废液；8.封口膜；9.排枪卡槽；（二）细胞间：1.离心机：中型、小型；2.培养瓶：透气的用于培养，密封的用于运输，培养皿；3.灭菌离心管、枪头、冻存管等备用；4.毛巾、手套、口罩、酒精喷壶、灭菌超纯水、除菌滤膜；5.100 μL排枪；6.血球计数板、载玻片；7.水浴锅；（三）冰箱：1.双抗、环丙沙星；2.4℃：DMEM、1640、PBS、已配培养基；3.-20℃：MTT、MTS、DMSO、血清、胰酶；（四）缓冲间：罐、液氮罐；1.CO2（五）换衣间1. 实验服、拖鞋、手套、口罩、酒精喷壶；二、实验前准备（一）实验前将需要带入的物品洗净、高温灭菌、喷酒精，放入传送窗，将传送窗与细胞间紫外开启杀菌半小时；（二）半小时后关闭紫外，开启风阀与空调，散去臭氧，双手用洗手液洗净擦干后进入换衣间，换上隔离服（若不使用超净台，换实验服即可），戴上口罩、手套喷酒精，进入缓冲间风浴1-3 min；（三）进入细胞间，冰箱中取出所需溶液（胰酶、培养基等）置于超净台中，开启超净台紫外，关闭传送窗紫外，将物品取出后喷酒精后放于应处位置；注：若是冬天，溶液应在37℃水浴后再使用，所有物品放入超净台前均需再喷酒精，特别是盖口处。
三、细胞培养（一）细胞复苏1. 培养基配制：倒出50 mL培养基，加入50 mL血清，5 mL双抗（浓度10-50 μg/mL环丙沙星可作用一周抑制支原体生长），分装3天够用的培养基即可，所有都用封口膜封住；2. 冻存液配制：1 mL DMSO、2 mL血清、7 mL培养液混合；3.37℃温育DMEM培养液（含双抗和血清）。
体细胞培养标准
体细胞培养标准
体细胞培养标准操作主要包括细胞复苏、细胞传代和细胞冻存等步骤。
一、细胞复苏
1.从冻存管中取出细胞，放入37℃水浴中迅速解冻。
2.将解冻后的细胞悬液转移至培养瓶中，用PBS清洗两次，以去除残留的冻存液。
3.加入适量新鲜培养基，将细胞悬液浓度调整至适当水平。
4.将培养瓶放入37℃、5% CO₂的恒温培养箱中，进行细胞培养。
二、细胞传代
1.当细胞融合率达到80%时，用胰酶或胶原酶消化细胞，分散成单个细胞。
2.将消化后的细胞悬液转移至新的培养瓶中，加入适量新鲜培养基，将细胞悬液浓度调整至适当水平。
3.将培养瓶放入37℃、5% CO₂的恒温培养箱中，继续进行细胞培养。
三、细胞冻存
1.将细胞沉淀至离心管中，用PBS清洗两次，去除残留的培养基。
2.加入冻存液（10% DMSO +90%胎牛血清），轻轻混匀。
3.将离心管放入-80℃的冰箱中，进行慢速冻存。
4.当细胞悬液完全冻实后，将其转移至液氮中，长期保存。
四、体细胞培养的特点
1.严格的无菌操作：为避免细胞污染，需在无菌环境下进行细胞培养。
2.适宜的培养条件：细胞生长需要适宜的温度（37℃）、湿度（5% CO₂）
和营养环境（培养基）。
3.细胞数量控制：细胞传代前融合率应达到80%，冻存时每管细胞量应达到规定数量。
4.质量控制：监测细胞数量、活率、表面标记、支原体和内毒素等指标，以确保实验结果的准确性和可靠性。
5.应用广泛：体细胞培养技术在生物学、医学、生物工程等领域具有广泛的应用价值，可用于研究细胞生长、分化、信号传导等生物学过程。
培养细胞的流程
培养细胞的流程
细胞培养是生物学实验中非常重要的一项技术，它可以用于细胞生物学研究、药物筛选、疾病模型建立等多个领域。
下面将介绍一般细胞培养的流程。
首先，准备工作。
在进行细胞培养前，需要准备培养皿、培养基、细胞传代所需的胰酶等材料。
同时需要消毒工作台和培养箱，确保实验环境的无菌。
接着，解冻细胞。
如果是从冷冻状态中取出细胞进行培养，首先需要将冻存管放入37摄氏度的水浴中迅速解冻，解冻后将细胞转移到预先加热的培养基中。
然后，传代细胞。
当细胞生长到一定密度时，需要进行传代操作，以保证细胞的健康生长。
传代操作需要用到胰酶等酶类物质，可以将细胞从培养皿中剥离出来，然后转移到新的培养皿中。
接下来，细胞培养。
将细胞悬浮在培养基中，放入培养箱中进行培养。
培养箱中需要保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度，以提供良好的生长环境。
最后，细胞观察和实验。
在细胞培养的过程中，需要定期观察细胞的形态和生长状态，确保细胞的健康生长。
同时可以进行相关的实验，如药物处理、基因转染等。
综上所述，细胞培养是一个复杂而又重要的实验技术，需要严格控制实验条件，确保细胞的健康生长。
通过以上流程，可以有效地进行细胞培养，并为后续的实验提供可靠的细胞基础。
实验室细胞培养的一般步骤
实验室细胞培养的一般步骤细胞培养是一项重要的实验室技术，广泛应用于生命科学研究以及医药产业中。
下面将为您介绍一般的细胞培养步骤，希望能为您提供一些指导意义。
第一步：制备培养基细胞培养的第一步是制备适合细胞生长的培养基。
培养基通常包括营养物质、氨基酸、维生素、生长因子等，可以为细胞提供足够的养分和环境条件。
根据不同的细胞类型和实验目的，制备不同种类和浓度的培养基。
第二步：分离细胞在细胞培养之前，需要将细胞从组织、器官或已有培养物中分离出来。
通常采用酶消化、机械剪切或离心等方法来分离细胞。
分离后，细胞可以在培养基中生长和繁殖。
第三步：细胞接种将分离出的细胞接种到含有培养基的培养皿或培养瓶中。
接种密度要适当，不宜过稀或过密。
同时，需要将培养基中的氧气和二氧化碳平衡，通常使用CO2培养箱来提供适宜的气体环境。
第四步：细胞培养经过接种后，细胞开始在培养基中生长和分裂。
在培养过程中，需要控制细胞的温度、湿度和pH值，保持适宜的生长条件。
此外，定期更换新鲜的培养基可以提供足够的营养物质，维持细胞的正常生长。
第五步：细胞检测和观察细胞培养的过程中，需要定期对细胞进行检测和观察。
包括细胞数量的计数、形态的观察和生长曲线的绘制等。
通过这些检测和观察，可以了解细胞的健康状态、增殖速率以及其他相关参数。
第六步：细胞应用或冻存根据研究或实验的需要，可以选择将细胞用于进一步的实验、传代培养或冻存保存。
冻存细胞需要使用适当的冻存液，将细胞缓慢冷冻并存放在液氮罐中，以便长期保存。
细胞培养是一项需要耐心和细心的工作，每一步都需要严格控制条件和遵循操作规范。
只有如此，才能获得可靠的实验结果和高质量的细胞培养。
希望本文能为您提供参考，更好地开展细胞培养工作。
细胞培养操作步骤
细胞培养操作步骤培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml冻存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清2ml。
依次比例酌量配置。
超净工作台常规配置移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个，常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精……实验前准备：所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。
首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37℃的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37℃水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。
若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。
这一过程可在超净工作台外操作。
实验步骤一、原代细胞的培养1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。
2.将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。
特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。
3.取1个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。
4.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。
细胞培养的方法
细胞培养的方法细胞培养技术是现代生物医学研究不可或缺的重要手段之一。
通过体外培养，可以使生物细胞在一定条件下不断增殖和分化，为生物学研究提供了很多便利。
但是细胞培养方案的选择和操作方法的正确性直接影响到细胞的生长繁殖、存活率和细胞的完整性等方面，正确选择和掌握细胞培养的方法技巧对于研究的准确性和实验结果的可比性具有重要意义。
下面列出了10条关于细胞培养的方法，并展开详细描述。
1.选择合适的培养基培养基选择是影响细胞培养成败的重要因素之一。
不同类型的细胞需要不同类型的培养基，包括基础培养基、添加物、生长因子等，还需要注意是否含有过期物质。
要注意的是，不同细胞系对不同的药物和会造成细胞的损伤，因此在选择不同的培养基时需要谨慎。
2.正确的培养箱与培养环境细胞需要适合的培养环境来生长，如适当的氧气水平、恰当的温度等。
使用排除有害气体和杂质的培养环境和培养设备，如无菌操作台、高效过滤器、CO2培养箱，有助于维持细胞的健康和生长状态。
3.消毒操作细胞培养实验应进行无菌操作。
在无菌条件下进行培养可以防止细菌和真菌的污染，保障实验的重复性和可比性，因此对工具、培养器具、培养基等进行彻底的消毒和灭菌操作是不可缺少的。
4.细胞的接种密度与平衡生长细胞接种的密度应根据细胞类型进行调整。
密度过低会使细胞生长缓慢，过高则会导致过度分裂和明显的细胞死亡。
细胞密度的平衡生长可以通过掌握合适的培养时间和更换新的培养基来维护。
5.细胞的观察与鉴定观察和鉴定细胞是正确选择细胞培养方法的前提。
需要仔细观察并记录细胞的生长、形态、颜色、大小和产物的形成等特征，并比对标准细胞特征和应用目的，从而确定细胞的种类和质量。
6.细胞分离的方法细胞分离是获得细胞单元的必要方法，可以使用化学方法、机械方法或者酶解法等不同方法进行。
需要注意的是细胞分离的方法可能会影响细胞的功能和一些分子指标，因此进行细胞分离时应根据实验目的和细胞特点进行合理的选择和操作。
医学实验中细胞培养的基本操作教程
医学实验中细胞培养的基本操作教程细胞培养是医学实验中常用的技术手段，可以通过培养细胞体外研究细胞结构、功能、代谢以及疾病的发病机制。
本文将介绍医学实验中细胞培养的基本操作教程，包括无菌操作、细胞传代和细胞培养基的制备。
一、无菌操作1. 器具准备：将工作区域和培养器具用70%乙醇喷雾消毒，将所需器具放入无菌工作台，待干燥后再进行后续操作。
2. 细胞培养基准备：将所需的细胞培养基放入无菌环境中，根据实验需求添加适量的血清、抗生素等。
3. 细胞取样：取出培养物中所需的细胞，使用吸管或移液器将细胞转移到无菌的培养基中。
4. 细胞传播：将细胞和培养基混合均匀后，转移到培养皿或培养瓶中，注意避免皿壁的污染。
5. 无菌操作结束：将使用过的培养器具进行无菌处理，清理工作区域并进行必要的消毒。
二、细胞传代1. 始代细胞收获：当细胞在培养器中达到一定密度后，使用细胞解离液将细胞从底物上解离下来。
2. 离心：将解离的细胞转移到离心管中，以适当的转速离心沉淀细胞。
3. 上清液去除：倒掉离心管中上清液，注意尽量不要干扰到细胞沉淀。
4. 细胞悬浮液制备：使用无菌PBS洗涤离心沉淀的细胞，再添加适量的细胞培养基将其悬浮均匀。
5. 细胞传代操作：将悬浮细胞转移到新的培养器具中，注意避免气泡的产生，并将培养基置于CO2孵化箱中培养。
三、细胞培养基的制备1. 培养基组成：根据实验需求，制备含有特定成分的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。
2. 液体消毒：将容器进行高温高压灭菌，确保培养基的无菌。
3. 配方调整：按照实验需求向培养基中添加适量的血清、抗生素、谷氨酸等。
4. 混合均匀：使用无菌器具将添加好成分的培养基搅拌均匀，确保各成分充分溶解。
5. 培养基保存：将制备好的培养基用无菌器具装入培养瓶中，标明日期和成分，存放于4℃的冰箱中，避免阳光直射。
以上就是医学实验中细胞培养的基本操作教程，从无菌操作、细胞传代到培养基的制备，这些基本技术对于医学实验中的细胞研究至关重要。
养细胞实验内容
养细胞实验内容细胞培养是生物学研究中非常重要的实验手段之一，可以用于探究细胞的生理、生化和分子机制，研究细胞的生长和分裂，以及对细胞进行基因转染和药物筛选等。
以下是关于细胞培养实验的一些相关参考内容：1. 细胞培养基的配制细胞培养基是细胞培养的基础，一般由多种物质组成，包括无机盐、氨基酸、维生素、有机物、生长因子和血清等。
常见的培养基有DMEM、RPMI-1640、F12等，不同类型的细胞适用不同的培养基。
细胞培养基可以根据需求进行调整、添加抗生素和调节pH值等。
2. 细胞分离和传代当细胞培养达到一定密度时，需要进行细胞的分离和传代。
一般方法是使用胰酶或胰蛋白酶等消化酶将细胞从培养基表面或底部脱落。
然后将细胞悬浮于新的培养基中，经过离心沉淀后将上清液抽取，用新的培养基代替旧的培养基。
细胞传代的目的是为了维持细胞的分裂活力和生物学特性。
3. 培养皿的处理和细胞接种在细胞培养实验中，培养皿的处理非常重要。
最常用的培养皿是培养瓶和96孔板。
接种前需要将培养皿消毒，可以用70%酒精或紫外线照射等方法。
接种时需要将细胞悬浮液均匀均匀地滴在培养皿表面或孔底。
细胞密度的控制对细胞培养的成功至关重要。
4. 细胞培养条件的调节细胞培养对温度、湿度、CO2浓度和氧气浓度等环境条件有较高的要求。
细胞通常在37℃、5% CO2浓度和95%湿度的培养箱中培养。
细胞培养箱需要定期检查和校正，以确保细胞的最佳生长条件。
培养皿的密封性和通气性也是需要考虑的因素，可以使用无菌的高含氧的帽子。
5. 细胞的药物处理和基因转染细胞培养实验可以用于药物的毒性和疗效检测、基因功能研究以及基因转染等。
药物的处理一般是将药物溶液加入到培养基中，接种细胞后培养一段时间，然后进行细胞活力、分化状态等的检测。
基因转染常见的方法包括质粒转染、RNA干扰等，可通过改变细胞的基因表达和信号转导途径来研究细胞的功能和机制。
总结起来，细胞培养实验内容包括细胞培养基的配制、细胞分离和传代、培养皿的处理和细胞接种、细胞培养条件的调节以及细胞的药物处理和基因转染等。
细胞培养的操作步骤
细胞培养的操作步骤细胞培养是一种常见的实验室技术，用于研究和生产生物学领域的细胞。
细胞培养的操作步骤通常包括以下几个环节：准备培养基和试剂、细胞传代和细胞分离、细胞接种和培养条件的控制。
一、准备培养基和试剂1.确定所使用的培养基类型，如DMEM、RPMI-1640等，并根据实验的需求将其配制好。
2.购买所需的培养基添加剂，如胎牛血清（FBS）、生长因子、抗生素等，并根据实验要求将其加入到培养基中。
3.清洁工作台，并将所需的器具和试剂取出，进行消毒处理。
二、细胞传代和细胞分离4.将细胞传代物接种到一个新的培养器中。
根据实验的要求，可以使用细胞培养瓶或细胞培养皿等容器。
5.静置一段时间，让细胞附着在底部表面上，并增加培养基的吸附。
6.将旧的培养基小心地倒掉，并用含有酶的溶液，如胰酶-EDTA或胰蛋白酶，洗涤细胞。
此步骤旨在除去细胞表面的蛋白质和粘附物，使细胞能够自由分离。
7.加入一定量的培养基，将细胞解离，并通过轻轻摇动容器促进细胞的分散。
8.将分散的细胞转移到新的培养器中，并加入适量的培养基使其恢复生长。
三、细胞接种9.将细胞培养器中的细胞进行视觉检查，确保它们的形态和数量适合接种。
10.使用显微镜检查细胞的活力、纯度和质量。
如果细胞质量不佳，应根据需要调整细胞密度或传代更多次。
11.根据实验要求，将细胞重新分散并计算细胞密度。
12.准备接种物：使用无菌技术，将细胞和培养基混合，并在接种器中将混合物分散均匀。
13.将接种物小心地滴入新的培养器中，确保细胞均匀分布。
14.检查细胞的附着情况并加入适量的培养基。
四、培养条件的控制15.放置培养器在恒温培养箱中，保持适当的温度（通常在37摄氏度）、湿度和二氧化碳浓度（通常是5%）。
16.定期检查细胞的生长状况，观察细胞的形态和数量，以确定培养基是否需要更换或细胞是否需要传代。
17.如果需要传代，在细胞接种后一段时间内，观察细胞的生长速率和密度，根据需要调整传代时间和细胞密度。
细胞培养方法
细胞一细胞培养（一）原代培养○1胰蛋白酶消化法1.将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）2.吸去PBS液，将组织块移入15ml离心管中，加入组织块两倍体积预热至37℃的0.25%含EDTA的胰蛋白酶，在37℃水浴中作用20分钟，每隔五分钟摇晃一下3.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，将消化后的组织块用细胞筛过滤，取过滤液于离心管中，1000r/min离心5分钟4.离心后吸去上清液，加入5ml含10%胎牛血清和1%双抗的培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至约5×105个/ml，每个培养皿（6㎝培养皿）加入5ml含细胞的培养基，上下左右移动混匀5.放入37℃，5%CO2的培养箱中培养6.24h后，观察细胞贴壁情况，更换培养基，继续培养，2-3天更换一次培养基7.代细胞融合率达80%-90%时进行传代培养○2组织块法1. 将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）2.将组织块转移至培养皿中，每个组织块保持一定间距3.向培养皿中缓慢加入培养基至刚好没过组织块，小心放入37℃，5%CO2的培养箱中培养4.24h后，观察贴壁情况，并补加新培养基仪器：6㎝培养皿、弯头剪、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）（二）传代培养○1贴壁细胞1.先将含10%血清和1%双抗的培养基、0.25%EDTA-胰蛋白酶在37℃水浴锅中预热20min2.观察细胞融合率是否达到80%-90%3.将所需用品放入紫外照射30min的超净工作台中，物品放入前需用75%酒精擦拭或放入后立即用酒精擦拭4.吸去培养基，加入PBS冲洗两遍，洗去残留培养基，加入胰蛋白酶至刚好覆盖培养皿底 （6㎝培养皿约1ml），放入培养箱中消化0.5-2分钟5.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，轻轻吹打混匀，吸入离心管中，1000r/min离心5min6.离心后，小心吸去上清夜，加入5ml培养基轻轻吹打混匀，血细胞计数，调至5×105个/ml7.每个6㎝培养皿加入5ml含细胞的培养基，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养○2悬浮细胞1.将培养皿中的培养基吸至离心管中，1000r/min离心5分钟2.离心后吸去上清液，加入5ml培养基，轻轻吹打混匀，血细胞计数，调至5×105个/ml3.每个6㎝培养皿加入5ml含细胞的培养基，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养仪器：6㎝培养皿、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）（三）细胞冻存○1贴壁细胞冻存1.配置细胞冻存液2.吸去培养基，加入0.25%EDTA-胰蛋白酶刚好覆盖培养皿底，放入培养箱中消化0.5-2min3.消化后的细胞，转移至离心管中，1000r/min离心5min4．离心后，加入细胞冻存液与细胞混匀，细胞计数，调至5×106个/ml5.每个冻存管加入1.5ml，将冻存管放入程序性降温盒，-80℃过夜，转移至液氮中；若无程序性降温盒，则将冻存细胞依次放置4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，再转移至液氮中○2悬浮细胞冻存1.配置细胞冻存液2.将细胞转移至离心管中，1000r/min离心5min3．离心后，加入细胞冻存液与细胞混匀，细胞计数，调至5×106个/ml4.每个冻存管加入1.5ml，将冻存管放入程序性降温盒，-80℃过夜，转移至液氮中；若无程序性降温盒，则将冻存细胞依次放置4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，再转移至液氮中仪器：15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、倒置显微镜、程序性降温盒、液氮罐试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM（高糖）培养基、胎牛血清、二甲基亚砜（四）细胞复苏1.将冻存的细胞从液氮中小心取出，快速在37℃水浴锅中摇晃解冻，一般在1min内完成，若离水浴锅较远可将细胞放置在干冰上2.将冻存管内液体转移至离心管中，1000r/min离心5min3.去除上清液，加入培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至5×105个/ml4.每个6㎝培养皿加入5ml复苏后的细胞，放入37℃，5%CO2培养箱中培养仪器：6㎝培养皿、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）。
细胞培养标准流程
细胞间基本规定每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min）。
显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。
超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。
带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。
细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。
基培需写上开启时间。
细胞培养标准流程1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例）Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。
所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。
步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌2.弃旧：细胞生长融合达90%时，吸出培养基3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1-2次4.消化：加入1ml 0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO2 放置40s-1min,，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞脱壁。
5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10%FBS的完全培养基终止消化。
6.吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁，呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿。
再加入10ml全培。
（大盘10ml全培，小盘6ml全培）（细胞生长快留30%，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA）7.培养：每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。
PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。
2、细胞转染TurboFect 转染试剂转染（用于质粒的转染，说明书附后）细胞接板24 h 后转染。
转染时细胞密度需达到70-90%。
以6 孔板为例，转染前细胞先换液，加4ml全培。
取1.5 ml 离心管，加入400 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入质粒2 μg，混匀后静置5 min，再转染试剂4 μL，混匀（转染试剂是质粒的2倍），室温静置15－20 min。
细胞培养操作评分标准
细胞培养操作评分标准一、背景介绍细胞培养是一种重要的实验技术，用于研究和生产不同类型的细胞。
为了保证细胞培养的质量和一致性，评分标准是必不可少的工具。
本文档旨在介绍一种细胞培养操作的评分标准，以帮助评估和改善细胞培养过程。
二、评分标准1. 细胞外观（20分）- 细胞形态是否正常（10分）：细胞形态应该与其预期类型一致，如平坦的上皮细胞或球状的淋巴细胞。
- 细胞聚集情况（5分）：细胞应该均匀地分布在培养皿中，不应该出现大的聚集。
- 杂质情况（5分）：细胞培养过程中是否存在异物或杂质。
2. 培养条件（30分）- 温度（10分）：培养室温度应符合细胞类型的要求。
- CO2浓度（10分）：CO2浓度应根据细胞类型进行调整。
- 培养基配方（10分）：培养基的配方是否正确，包括培养基液体配方、添加剂和抗生素等。
3. 污染情况（20分）- 细菌污染（10分）：是否有细菌存在于培养皿中。
- 真菌污染（10分）：是否有真菌存在于培养皿中。
4. 细胞增殖情况（30分）- 细胞数量（10分）：细胞应该有适当的增殖率，根据细胞类型进行评估。
- 细胞周期（10分）：细胞的增殖应该符合其正常的细胞周期。
- 细胞存活率（10分）：细胞存活率应该符合预期的水平。
三、评分方法评分标准的每一项通过给出满分、部分满分或不满分来评估。
综合各项评分，可以得出最终的细胞培养操作得分。
评分标准需要在每次细胞培养过程中进行评估，并根据结果改进操作方法以提高得分。
四、总结细胞培养操作评分标准是一个有助于评估和改进细胞培养过程的工具。
通过对细胞外观、培养条件、污染情况和细胞增殖情况进行评估，可以提高细胞培养的质量和一致性，从而更好地满足研究和生产的需求。
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DNA的损伤与修复:DNA损伤可进行自我修复,修复是 一复杂的过程,存在着不同修复机制和产生不同的 结果,无误性修复使DNA复原,错误性修复可引起DNA 结构发生改变,当DNA损伤后并发生错误性修复,且 这种变化被固定下来,也即形成不可逆的结局时,标 志着DNA发生遗传性改变,从启动到损伤被固定下 来,大约在24-48h内完成。
发展或表现:细胞DNA受损和被固定后,通过细胞的反 复增殖,使损伤进一步得到发展和表现,这一阶段,有 的物质具有增强和促进细胞转化的作用,称促癌剂, 癌前细胞和正常细胞两类细胞大约都经过12-15个细 胞周期的增殖,正常细胞接触抑制,癌前细胞继续分 裂增殖,由于数量增多而堆积,最后能形成明显可见 的转化灶,转化有向三维空间生长趋势,易形成推积。 转化灶被分离培养后，能形成传代细胞系和用于进 行细胞生物学性状检测。
3.细胞转化基本过程：
诱发:也称启动,是致突变或诱发DNA损伤的过程,处 于DNA合成阶段的细胞易受致癌物损伤,因此让致癌 物接触细胞的时间不宜少于6h,但也不应超过24h。 直接致癌物如甲基硝基亚硝基胍(MNNG),能直接损 伤DNA诱发癌变。间接致癌物又称前致癌物,需经过 某些酶的活化,形成终末致癌物后,才能发生致癌作 用。终末致癌物具有强的亲电子性质,易与细胞核 中含电子多的DNA,RNA和蛋白质等相结合,从而导致 DNA的损伤,发生启动作用。
组织和细胞培养
郎朗
第十二章体外培养细胞的转化和DNA转导技术
一、基本概念和原理 1.细胞自发转化:在未用任何诱变剂处理的情况下, 细胞自发出现的转化现象。若长期反复传代，在 某些难以控制的因素如血清质量不佳、病毒污染、 温度和pH不稳等影响下，再加上所用的细胞对外 界环境敏感，即有可能发生。自发转化的表现为: 细胞核型异倍化、获得永生性、接触抑制消失等。 因此欲求保持所用细胞为稳定的二倍体，应尽量 早期冻存和减少传代。
2.人工诱发细胞恶性转化 在细胞培养条件下，用化学、物理和生物等 各种致癌因素，都可人为地诱发细胞发生转化。 转化时需要让细胞直接受到致癌物的作用;从细 胞受到打击后到发生恶性转化，一般需两周到三 个月的时间。体外人工诱发细胞转化系统，对研 究癌变原理和检测环境中可疑致癌因素等有很大 的实用价值。
4.基因细胞内导入技术 基因导入的概念、生物学意义和技术要点： 在分子细胞学技术中,当一个基因被克隆后,检测它 的性状和功能,最好的办法是把它再导入细胞中,观 察它在细胞中的表达。把基因导入细胞中的技术称 基因转导或称导入。把基因导入细胞内使外源基因 能整合入受体细胞基因组中;是研究基因表达、结 构和功能的技术方法,基因导入已成为基因研究的 重要手段。培养细胞是基因转导最适宜的对象。
磷酸钙转染法 把含有癌基因的DNA或已克隆化的癌基因作为转 染物，与磷酸钙转染液混合，加入到被转染的培 养细胞环境中;在磷酸钙转染液的媒介下，能使 转染的DNA或克隆基因被整合或掺入到受体细胞 的基因组中。这一过程称作基因转染。磷酸钙液 促基因转移的机制尚不明了。
转移技术需两个基本条件:①适宜受体细胞;②含 癌基因的DNA或已克隆的癌基因。所谓基因组 DNA或总DNA,即一个细胞核中的全部DNA;癌基因 包含在每个癌细胞的总DNA中。因此，在分离癌 基因之前，先要破坏癌细胞使其释放出总DNA。 进一步再把巨大的DNA分子裂解成较小的片段， 还要消除掉细胞中的各种蛋白质和RNA，才能获 得纯净的DNA片段。
病毒转化细胞
人外周血B淋巴细胞膜有EBV受体，当细胞受EBV 病毒感染并与受体结合后，能导致细胞发生转化， 产生永生性，变成能在体外长期传代生长的细胞系。 可用于细胞遗传、分子遗传和DNA等研究。过去转 化尚需加环孢霉素A抑制T淋巴细胞。近年改为不用 环孢霉素A的全血转化法，也能获好的转化效果。
转化程序： 血液准备:抗凝取血1-2ml,每管0.5m1;置冰箱30min; (2)EBV病毒转化:解冻液氮中取出的0.5ml全血; (3)将解冻细胞与10ml1640混合,离心,重悬细胞; (4)加0.3-0.5m1EBV病毒液;水浴摇动,免出现凝块; (5)分装50ml培养瓶中,补加适量培养液,培养; (6)一周后加补入2ml培养基; (7)经常镜检培养物,每3-4天加液或换液,随细胞数 量增多,可分装入大瓶中培养。
消化法:(1)先在瓶壁上用记笔圈出转化灶,弃掉瓶 内培养液,选生长状态良好的转化灶,用小不锈钢 环、玻璃环或无毒硅橡胶圈均可,沾少许无菌明胶 (不用亦可)套在转化灶上; (2)向圈中滴0.25%胰蛋白酶充分消化后,用弯头吸 管把胰蛋白酶与细胞一同吸出,接种入新培养瓶中, 再补加营养液少许; (3)置温箱中继续扩大培养,数日后转化细胞迅速 增殖成新的细胞群。
观察:
(1)第一天镜下观察,可见多量红细胞和红细胞碎片, 其中呈淡蓝绿色者即为淋巴细胞; (2)第5-7天可见上层仍有较多量红细胞,但此时已 可观察到转化成功的单个或成团的淋巴母细胞; (3)7-15天时细胞逐渐增多,成大小不等的团块; (4)15-21天细胞增殖迅速,成大团块,呈悬浮生长, 红细胞已解体或消失,转化完成。
应用微小细胞融合技术可将单个的、未受损伤的 染色体从一种细胞转导到另一种细胞。应用这一 技术得到的杂交细胞，是研究基因定位、哺乳动 物基因结构、表达、调控的理想模型。同时这一 方法和其它基因转导方法联合应用，如用带有选 择标记基因的质粒、病毒转移并整合到染色体基 因组中，对分离鉴定肿瘤抑制基因及某些疾病基 因是十分有用的技术手段。
致癌化学物转化细胞:以MNNG为代表，进行转化 叙利亚地鼠胚胎细胞实验。
(1)取材:同窝胚胎,无菌剪碎,胰酶消化,滤过,离心, 除消化液,制成细胞悬液,培养2-3天; (2)贮存:选状态良好细胞冻存备用; (3)致癌物处理:加MNNG剂量1-3µ g/ml,培养12-48h; (4)低血清培养:弃MNNG作用液,PBS洗,加含20%血清, 培养2-3周,然后改用含5%血清培养液培养; (5)转化灶形成和分离:处理10天后产生数量不等的 转化灶。转化灶由密集的重叠细胞组成;灶的大小 不等,小者由几十微小细胞融合介导基因转导(染色体导入) DNA转染介导的基因转导技术已普遍应用到基因表 达和调控的研究中，特别是癌基因的鉴定与分离。 但由于用常规方法制备的高分子量DNA片段一般在 50-80kb因此用DNA转染法所转导的DNA片段长度受 到限制。另外在DNA转染过程中有可能人为地造成 基因的损伤或异常改变，如基因重排、扩增等。因 此是否能转移完整的DNA是一个十分重要的间题。
3.转化细胞的检测
用诱变剂或致癌物诱发细胞转化,获得转化细胞群 后,需进一步做一系列实验分析,以确定转化细胞的 性状,一般应做如下检测:①细胞生物学一般性状: 包括细胞形态、生长速度、倍增时间等;②细胞遗 传学特征:包括核型分析、染色体组型、畸变和标 记染色体等;③恶性测试:浸润性试验、软琼脂培养 、异体动物接种、凝集试验等。以上测试中最主要 为第③项,能说明发生转化后细胞是否为恶性转化。
二、诱变因素诱发培养细胞转化的程序 1.细胞的选择:原代培养细胞、传代细胞系 2.诱发培养细胞的转化 转化因素:凡能改变DNA结构的因素都可能成为诱发 细胞转化因素,它们是:①化学因素:常用有MNNG等。 ②物理因素:射线,包括阴极射线、放射性核素等。 ③病毒:SV40,逆转录病毒等。④癌基因:大多癌基 因均有使细胞发生转化的能力,但癌基因的转化必 须借助载体和转导辅助因素,才易向细胞中转导,诱 导细胞发生转化。
转化灶的分离:转化灶出现后,为获得纯的转
化细胞群,应把转化灶分离出来培养。
刮除法:(l)在转化灶处瓶壁上用记号笔圈出记号; (2)用胶皮刮刮除未发生转化的正常细胞; (3)BSS冲洗掉被刮下细胞,加0.25%胰蛋白酶消化; (4)细胞松散后,弃掉消化液,加入新鲜含10%-20% 小牛血清培养液,以中止残余胰酶消化作用,用吸 管反复吹打转化灶,使之脱离瓶璧,成为细胞悬液; (5)再置入37℃温箱中扩大培养。