抗凝血酶受体单克隆抗体的制备与鉴定
单克隆抗体制备的基本过程
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单克隆抗体制备的基本过程
1.免疫原选择:选择适当的免疫原进行免疫,以诱导机体产生特异性抗体。
免疫原可以是蛋白质、多肽、病毒、细菌等。
2.动物免疫:将免疫原注射到动物体内,通常使用小鼠、兔子或大鼠作为免疫动物。
免疫的方法包括皮下注射、腹腔注射或静脉注射。
3.抗体筛选:收集动物的抗体样本,检测其对免疫原的特异性和亲和力。
常用的方法包括ELISA(酶联免疫吸附测定法)和免疫组化。
4.B细胞筛选:选择具有高亲合力的抗体阳性B细胞作为单克隆抗体的源头。
B细胞流式细胞分选或细胞培养均可用于筛选。
5.克隆化:从筛选出的B细胞中获得单个的抗体分泌细胞。
可以通过限稀稀释、单细胞分选、细胞融合等方法获得单克隆抗体细胞株。
6.表达和纯化:将单克隆抗体细胞按照需要进行培养和大量扩增,使其产生足够的抗体。
通过培养上清液或组织提取等方式获得抗体。
7. 鉴定和验证:对制备的单克隆抗体进行鉴定和验证,确定其特异性和亲和力。
常用的方法包括Western blotting、免疫组化和流式细胞术等。
8.应用和保存:单克隆抗体可以用于研究、诊断或治疗等领域。
制备的抗体可以保存在液氮中,以备后续使用。
需要注意的是,单克隆抗体制备是一项复杂的工作,需要专业的知识和技术。
制备过程中可能会遇到各种问题,如抗原选择、抗体筛选和细胞克隆等环节的问题。
因此,在进行单克隆抗体制备之前,应对各个环节进行充分的计划和准备,并请专业的科研人员或技术人员指导操作。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
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单克隆抗体制备步骤及注意事项单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb)是指由单一B细胞克隆分离得到的抗体,其具有高特异性和高亲和力。
制备单克隆抗体的方法主要有杂交瘤技术和重组DNA技术。
以下是单克隆抗体制备的步骤及注意事项。
步骤一:抗原免疫1.选择合适的抗原:根据需要检测的分子或细胞表面标志物,选择合适的抗原。
2.免疫动物:常用的动物有小鼠、兔子等。
选择适合的动物后,根据抗原的种类和免疫动物对该抗原的敏感性,设计免疫方案。
3.免疫计划:免疫计划包括免疫剂量、免疫途径和免疫次数等。
通常先进行原位免疫,然后再以单体或混合抗原进行体内免疫。
步骤二:细胞融合1.收集脾细胞:在最佳时期,解剖免疫动物,取出脾脏。
2.细胞培养:将收集的脾细胞在无菌条件下分散成单个细胞,并在培养基中培养,以供细胞融合使用。
3.准备骨髓瘤细胞:选择合适的骨髓瘤细胞,例如NS0或SP2/0等。
将其培养至对数生长期。
4.细胞融合:在抗原刺激下,将脾细胞与骨髓瘤细胞以一定比例混合,用聚乙烯醇或其他化合物促进细胞融合。
步骤三:细胞筛选与扩展1. HT增重培养:用含有hprt缺陷的培养基筛选融合细胞,以选择杂交瘤细胞。
2. Limited Dilution扩展:以一细胞一孔的方式将杂交瘤细胞进行有限稀释,使其实现单克隆化。
3.细胞培养:将单克隆细胞株移植到培养瓶中,进行培养和扩增。
步骤四:单克隆抗体鉴定1.酶联免疫吸附试验(ELISA):用ELISA方法筛选单克隆细胞株,检测其抗原特异性。
2.免疫组织化学检测:将单克隆抗体应用于细胞和组织切片,检测其在特定细胞或组织中的反应。
3.流式细胞术:通过流式细胞仪检测单克隆抗体与特定细胞表面标志物的结合情况。
步骤五:单克隆抗体生产与纯化1.细胞培养:将单克隆细胞株培养扩增至一定程度。
2.抗体收集:将培养上清液进行抗体收集。
3.纯化与浓缩:利用亲和层析、离子交换、凝胶过滤等技术,对抗体进行纯化和浓缩。
单克隆抗体的鉴定
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单克隆抗体的鉴定引言单克隆抗体是一类由单个免疫细胞分泌的抗体,具有高度特异性和亲和力。
它被广泛应用于医学诊断、药物研发和治疗等领域。
单克隆抗体的鉴定是确保其质量和效力的关键步骤之一。
本文将介绍单克隆抗体的鉴定方法和流程。
一、单克隆抗体的来源和制备单克隆抗体的制备通常分为两个阶段:免疫原注射和细胞融合。
免疫原注射是将特定抗原注射到动物体内,诱导免疫细胞产生特异性抗体。
细胞融合是将免疫细胞与肿瘤细胞融合,形成可无限增殖的杂交瘤细胞。
二、鉴定单克隆抗体的特异性特异性是评估单克隆抗体质量的重要指标。
常用的鉴定方法包括ELISA、免疫组织化学和免疫印迹等技术。
其中,ELISA是最常用的方法之一,可以通过将抗原固定在微孔板上,然后加入单克隆抗体进行检测,来评估其特异性和亲和力。
三、鉴定单克隆抗体的亲和力亲和力是指抗体与抗原结合的强度。
常用的亲和力鉴定方法包括ELISA、流式细胞术和生物传感等技术。
其中,ELISA是最常用的方法之一,可以通过变化抗原的浓度或稀释单克隆抗体的方式来评估其亲和力。
四、鉴定单克隆抗体的稳定性稳定性是评估单克隆抗体质量的重要指标之一。
常用的稳定性鉴定方法包括温度稳定性、冻融稳定性和长期保存稳定性等。
其中,温度稳定性可以通过将单克隆抗体暴露在不同温度下,然后检测其活性的变化来评估。
五、鉴定单克隆抗体的纯度纯度是评估单克隆抗体质量的重要指标之一。
常用的纯度鉴定方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱和质谱等技术。
其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的方法之一,可以通过检测单克隆抗体与其他蛋白质的分离情况来评估其纯度。
六、鉴定单克隆抗体的交叉反应性交叉反应性是指单克隆抗体与非目标抗原结合的能力。
常用的交叉反应性鉴定方法包括ELISA、免疫组织化学和免疫印迹等技术。
其中,ELISA是最常用的方法之一,可以通过将非目标抗原固定在微孔板上,然后加入单克隆抗体进行检测,来评估其交叉反应性。
七、鉴定单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用广泛,包括医学诊断、药物研发和治疗等领域。
2020年智慧树知道网课《实验血液学》课后章节测试满分答案
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第一章测试1【多选题】(10分)下列哪项属于实验血液学的研究内容()A.淋巴细胞B.骨髓C.造血干细胞D.血小板E.白细胞第二章测试1【单选题】(10分)影响血涂片质量的原因()A.血液较稀,应采用大血滴B.用未处理的新玻片C.推片时用力均匀D.使用EDTA抗凝静脉血2【单选题】(10分)血涂片瑞氏染色时,红细胞染红色,白细胞核着色不好,缓冲液pH可能为()A.6.4B.9.4C.5.4D.7.43【单选题】(10分)红细胞绝对性增多见于:()A.慢性心肺疾病B.剧烈呕吐C.严重腹泻D.大面积烧伤4【判断题】(10分)正常成人外周血涂片中不可能有核红细胞()A.错B.对5【判断题】(10分)网织红细胞描述是晚幼红细胞的前身,是尚未完全成熟的红细胞。
()A.对B.错6【单选题】(10分)退行性核左移可见于:()A.急性溶血B.伤寒C.急性失血D.急性化脓性感染7【单选题】(10分)在炎症的进行期突然出现核右移可提示:()A.骨髓造血功能旺盛B.预后不良C.机体反应性高D.白血病反应8【单选题】(10分)下列关于中性粒细胞毒性变化的形态特点,的是:()A.大小不均B.巨多分叶核C.空泡变性D.中毒颗粒9【单选题】(10分)中性粒细胞发生空泡变性的原因是:()A.染色条件不良B.内质网与核糖体融合C.细胞的退行性改变D.细胞质脂肪变性10【单选题】(10分)现在血小板计数的参考方式是:()A.免疫流式细胞术B.手工血涂片镜检法C.单通道电阻抗计数法D.血细胞计数板法第三章测试1【单选题】(10分)血细胞由原始向成熟阶段发育,下述不符合一般形态演变规律的是:()A.核仁:可见→看不见B.核浆比例:小→大C.染色质:淡紫红色→深紫红色D.浆量:少→多2【单选题】(10分)箭头所指为何种细胞:()A.单核细胞B.中性杆状核粒细胞C.中性晚幼粒细胞D.幼稚单核细胞3【单选题】(10分)箭头所指为何种细胞:()A.中性中幼粒细胞B.嗜酸性中幼粒细胞C.中性晚幼粒细胞D.早幼粒细胞4【单选题】(10分)箭头所指为何种细胞:()A.中幼红细胞B.淋巴细胞C.浆细胞D.晚幼红细胞5【单选题】(10分)染色体核型中缩写符号“t”表示:()A.插入B.倒位C.缺失D.易位6【单选题】(10分)判断是否是合格骨髓标本的标准,不正确的是:()A.染色良好B.中性分叶核粒细胞数大于中性杆状核粒细胞数C.骨髓小粒易见D.涂片薄厚适宜7【单选题】(10分)正常情况下,既可出现在骨髓中,也可出现于外周血中的粒细胞是:()A.杆状核粒细胞B.早幼粒细胞C.中幼粒细胞D.原始粒细胞8【单选题】(10分)关于染色体G显带技术的是:()A.秋水仙素的作用是阻留中期分裂象B.培养基中需含植物血凝素C.血标本用枸橼酸钠抗凝D.用胰酶来消化9【判断题】(10分)有出血倾向或凝血时间明显延长者禁忌做骨髓穿刺。
单克隆抗体的制备流程
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单克隆抗体的制备流程
一、抗体cDNA克隆
2、结合分离:抗体和抗原之间采用免疫学方法,进行亲和结合分离,在病理学中,可以采用细胞亲和免疫电泳或者细胞色素紧缩技术来进行识
别性结合分离抗体。
3、mRNA提取:使用RNAsy Plus Kit根据操作说明提取亲和结合分
离后的抗体的mRNA,用于cDNA合成。
4、cDNA合成:使用双链cDNA合成试剂盒,根据说明书操作,将mRNA合成双链cDNA。
5、克隆:将双链cDNA进行克隆,经过构建的一系列步骤,最终将cDNA克隆到载体上,构建出抗体cDNA克隆库。
二、抗体cDNA克隆抗体制备
1、选择克隆体:选择抗体cDNA克隆库中的抗体表达克隆,采用PCR
技术进行选择,并检测克隆体具有良好的免疫特性,可以快速确定最佳克
隆体。
2、表达载体构建:将最佳克隆体插入到表达载体中,构建出属于克
隆体的表达载体,以此保证克隆体的正确表达。
3、表达系统筛选:利用多种表达系统,筛选出最佳的表达系统,以
此来达到最佳的表达效果。
4、表达调控:对于最佳的表达系统,根据cDNA克隆体的特性,进行
最佳的表达调控,以此达到最佳的抗体表达效果。
2023年检验类之临床医学检验技术(师)能力提升试卷A卷附答案
![2023年检验类之临床医学检验技术(师)能力提升试卷A卷附答案](https://img.taocdn.com/s3/m/397bf907ef06eff9aef8941ea76e58fafab045bc.png)
2023年检验类之临床医学检验技术(师)能力提升试卷A卷附答案单选题(共30题)1、下列哪项不属正常骨髓象特征()A.有核细胞增生活跃B.见到少量的网状细胞和肥大细胞等骨髓成分C.全片(1.5cm×3.0cm)有30个巨核细胞D.粒红比值为10:1E.幼红细胞占有核细胞的20%,以中、晚幼红细胞为主【答案】 D2、在放射免疫分析中常用到RIA标准曲线(standard curve),其作用是A.用来校正计数器(counter)B.用得到的计数率去推算试样中所含样品的浓度或含量C.做质控D.用来追踪试样的变化E.鉴定核素的放射化学纯度【答案】 B3、患者,男性,55岁,患严重的背部疼痛及不适,3个月内体重下降3kg,实验室检查血清总蛋白110g/L,清蛋白39g/L,血清蛋白电泳见γ球蛋白区带中间部分显著深染,其扫描峰高于清蛋白峰。
A.多发性骨髓瘤B.肾结石C.肝硬化D.肝癌E.背部劳损【答案】 A4、下列有关冠心病危险因素的说法不正确的是A.危险因素是指个体固有的生理、心理因素或生活环境的其他因素B.危险因素等同于病因。
主要由遗传因素引起C.冠心病危险因素可达百余种,最有价值的可及早预防和治疗的是高血脂、CRP 和凝血因子异常D.危险因素不是诊断指标,但危险因素升高增加了冠心病患病可能性E.同一疾病可能有多种危险因素,其影响程度不一【答案】 B5、枸橼酸盐利用试验属于A.糖分解产物试验B.蛋白质分解产物试验C.碳源利用试验D.呼吸酶类试验E.鉴定细菌用的抑菌试验【答案】 C6、诊断温抗体型溶血性贫血最重要的实验室检查是A.Ham试验B.Coombs试验C.Donath-Landsteiner试验D.免疫球蛋白测定E.血红蛋白电泳【答案】 B7、不能作为荧光显微镜光源的是A.氙灯B.高压汞灯C.卤素灯D.紫外灯E.氚灯【答案】 D8、蛔虫对人体危害最为严重的是A.成虫夺取营养,造成营养不良B.幼虫经心脏移行造成肺部损害C.由于成虫的扭结、钻孔而造成的多种并发症D.成虫在肠腔内移行,造成肠黏膜损伤、炎症E.成虫代谢产物造成宿主的中毒反应【答案】 C9、血小板不减少的疾病是()A.脾功能亢进B.慢性粒细胞性白血病C.DICD.急性白血病E.再生障碍性贫血【答案】 B10、血清标本的除菌可用A.煮沸法B.紫外线照射法C.滤过除菌法D.高压蒸汽灭菌法E.消毒剂法【答案】 C11、血清学鉴定常用的血清学试验是A.凝集试验B.沉淀试验C.荚膜肿胀试验D.毒素-抗毒素中和试验E.免疫荧光试验【答案】 A12、纯化抗原的鉴定不包括A.抗原的浓度B.抗原的纯度C.抗原的免疫活性D.抗原的分子量大小E.B+C【答案】 D13、下列哪项说法不符合抗凝血酶活性检测的有关理论A.在该试验中,加入过量的凝血酶,使其与受检者血浆中的抗凝血酶形成1:1复合物B.剩余的凝血酶作用于带有对硝基苯胺(PNA)显色基团的发色底物S-2238C.裂解出的PNA呈颜色变化D.剩余的凝血酶越多,裂解产生的PNA越多,显色越深E.显色越深,表明抗凝血酶活性越低【答案】 C14、葡萄球菌致急性胃肠炎的致病因素是A.杀白细胞素B.溶血毒素C.肠毒素D.血浆凝固酶E.红疹毒素【答案】 C15、缺铁性贫血A.血清铁正常,网织红细胞明显增多B.血清总铁结合力增高C.骨髓巨核细胞明显增多,以颗粒型居多D.骨髓增生程度减低,巨核细胞缺如E.血清叶酸、维生素B【答案】 B16、消毒剂,是用于杀灭或清除物体上病原微生物的化学药物,对消毒剂的要求是()A.必须杀死含有芽胞的细菌B.能够杀灭微生物繁殖体即可C.使微生物毒力失活D.使微生物酶系统失活E.抑制微生物生长【答案】 B17、下列哪种免疫缺陷性疾病仅与体液免疫异常相关A.X-连锁无丙种球蛋白血症B.Di- George综合征C.Wiskott- Aldrich综合征D.慢性黏膜皮肤念珠菌病E.遗传性血管神经性水肿【答案】 A18、抗原只有一个型别的病毒是A.流感病毒B.副流感病毒C.腺病毒D.腮腺炎病毒E.鼻病毒【答案】 D19、患者男,60岁。
综述单克隆抗体的主要步骤
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综述单克隆抗体的主要步骤单克隆抗体是一种可以特异性识别并结合抗原的免疫蛋白,可以被广泛应用于医学诊断、治疗和研究等领域。
单克隆抗体的制备是一个复杂的过程,包括以下主要步骤:免疫原制备、细胞融合、筛选和鉴定、生产和纯化。
首先,制备免疫原是制备单克隆抗体的第一步。
免疫原可以是多肽、蛋白质、细胞、细胞器或生物大分子等。
在这个步骤中,免疫原需要经过一系列处理,如纯化、浓缩、变性等,以提高其免疫原性。
接下来,将免疫原注射到小鼠或其他动物的体内,以激发其免疫系统产生抗体。
通常情况下,免疫过程需要重复多次,以增加抗体的产生。
一般来说,免疫过程分为初次免疫和再次免疫。
获得免疫动物后,从其体内获得免疫细胞作为原始免疫细胞。
接下来,将这些免疫细胞与癌细胞(如骨髓瘤细胞)融合,形成杂交瘤细胞。
融合细胞后,需要进行筛选和鉴定。
这个过程旨在鉴定并筛选出能够产生特异性抗体的杂交瘤细胞。
一种常用的方法是酶联免疫吸附试验(ELISA),通过与免疫原结合来筛选出高亲和力的单克隆抗体。
通过限稀稀释法、固相筛选法或细胞流式术等鉴定方法,确定哪些杂交瘤细胞产生了具有期望效果的单克隆抗体。
得到合适的单克隆抗体后,需要进行大规模的生产和纯化。
生产单克隆抗体通常使用无脊椎动物细胞(如昆虫细胞)或哺乳动物细胞进行工程表达。
合适的表达系统可以确保抗体的高效表达和抗体质量的稳定性。
在生产过程中,需要对培养条件、培养基、收集工时等进行优化,以确保单克隆抗体的高产量和高质量。
随后,通过多种纯化方法(如亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析)对抗体进行纯化,去除杂质和冗余物质。
在纯化完成后,单克隆抗体通常需要进行分析和鉴定,以确保其质量和活性。
常用的方法包括SDS-凝胶电泳、Western blot,以及免疫组化等。
总结来说,制备单克隆抗体的主要步骤包括免疫原制备、免疫过程、细胞融合、筛选和鉴定、生产和纯化。
每个步骤的确切条件和方法可能会因实验目的、免疫动物和免疫原的不同而有所不同。
抗凝血药的分类及研发进展
![抗凝血药的分类及研发进展](https://img.taocdn.com/s3/m/da8b7d42a36925c52cc58bd63186bceb19e8ed25.png)
抗凝血药的分类及研发进展抗凝药物是预防或治疗血栓性疾病的药物,如中风、心肌梗死、深静脉血栓形成、肺栓塞等。
然而,传统的抗凝药物存在较高的出血风险,需要经常监测和调整剂量。
开发疗效更好、安全性更高的新型抗凝剂是药物研发的重要方向。
在本文中,我们将一起学习不同类型抗凝剂的理论基础、已获批抗凝剂的适应症,以及目前处于临床试验阶段的抗凝剂。
内容提纲如下:引言:凝血和纤溶的机制第一部分: 间接凝血酶抑制剂肝素钠维生素K拮抗剂第二部分: 直接凝血酶抑制剂比伐卢定(bivalirudin)达比加群(Dabigatran)第三部分: Xa因子抑制剂伊诺肝素利伐沙班(Rivaroxaban)阿哌沙班(Apixaban)依度沙班(Edoxaban)磺达肝癸钠(Fondaparinux)第四部分: 临床试验中的新型抗凝剂:XI因子抑制剂小分子化合物:Milvexian(Bristol-Myers Squibb和Johnson & Johnson联合开发)等。
单克隆抗体:阿贝西单抗(Abelacimab)等引言凝血和纤溶的机制是一个复杂的动态过程,涉及多种因素和途径。
凝血的主要目的,是在血管损伤部位形成稳定的凝块以止血。
纤溶的主要目的,是在损伤愈合时溶解凝块,恢复血流。
凝血和纤溶之间的平衡对于维持止血和预防血栓形成至关重要。
凝血过程可分为两种途径: 外在途径和内在途径。
外源性途径是由组织因子(tissue factor, TF)启动的,当内皮细胞受损时,组织因子暴露。
TF结合因子VIIa,激活因子X到Xa。
内源性凝血途径是机体在血管内部发生损伤时,通过激活凝血因子来形成血栓以止血的过程。
内源性凝血途径的启动是由于血管内皮细胞受损,释放出凝血因子XII,它与凝血因子XI和凝血因子IX形成复合物,进一步激活凝血因子X到Xa。
因子Xa将外源性途径与内源性途径连接起来。
凝血因子X与凝血因子V、磷脂质和钙离子共同作用,将凝血因子II(凝血酶原)转化为凝血酶。
抗Periostin单克隆抗体的制备及鉴定
![抗Periostin单克隆抗体的制备及鉴定](https://img.taocdn.com/s3/m/936ee9365e0e7cd184254b35eefdc8d376ee14f1.png)
曹启江等抗Periostin 单克隆抗体的制备及鉴定第1期抗Periostin 单克隆抗体的制备及鉴定①曹启江李雪娇②张朔②刘畅②张鹏②赵洪礼(沈阳大学生命科学与工程学院,辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室,沈阳110044)中图分类号R392.12文献标志码A文章编号1000-484X (2022)01-0067-04[摘要]目的:制备抗Periostin 单克隆抗体并鉴定其免疫学性能,为后期临床应用奠定基础。
方法:表达并纯化Periostin 的GST 融合蛋白,经过免疫小鼠、细胞融合及亚克隆筛选,制备效价良好的高亲和力单克隆抗体,并用免疫组化实验鉴定其免疫学性能。
结果:获得6株杂交瘤细胞株,均能稳定分泌高亲和力抗体,经酶联免疫吸附测定、Western blot 和免疫组化实验证实均能特异性识别人的Periostin ,显微镜下观察发现Periostin 在结直肠癌、乳腺癌等肿瘤患者的组织切片中表达水平显著高于健康人。
结论:成功制备了高亲和力、特异性强的抗人Periostin 单克隆抗体,为小分子抗体以及抗体人源化制备奠定了基础,进而为治疗人体内组织器官纤维化提供理论依据。
[关键词]Periostin ;细胞融合;杂交瘤细胞;单克隆抗体Generation and characteristics identification of monoclonal antibody to PeriostinCAO Qijiang ,LI Xuejiao ,ZHANG Shuo ,LIU Chang ,ZHANG Peng ,ZHAO Hongli.Liaoning Key Laboratory of Urban Integrated Pest Management and Ecological Security ,College of Life Science and Bioengineering ,Shenyang University ,Shenyang 110044,China[Abstract ]Objective :To generate and characterize Periostin -specific monoclonal antibodies ,and to lay the foundation for laterclinical applications.Methods :GST fusion protein of Periostin was expressed and purified ,monoclonal antibody against Periostin was generated by mouse immunization ,cell fusion ,subcloning ,screening.Prepare high -affinity monoclonal antibodies ,which were used forimmunohistochemical experiments to identify immunological properties.Results :Six hybridoma cell lines capable of stably secretinganti -Periostin antibodies were obtained.These monoclonal antibodies specifically recognized human Periostin protein by ELISA ,Western blot and ing microscope found Periostin were increased obviously in the colorectal cancer ,breast cancer than normal tissue.Conclusion :The anti -human Periostin monoclonal antibodies with high affinity and specificity were success‐fully generated ,thereby providing the foundation for the preparation of small molecule antibodies or humanized antibodies ,and then lay a theoretical basis for the treatment of human tissue and organ fibrosis disease.[Key words ]Periostin ;Cell fusion ;Hybridoma cells ;Monoclonal antibody组织器官的纤维化是影响组织器官功能的主要因素,是世界性的医学难题。
临床医学检验技术(士)考试练习题
![临床医学检验技术(士)考试练习题](https://img.taocdn.com/s3/m/82d12b7da417866fb94a8e01.png)
临床医学检验技术(士)考试练习题A1/A2题型(单选题),每一道考试题下面有A,B,C,D,E五个备选答案,请从中选择一个最佳答案。
1.脑脊液标本采集的禁忌证为A.不明原因的抽搐或瘫痪B.疑有颅内压升高C.手术前麻醉、造影D.中枢神经系统疾病需椎骨内给药E.中枢神经系统肿瘤正确答案:B2.下列哪一项符合新生儿同种免疫性溶血病A.Rh血型不合的新生儿溶血病B.Rh阴性的孕母从未接受输血,胎儿为Rh阳性,则第一胎即可发生严重溶血C.ABO溶血病较易发生核黄疸D.ABO溶血病可发生于父为A.血型,母为O血型的新生儿E.Rh型新生儿溶血病较ABO型症状轻正确答案:D3.下列关于血红蛋白的叙述,错误的是A.是成熟红细胞的主要蛋白质B.有两对珠蛋白肽链和4个亚铁血红素分子构成C.正常成人血红蛋白有HbA、HbA2和HbF三种D.血红蛋白全部在有核红细胞期合成E.约35%合成于网织红细胞阶段正确答案:D4.迟发型超敏反应中最重要细胞是A.B细胞B.MφC.Th1D.Th2E.嗜碱性粒细胞正确答案:C5.关于霍乱肠毒素的叙述,错误的是A.α亚单位是毒性亚单位B.β亚单位是结合亚单位C.由一个A亚单位和五个B亚单位组成D.其受体是糖蛋白E.是霍乱弧菌的主要致病物质正确答案:D6.下列疾病除哪种外,常可引起白细胞减少A.巨幼细胞性贫血B.骨髓增生异常综合征C.多发性骨髓瘤D.慢性粒细胞白血病E.急性早幼粒细胞白血病正确答案:D7.不是促进内皮细胞合成或释放PAF的物质是A.胶原B.凝血酶C.TNFD.IL-1E.PGI2正确答案:E8.下列心肌标志物中半寿期最短的是A.MbB.CK-MBC.cTnD.CRPE.LD正确答案:A9.ROC曲线的定义是A.根据一系列分界值,以真阴性率为纵坐标,假阴性率为横坐标绘制的曲线B.根据一系列分界值,以灵敏度为纵坐标,特异度为横坐标绘制的曲线C.根据一系列分界值,以真阳性率为纵坐标,假阳性率为横坐标绘制的曲线D.根据一系列分界值,以真阳性率为纵坐标,真阴性率为横坐标绘制的曲线E.根据一系列分界值,以真阴性率为纵坐标,假阳性率为横坐标绘制的曲线正确答案:C10.下列哪种疾病毛细血管脆性试验阴性A.过敏性紫癜B.血友病C.血小板减少性紫癜D.遗传性出血性毛细血管扩张症E.血小板无力症正确答案:B11.正常成人脑脊液中白细胞计数参考值为A.(5~20)×106/LB.(0~10)×106/LC.(0~30)×106/LD.(0~15)×106/LE.(0~10)×106/L正确答案:E12.对于脑脊液pH值,正确的说法是A.脑脊液pH值恒定B.血液屏障对于CO2和[HCO3-]的通透性是相同的C.正常脑脊液中pH值低于动脉血D.中枢神经系统炎症时,脑脊液pH值高于正常E.全身酸碱平衡紊乱对脑脊液pH作用非常明显正确答案:C13.试带法尿蛋白膜块中既是酸碱指示剂又是蛋白显色剂的物质是A.溴麝香草酚蓝B.四氯酚四溴磺酞C.四溴酚蓝D.还原酚酞E.甲基橙正确答案:C14.以下哪些离子对淀粉酶有激活作用A.Na+B.Cl-C.Cu2+D.Ca2+E.K+正确答案:B15.骨髓涂片中对诊断霍奇金病最有价值的特点是A.嗜酸性粒细胞增多B.淋巴细胞增多C.非造血细胞增多D.可见R-S细胞E.纤维细胞增多正确答案:D16.肾小管病变时,尿沉渣中数量增多的细胞是A.鳞状上皮细胞B.大圆上皮细胞C.尾形上皮细胞D.小圆上皮细胞E.肾小管上皮细胞正确答案:E17.正常血细胞的超微结构中表面没有微绒毛的是A.中性分叶核粒细胞B.嗜酸性中幼粒细胞C.嗜酸性分叶核粒细胞D.嗜碱性分叶核粒细胞E.中性中幼粒细胞正确答案:E18.关于血钙的叙述正确的是A.非扩散钙包括柠檬酸钙B.可扩散钙即为游离钙C.非扩散钙即为结合钙D.结合钙均不能透过毛细血管壁E.血浆总钙中约40%为非扩散钙,60%为可扩散钙正确答案:E19.载脂蛋白AⅠ可激活A.脂蛋白脂肪酶B.LGATC.肝脂肪酶D.脂肪组织脂酶E.胰脂酶正确答案:B20.粪便常规检查标本,错误的收集方法是A.清洁防水纸盒、塑料盒为较理想容器B.首先挑取粘液脓血部分送检C.标本新鲜D.灌肠标本可送检E.粪便标本不应混有尿液正确答案:D21.早期非特异性免疫应答阶段发生于感染后A.0~4小时B.0~24小时C.24~96小时D.4~96小时E.4~48小时正确答案:D22.角化前细胞核染色质的特点为A.呈条索状B.细致均匀C.固缩D.粗糙E.溶解正确答案:B23.关于成分输血的叙述,错误的是A.减少输血反应B.提高疗效C.减少传染疾病的危险D.一血多用E.可代替全血输注正确答案:E24.正常人尿渗量多为A.280~320mmol/LB.320~400mmol/LC.400~600mmol/LD.600~1000mmol/LE.1000~2000mmol/L正确答案:D25.不与亚硝基铁氰化钠发生化学反应的物质是A.葡萄糖、丙酮B.葡萄糖、β-羟丁酸C.丙酮、β-羟丁酸D.丙酮、乙酰乙酸E.乙酰乙酸、葡萄糖正确答案:B26.产生TNF-β的细胞是A.T细胞B.B细胞C.NK细胞D.单核巨噬细胞E.血管内皮细胞正确答案:A27.属于Ⅰ型超敏反应的疾病是A.肾小球肾炎B.风湿病C.过敏性休克D.免疫性溶血性贫血E.接触性皮炎正确答案:C28.关于正常情况下的浆膜腔积液的叙述,错误的是A.浆膜腔积液起到润滑的作用B.胸腔积液一般较少C.腹腔液一般小于50mlD.心包积液为10~20mlE.关节腔积液为1~2ml正确答案:E29.造成细菌的革兰染色性不同的原因是以下哪种结构不同A.细胞核B.细胞壁C.细胞膜D.细胞质E.胞质内含物正确答案:B30.胆红素是从下列何种物质分解代谢产生A.球蛋白B.DNAC.血红蛋白D.氨基酸E.脂肪酸正确答案:C31.疑一病人脑组织坏死,下列CSF的实验室检查中对临床最有诊断意义的是A.ASTB.ALTC.ALPD.CK-MBE.LD正确答案:E32.β-TG主要由肾脏排泄,故可评价A.糖尿病预后B.尿毒症预后C.白血病预后D.急性肾炎预后E.SLE的预后正确答案:B33.通常尿液中开始出现葡萄糖的最低血糖浓度是A.6.88mmol/LB.7.88mmol/LC.8.88mmol/LD.9.88mmol/LE.10.88mmol/L正确答案:C34.关于白细胞计数生理性变化的叙述,错误的是A.出生后至青春期中性粒细胞数和淋巴细胞数有两次交叉B.早晨较高,下午较低C.安静时较低,进食后比进食前高D.剧烈运动后显著增多E.妊娠期常轻度增加正确答案:B35.冷球蛋白血症是指血中含有A.淀粉样变性蛋白B.在4℃时自发沉淀,而在37℃时又可溶解的特殊蛋白C.冷凝集蛋白D.嗜异性凝集蛋白E.本周蛋白正确答案:B36.生理情况下,对尿液颜色影响最大的物质是A.尿胆原B.蛋白质C.卟啉D.尿胆素E.尿色素正确答案:E37.补体系统的激活必须有下列哪种成分参与A.C1ⅡB.B因子C.C3D.C4E.C567正确答案:C38.细胞因子免疫学方法测定的是A.细胞因子的活性B.细胞因子的蛋白含量C.细胞因子的基因及基因表达D.细胞因子的功能E.细胞因子的结构正确答案:B39.纯化抗原常用的葡聚糖法(SEpharosE)适用于A.凝胶过滤B.离子交换层析C.亲和层析D.密度梯度离心E.沉淀正确答案:C40.人的IgM分子主要特征是A.个体发育中最晚合成的免疫球蛋白B.能通过胎盘C.成人接受抗原刺激后最先LfJ现的抗体D.比IgG移向阳极快E.分子量小正确答案:C41.原发性血小板减少性紫癜(ITP)血小板减少的原因是A.生成减少B.消耗过多C.破坏增加D.分布异常E.成熟障碍正确答案:C42.用紫外法测尿酸时在尿酸酶的催化下,下列哪一种情况不会发生A.尿酸被分解B.生成尿囊素C.磷钨酸被还原D.292nm波长处吸光值下降E.可用血清直接测定正确答案:C43.血小板MPV增大见于下列哪种疾病A.wisskott-Aldrich综合征B.巨幼红细胞性贫血和脾功能亢进C.May-Heggiin,Alpport综合征D.放射病及化疗后E.血小板减少伴桡骨缺损正确答案:C44.测定血糖的标本最常采用的抗凝剂和防腐剂组合是A.碘乙酸钠-EDTANa2B.叠氮钠-肝素锂C.氟化钠-草酸钾D.氟化钠-肝素钠E.冰醋酸-肝素正确答案:C45.有关化脓性脑膜炎脑脊液特点正确的是A.外观透明B.细胞计数以淋巴细胞为主C.葡萄糖含量减少D.蛋白质明显减少E.可找到抗酸杆菌正确答案:C46.下列哪一项是错误的A.血管壁参与内源凝血途径B.血小板不参与凝血过程C.因子Ⅳ参与内源和外源凝血系统D.血管壁参与外源凝血途径E.共同凝血途径始于因子X的激活正确答案:B47.在用邻甲苯胺法测定葡萄糖时,掺人部分甘露醇而导致结果偏离,这种现象说明该实验方法A.试剂使用不当B.工作曲线不标准C.专一性差D.灵敏度高E.线性不够正确答案:C48.肾小管蛋白尿是指A.原尿中蛋白质不能被肾小管重吸收B.肾小球滤过膜的损伤C.肾脏被动性充血D.肾血管痉挛出血E.肾小球通透性增加正确答案:A49.在肝脏,胆固醇主要A.转变成类固醇B.转变成维生素C.合成胆红素D.合成低密度脂蛋白E.转变成胆汁酸正确答案:E50.用单克隆抗体测定细胞膜上的哪种成分,可将淋巴细胞分成不同的亚群A.HLAB.受体C.分化抗原D.糖基E.表面标志正确答案:C51.随机血糖的参考值范围为A.2.8~7.8mmol/LB.3.89~6.11mmol/LC.4.5~5.9mmol/LD.7.0~11.1mmol/LE.<11.1mmo1/L正确答案:B52.下列物质不属于非肌酐色原,但除外的是A.丙酮B.乙酰乙酸C.丙酮酸D.胆红素E.果糖正确答案:D53.寄生虫学免疫诊断皮内试验,24小时后局部出现阳性反应属于A.Ⅰ型变态反应B.Ⅱ型变态反应C.Ⅲ型变态反应D.Ⅳ型变态反应E.以上都不是正确答案:D54.肝中与胆红素结合的主要物质是A.硫酸根B.乙酰基C.葡萄糖醛酸D.甲基E.甘氨酰基正确答案:C55.钙、镁离子测定的参考方法是A.火焰光度法B.邻甲酚酞络合酮法C.过锰酸钾滴定法D.原子吸收分光光度法E.EDTA络合滴定法正确答案:D56.能催化CM和VLDL核心TG水解的是A.卵磷脂胆固醇酯酰转移酶B.脂蛋白脂肪酶C.胆同醇酯转移蛋白D.肝脂酶E.HMGCoA还原酶正确答案:B57.通常白细胞计数只反映了下列哪个池的白细胞数A.贮备池B.循环池C.成熟池D.边缘池E.分裂池正确答案:B58.下列哪项疾病属于自发性血小板增多A.炎症性疾病B.骨髓增生性疾病C.恶性肿瘤D.脾切除E.原发性(特发性)血小板减少性紫癜正确答案:B59.内源凝血途径的始动因子是下列哪一个A.ⅧB.ⅩC.ⅫD.ⅩⅢE.Ⅺ正确答案:C60.凝血第一阶段内源性途径涉及的凝血因子是A.因子ⅡB.因子Ⅰ,ⅫC.Ⅺ,PK,HMWKD.Ⅲ,Ⅶ,ⅤE.Ⅹ,Ⅻ正确答案:C61.下列有关滤血液的性质叙述正确的是A.比密<1.015B.易凝固C.RIV ALTA试验阳性D.积液蛋白/血清蛋白>O.5E.炎性积液正确答案:A62.以下哪种类型不属于沉淀反应A.双向免疫扩散B.单向免疫扩散C.对流免疫电泳D.血清蛋白电泳E.火箭电泳正确答案:D63.下列哪一种病的皮疹呈向心性分布A.流行性斑疹伤寒B.洛矶山斑点热C.Q热D.恙虫病E.地方性斑疹伤寒正确答案:B64.何种细胞表面具有小鼠红细胞受体A.中性粒细胞B.巨噬细胞C.T淋巴细胞D.B淋巴细胞E.K淋巴细胞正确答案:D65.下列有关渗出液的性质叙述正确的是A.非炎性积液B.多混浊C.细胞较少D.多不能自凝E.无细胞正确答案:B66.B细胞所不具备的表面受体是A.抗原受体B.FC受体C.补体受体D.小鼠红细胞受体E.羊红细胞受体正确答案:E67.用于诊断时,骨髓抽取量应小于A.0.1mlB.0.3mlC.1.OmlD.2.OmlE.2.5ml正确答案:B68.ELISA试验以HRP为标记酶时,常用的供氢底物为A.OPDB.0TC.TMBD.ABTSE.PNP正确答案:A69.抗原分子诱导宿主产生应答的能力称为A.宿主反应性B.免疫原性C.免疫反应性、D.抗原刺激性E.免疫原性和反应原性正确答案:B70.在正常凝m过程中,下列哪一项不能形成复合物A.因子Ⅸa,Ⅷa,磷脂,Ca2+B.因子Ⅲ,Ⅷa,Ca2+C.因子Ⅹa,Ⅻa,磷脂,Ca2+D.因子Ⅻa,Ⅺa,Ⅸa,Ca2+E.以上都不是正确答案:D71.来源于其他物种的抗原物质称为A.完全抗原B.异种抗原C.同种异型抗原D.自身抗原E.半抗原正确答案:B72.肝素的抗凝作用主要是A.阻止凝血酶形成B.钙离子沉淀C.有助于血小板聚集D.纤维蛋白原降解E.溶解纤维蛋白正确答案:A73.流感病毒易发生抗原变异的主要原因是下列哪一点A.流感病毒核蛋白变异性很强B.流感病毒血凝素变异性很强C.流感病毒基质蛋白变异性很强D.流感病毒聚合酶变异性很强E.流感病毒非结构蛋白变异性很强正确答案:B74.外源凝血系统和内源凝血系统形成凝血活酶时,都需要下列哪一个凝血因子A.ⅦB.ⅧC.ⅩD.XⅢE.Ⅲ正确答案:C75.促进血小板发生聚集和释放反应的强弱与下列哪项有关A.血小板膜糖蛋白B.血小板膜磷脂C.血小板膜糖脂D.血小板膜特异受体E.以上都是正确答案:D76.关于急性淋巴细胞白血病(急淋)和急单,下列说法正确的是A.急淋核环多见,急单核环偶见B.急淋核内小体可见,急单核内小体未见C.急淋核泡少见,急单核泡多见D.急淋微丝束多见,急单微丝束少见E.急淋线粒体较多、较大,急单线粒体较少、较大正确答案:C77.具有内热原作用的细胞因子是A.淋巴毒素B.趋化因子C.IL~3D.IL~2E.IL~1正确答案:EX题型(多选题),每一道考试题下面有A,B,C,D,E五个备选答案,请从中选择一个或多个答案。
中药中活性物质单克隆抗体的制备及其免疫检测应用_郭旭
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收稿日期:2009-11-17 修回日期:2010-03-25基金项目:教育部科学技术研究重点项目(N o .08071);国家自然科学基金(N o .30572320)作者简介:郭旭(1983)),女,山西太原人,中国药科大学中药复方研究室硕士研究生,研究方向为中药活性成分的免疫检测.通讯作者:余伯阳(1959)),男,浙江杭州人,中国药科大学中药复方研究室教授,博士生导师;E -m a i :l boyangyu59@163.co m 2010年5月第3期南京晓庄学院学报J OURNA L O F NAN JI NG X IAO ZHUANG UN I V ERS I TY M ay .2010N o .3中药中活性物质单克隆抗体的制备及其免疫检测应用郭 旭,刘吉华,余伯阳(中国药科大学中药复方研究室,江苏南京211198)摘 要:中药活性成分检测是中药质量控制的关键环节,但中药中许多重要活性物质如甾体皂苷、多数三萜皂苷和大多数真菌中的多糖化合物光谱吸收只有弱的末端吸收甚至无特征紫外吸收,分析、检测比较困难.在单克隆抗体技术基础上的小分子化合物的免疫学检测可应用于这些活性成分化合物的快速检测以及研究其在体内的代谢和分布.该方法与传统检测方法相比,省时、便携、易操作,将在中药材标准研究上发挥更大的作用.关键词:中药活性成分;单克隆抗体;免疫检测中图分类号:R 392.11 文献标识码:A 文章编号:1009-7902(2010)03-0031-060 引言1975年英国剑桥皇家医学研究委员会分子生物学实验室的Kohler 和M ilste i n 成功地用细胞杂交方法把能够产生针对预定抗原的抗体分泌细胞分离出来,在体外长期传代并分泌特异抗体,这些细胞经过克隆化,可以形成单克隆细胞,能产生针对某一特定抗原决定簇的完全相同的纯净抗体[1],即单克隆抗体(m ono -clonal anti b ody),简称单抗,而常规抗血清是来自体内许多不同的抗体产生细胞克隆,是多克隆抗体.与多克隆抗体相比,单抗纯度高,专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应.单抗技术的问世,不仅带来了免疫学领域里的一次革命,而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用,促进了众多学科的发展,Koh ler 和M ilste i n 也因这一杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖.中药中活性成分众多,但大多数有效成分如植物激素、皂苷类化合物、植物单糖及植物多糖类化合物等.它们是中药中重要的活性成分,具有广泛的药理活性,但多数无特征紫外吸收,因而分析检测比较困难[2].目前对中药中活性成分化合物常用的检测方法主要有薄层色谱法(TLC)、比色法、高效液相色谱-蒸发光检测法(H PLC -ELSD)和高效液相色谱-质谱法(LC -M S)检测法等.但比色检测法易受糖类等物质的干扰,误差较大,只能测定可被显色剂显色的总皂苷类成分,无法用于中药复方及生物样品中该类化合物的测定;H PLC -ELSD 法检测灵敏度较低,预处理程序复杂;LC -M S 检测法对仪器设备要求高,且由于皂苷类化合物结构特殊,质谱响应值较低.这些传统的检测方法普遍需要经过提取、精制等预处理,检测时间长、时效性差、耗资大、技术性要求高且需要昂贵的仪器设备[3].因而建立快速、灵敏、特异性强的生物学检测方法,对中药及复方中微量有效成分的检测,探索中药中小分子活性成分的作用机理具有重要的意义.单克隆抗体由于本身所具备的优势,如特异强、灵敏度高,并可大量制备,且不含其他交叉反应性的污染抗体,质量易于控制、易于标准化等.可以利用单克隆抗体进行酶联免疫吸附试验、凝集实验、胶体金实验、放射免疫分析、流式细胞术、电化学发光检测和荧光免疫实验等,从而对中药成分进行定性或定量分析.1中药活性成分完全抗原的制备一个完全抗原必须同时具备T细胞和B细胞表位.中草药中的有效成分有一部分本身就是完全抗原,可直接制备单抗;但大多数有效成分是小分子物质,由于分子太小一般难以同时拥有2个表位,必须将其连接到一些大分子蛋白载体以形成偶联物,借助大分子T细胞表位间接诱导B细胞激活、分化增殖,产生针对半抗原的特异性抗体[4].常见的载体有牛血清白蛋白(Bovine seru m album i n,BSA)、卵清蛋白(Ovalbum i n e, OVA)、钥孔血蓝蛋白(Keyho le li m pet he m ocyan i n,KL H)、人血清白蛋白(H u m an serum a l b um i n,H SA)、兔血清白蛋白(Rabbit serum album i n,RSA)、多聚赖氨酸(PLL)等.不同的载体对产生的应答特异性、融合的效率、特异性克隆的数目以及最终得到的抗体的效价都有显著区别[5],对于亲水性半抗原,载体蛋白的选择有很大的余地,通常选择疏水性载体的效果更好[6].但小分子半抗原往往不直接与载体蛋白连接,而通过一个/桥0(偶联剂)与载体蛋白交联.桥结构可以防止大分子载体蛋白对半抗原的屏蔽作用,即防止小分子与载体蛋白结合时被包埋在卷曲凹陷的蛋白质结构中,从而更易被淋巴细胞识别.4)6个碳原子的间隔对于抗原抗体的完全反应已经足够,实验表明半琥珀酸盐(4个碳原子的桥)能产生最大的免疫反应[7].1.1半抗原偶联方法理想的偶联方法应该能:与半抗原以特定的化学结构100%偶联,产物组成均一;产生重复的偶联,重复性好;偶联的操作简单,不影响天然产物的生物学活性;经济易得.但到目前为止,还没有一种偶联方法能完全满足这些条件,且不同方法的偶联效率有很大不同.大多数偶联还可能形成/新抗原决定簇0(neodeter m-i nants),这种新形成的抗原决定簇会引发特异性的体液免疫.因而偶联的方式、载体、偶联剂都应以尽可能降低新抗原决定簇的免疫应答和提高针对半抗原的特异性抗体为原则[8].目前常见的半抗原偶联方法主要有以下几种:1.1.1碳二亚胺法主要用于含有羧基的化合物与蛋白上的氨基形成酰胺键.血管紧张素和缓激肽、促胃液素、吗啡、前列腺素等均可在水溶性碳二亚胺的作用下,与蛋白或多聚氨基酸等载体结合制备人工抗原[8].李刚[9]等用该法合成了甘草中有效成分甘草酸的人工抗原;唐波[10]等用该法成功的制备了雷公藤内酯醇的人工抗原;徐国良[11]等用该方法成功制备了绿原酸完全抗原.1.1.2高碘酸钠氧化法对糖类的完全抗原制备主要通过高碘酸钠法.邻二羟基可被高碘酸钠氧化为醛基,然后与蛋白分子中的氨基形成sh iff氏碱,以硼氢化钠还原后即可得到稳定的以碳-氮单键连接的结合物.Jung[12]等利用这一方法合成了20(S)-人参三醇的完全抗原并用其免疫小鼠,制备出了抗20(S)-人参三醇的单克隆抗体;刘楠[2]等利用该方法合成了三七皂苷R1的完全抗原.1.1.3混合酸酐法半抗原及其衍生物分子中的羧基可以在三级胺存在下与氯甲酸异丁酯反应,生成活泼中间体混合酸酐,然后与蛋白载体上的伯氨基反应,形成酰胺交联键[13].罗利[14]等人利用混合酸酐法合成了川楝素的完全抗原,但该方法合成步骤复杂,副反应多,且反应中需要使用氯甲酸乙酯这一严格控制试剂.1.1.4活泼酯法该法是先将羧基转变成活性好的酯基,然后通过酯的胺解完成接肽.刘楠[2]等利用该方法制备出甾体皂苷元全抗原,该法缩短了反应历程,减少了反应过程副产物的产生,同时避免了使用剧毒物质造成的伤害.1.1.5戊二醛法同型双功能交联剂戊二醛的连接反应是一种温和的交联反应,可在4)40e温度范围,p H6.0)8.0和缓冲水溶液中进行,但是缓冲组分中不得含有氨基化合物.它的2个醛基可以分别与半抗原和蛋白上的伯胺基形成Sch iff氏碱,将两分子以五碳桥连接起来[15].宋建武[16]利用该法制备了乙酰胆碱酯酶抑制活性成分石杉碱甲的的完全抗原,并证明该抗原有较好的免疫原性.此交联方法易形成相同蛋白间的连接,产物均一性较差,因此多用于酶标抗体的制备.1.1.6重氮化法含有芳香胺的半抗原也可通过与亚硝酸盐反应形成重氮盐,在与蛋白质的酪氨酸残基上的酚羟基反应,也能与组氨酸残基上的咪唑环或色氨酸残基的吲哚环反应.这种偶联可以通过重氮化后的颜色变化(红棕色)判断是否偶联成功.磺胺嘧啶即通过用亚硝酸钠重氮化后与蛋白质载体组成完全抗原[17].该方法副反应严重,可能会引起大量的蛋白质沉淀,需特别注意.1.1.7直接合成法侯世斌[18]等利用直接合成法合成羟基红花黄色素A(H SYA)的人工抗原,从化学结构上分析,H SYA上的羰基比其他基团活泼,在弱酸性(一般在醋酸的催化下)反应体系中,酸的作用是增强羰基的亲电性,使其有利于亲核试剂的进攻,它容易同氨基酸残基上的氨基加成缩合形成一个不稳定的中间体,此中间体一经形成,氢离子立即由氮移至氧上,形成醇胺,最后由醇胺中失去一分子水,形成碳-氧双键.另外,在弱酸性反应体系中,可以控制酚羟基参与反应,避免酚负离子(C6H5O-)作为亲核试剂参与反应,结果会使反应产物更加单一稳定,但确切的反应机制需进一步的实验验证.1.2完全抗原合成效果的评价半抗原与载体偶联后,应进一步对偶联好的完全抗原的合成效果进行客观的评价,这直接关系到合成的成功与否以及抗体制备的质量.其中,偶联比率是一个重要的影响因素,但也并不是越高越好,一般说来,载体与半抗原分子的最佳偶联率为1B5-20[19].目前测定完全抗原偶联比率较常用的方法有紫外分光光度法、红外光谱法、基质辅助激光解吸飞行时间质谱法.马丽玲[20]等利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱法鉴定了紫杉醇完全抗原并测定其结合的半抗原数目.对于无紫外吸收的甾体皂苷类化合物,刘楠等采用三硝基苯磺酸法[21](TNBS)测定偶联后蛋白质上游离氨基数目,来确定载体蛋白上所偶联的半抗原数目,从而解决了无法利用通常的紫外光谱法测定甾体皂苷类化合物完全抗原偶联率的问题.2中药中活性成分化合物单克隆抗体的制备目前制备中药活性成分单抗主要方法是鼠源单克隆抗体技术,即杂交瘤技术,主要步骤包括:动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等.其中,免疫是单抗制备过程中的重要环节之一,其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖,以利于细胞融合形成杂交细胞,并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会.免疫方法有体内免疫法和体外免疫法.体内免疫法适用于免疫原性强、来源充分的抗原,体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射,也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼.最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射,目前尤其推崇后者,因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分.也有学者Sp itz采用脾内注射免疫法[22],该方法免疫周期短,免疫三天后即可进行融合.对于免疫原性很弱或对机体有害(如引起免疫抑制)的抗原,体内免疫法就不适用了.因此,针对这些情况,可采用体外免疫法.所谓体外免疫法就是将脾细胞(或淋巴结细胞,或外周血淋巴细胞)取出体外,在一定条件下与抗原共同培养,然后再与骨髓瘤细胞进行融合.3中药中活性成分化合物单克隆抗体的免疫检测应用3.1可用于大规模生产的中药质量控制在得到抗有效成分的单克隆抗体的基础上,建立免疫分析方法,如酶联免疫吸附法,可以对药品生产过程中的每一步进行监测,以保证产品中有效成分的质和量均达到要求.Xu[23]等利用杂交瘤技术制备了以甘草中主要活性成分甘草酸为半抗原的单克隆抗体,建立了以抗甘草酸单克隆抗体为基础的ELISA分析方法,并对十种中成药的甘草酸含量进行了测定并与H PLC法测定结果进行了对照.结果表明,两者测定结果相似,大多在?5%范围之内,证明了该技术对中成药主要活性成分的分析测定是可行的.灵芝多糖GLPL1是从黄山赤芝子实体中分离纯化获得的一种低分子多糖,其对人鼻咽癌及人肝癌细胞增殖有明显抑制作用,但其化学结构复杂,无特征紫外吸收.徐韶瑜[24]等制备了灵芝多糖GLPL1的单克隆抗体,从而为这类真菌类多糖建立了微量定量,特征性强的检测方法.Zhu[25]等制备了抗柴胡皂苷a的单克隆抗体,创建了线性范围在26ng/m l~1.5L g/m l的ELISA检测方法.同时,Zhu等将ELIS A方法与H PLC进行了对比,发现在单克隆抗体基础上的ELISA法的灵敏度是H PLC法的50倍.因此,这种免疫检测方法可直接测定略经纯化的微量样品,与传统方法相比具有灵敏、精确、迅速和简便等优点.3.2单克隆抗体可用于中药活性成分的体内分析在实验药物动力学和临床药物学中,可利用中药中活性成分的单克隆抗体测定生物利用度和药物代谢动力学参数等生物药剂学中的重要数据,以便了解药物在体内的吸收、分布代谢和排泄情况.N ah[26]等制备了一种特定类型的人参皂苷R f的单克隆抗体,相较于以往利用多克隆抗体检测R f的酶免疫吸附法,该方法不受血浆基质和其他人参成分的干扰,可测定血浆中R f的含量,检测限达34pg,从而了解Rf在体内的代谢情况.乌头碱是中药附子中的主要成分,同时具有很强的毒性,但经肠内代谢后可转变为无毒的乌头次碱. K i d o[27]等利用新乌头碱、次乌头碱和乌头根碱的单克隆抗体,建立了乌头碱的体内代谢物的ELI SA检测方法,创建了线性范围在100ng/m l~1.5L g/m l的ELI SA检测方法.白花丹醌是蓝雪科植物白花丹的主要成分,有广泛的药理活性但也有毒,Saka m o to[28]等制备了抗白花丹醌的单克隆抗体,建立了线性范围在200ng/ m l~2.5L g/m l的ELI SA检测方法,该方法不仅可以同时对大量样品进行检测,更可以监测其在体液中的含量,从而更好的确定这类药物的最佳使用剂量,避免可能出现的毒副作用.大麻是目前最常见的滥用药物之一,大麻进入体内后在肝脏代谢,主要代谢产物为四氢大麻-9-羧酸(THC),陈连康[29]等利用胶体金标记检测大麻单克隆抗体免疫试剂检测盒,对216份尿液样品进行检测,结果发现检测灵敏度为96.67%,准确性为98.61%,且该产品在室温下稳定性至少可持续24个月.Laurenzana[30]等制备了抗脱氧麻黄碱的单克隆抗体并研究了其在药物代谢动力学方面的活性,为进一步的临床研究奠定了基础.3.3利用单克隆抗体鉴定中药原料药并检测其农药残留情况目前我国中药原药材来源混乱情况仍未得到根本解决,同名异物、同物异名、替代用品现象仍然存在.不同种植物或同种植物不同组织中有效成分的含量差别很大,而且栽培药材农药残留量很高,这都影响了中药制剂的疗效和安全性.如果得到某种中药有效成分的单克隆抗体,就可以应用放射免疫法或酶联免疫分析法对待测的不同植物或植物的不同组织的粗提物中的有效成分进行检测分析,判断待测物中该有效成分的有无以及其含量[31].人参皂苷R f是一种重要的人参单体皂苷,N ah[26]等利用在抗人参皂苷R f单克隆抗体基础上的酶联免疫分析法定量测定粗制总皂苷中的人参皂苷R,f在粗提物中的检测限能达到20pg.小檗碱又名黄连素,是从黄连和黄柏等中药中提取的异喹啉类生物碱,具有广泛的药理、药效学活性.K i m JS等利用单克隆抗体及免疫检测法对中草药中活性成分小檗碱及其相关化合物的含量进行了定量分析[32].番泻苷为临床中常用的泻下药,Putalun[33]将番泻苷的单克隆抗体用胶体金技术处理后,用免疫色谱检测技术仅一步就可检测到浓度达125ng/m l的番泻苷.建立在单克隆技术基础之上的免疫检测技术有望在中药质量控制中发挥巨大的作用.此外,单克隆抗体除了可进行免疫分析检测,还有许多其他用途.如可利用单克隆抗体技术快速分离样品,得到高纯度的单一成分,Puta l u n[34]等人用抗人参皂苷单克隆抗体制作免疫亲和色谱,提取得到高纯度的人参皂苷.对于一些有毒物质的单克隆抗体,可利用抗原抗体的特异性反应,在病人体内将该毒性成分中和[35].4展望对于中药中的活性成分的检测,传统方法(如薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法)检测仪器昂贵、检测成本高、耗时长,难以适应环境及市场产品的现场抽查及产品进出口快速通关的要求.如利用单克隆抗体技术制备快速检测试纸,可迅速检测出中药原料药中活性成分的有无,有无违禁添加药物成分及是否有农药残留.另外,中药活性成分化合物单克隆抗体制备方法仍可有新的拓展及改进,如利用卵黄抗体技术[36]大规模制备抗体,从而进一步降低成本.近年来,重组单克隆抗体的构建技术、基因工程抗体和蛋白质工程技术为特异性单克隆抗体的制备提供了新的机遇,为中药中活性成分化合的免疫学检测提供了广阔的前景.参考文献:[1]K ohler G,N ature C.Conti nuous cu lt ures of fused cell s secre ti ng an tibody of predefi ned spec ifi c ity[J].N ature,1975,256(4):495-497.[2]刘楠,天然活性皂苷免疫分析方法的建立及应用.中国药科大学博士论文[D].江苏南京,2007.[3]朱学泰,马瑞军,谢溱.单克隆抗体在中草药中的研究前景[J].中草药,2005,36(6):945-947.[4]K apsenberg M L.Che m i ca ls and prote i ns as a llerg ens and adjuvants[J].T ox i co l ogy L etter,1996,86(2-3):79-83.[5]T am J P.R ecent adv ances i n mu lti ple an tigen peptides[J].J I mmuno lM ethods,1996,196(1):17-32.[6]F asc i g lione GF,M ari n i 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rtant class o f active sub-stances in traditi o na lChinese m ed ici n e,on l y have w eak end absorption or even non-UV absorption,it is d ifficult to analyze and detect the m.The i m m uno log ica l detecti o n of s m a l-l m o lecule co m pounds based on monoclona l anti b ody techno l o gy can be used for a qu ick detecti o n of saponin co m pounds and study i n g its m etabolis m and d istri b uti o n i n v i v o.This m ethod is ti m e-sav i n g,convenient and easil y operated co mpared w ith the conventional detection m et h-ods,and it w ill be used to play a great ro le in setti n g the research standard f o r the trad itional Chinese m edic i n e. K ey w ords:active i n g redients of Ch i n ese her balm edic i n e;m onoclonal antibody;i m m unodetecti o n。
初级检验师资格考试《基础知识》模拟题练习题(2)
![初级检验师资格考试《基础知识》模拟题练习题(2)](https://img.taocdn.com/s3/m/a84a44bb7f1922791688e8b1.png)
一、以下每一道考题下面有A、B、C、D、E五个备选答案。
请从中选择一个最佳答案,并在答题卡上将相应题号的相应字母所属的方框涂黑。
1.正常前列腺液镜检可见多量[1分]A红细胞B白细胞C滴虫D卵磷脂小体E前列腺颗粒细胞考生答案:DD我要纠错2.Rh血型中抗原性最强的是[1分]AC抗原Be抗原CE抗原DD抗原Ec抗原考生答案:DD我要纠错3.与甲状腺功能亢进无关的表现是[1分]A肠蠕动减慢B神经兴奋性升高C心率加快D甲状腺肿大E基础代谢率明显升高考生答案:AA我要纠错4.正常人尿液中可见的管型是[1分]A红细胞管型B白细胞管型C颗粒管型D蜡样管型E透明管型考生答案:EE我要纠错5.目前使用最广泛的测定酶催化活性浓度是温度为[1分] A4℃B10℃C25℃D37℃E42℃考生答案:DD我要纠错骨髓的造血干细胞最早来源于[1分]A肝B脾C胸腺D淋巴结E卵黄囊血岛考生答案:EE我要纠错7.正常粪便中没有[1分]A白细胞B红细胞C上皮细胞D结晶E细菌考生答案:E参考答案:B我要纠错8.不属于人体上呼吸道正常菌群的细菌是[1分] A结核分枝杆菌B表皮葡萄球菌C草绿色链球菌D干燥奈瑟菌E干燥棒状杆菌考生答案:AA我要纠错9.正常人每日通过肾小球滤过的原尿约为[1分]A50LB80LC100LD180LE300L考生答案:DD我要纠错10.巧克力琼脂用于培养嗜血杆菌是因为其含有[1分] A尿素B溴甲酚紫CⅩ因子和Ⅴ因子D葡萄糖E酵母浸液考生答案:CC我要纠错11.RDW是反映红细胞的[1分]A厚度异质性B体积异质性C染色异质性D结构异质性E比积异质性考生答案:BB我要纠错12.细菌体内染色体外的环状双股DNA称为[1分] A异染颗粒B中介体C质粒D芽孢E转位因子考生答案:CC我要纠错13.类白血病反应最常见的类型是[1分]A淋巴细胞型B单核细胞型C中性粒细胞型D嗜碱性粒细胞型E嗜酸性粒细胞型考生答案:CC我要纠错14.轮状病毒的特性不包括[1分]A属于RNA病毒B电镜下呈车轮形态C主要经粪-口途径传播D可引起急性出血性结膜炎E可引起婴幼儿腹泻考生答案:DD我要纠错15.尿液呈深黄色,震荡后产生的泡沫亦呈黄色。
《抗人红细胞乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的制备与鉴定》
![《抗人红细胞乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的制备与鉴定》](https://img.taocdn.com/s3/m/2c076d3a302b3169a45177232f60ddccdb38e666.png)
《抗人红细胞乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的制备与鉴定》一、引言抗人红细胞乙酰胆碱酯酶单克隆抗体作为一种具有特定靶向性和高度敏感性的生物技术产品,在现代生物医学研究和临床诊断中扮演着至关重要的角色。
本篇论文旨在阐述该单克隆抗体的制备与鉴定过程,详细解析实验步骤,并对结果进行科学的分析和解读。
二、材料与方法1. 材料实验所需材料包括:人红细胞、乙酰胆碱酯酶、抗体相关试剂等。
所有试剂均为进口高纯度产品。
2. 方法(1)单克隆抗体的制备a. 抗原的制备与纯化:从人红细胞中提取乙酰胆碱酯酶,进行纯化处理。
b. 融合与筛选:将纯化的抗原与骨髓瘤细胞融合,筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。
c. 抗体的大量制备与纯化:通过体外培养杂交瘤细胞,收集上清液,进行抗体的大量制备与纯化。
(2)单克隆抗体的鉴定a. 抗体特异性鉴定:采用免疫学方法,如ELISA、Western Blot等,检测抗体的特异性。
b. 抗体亲和力鉴定:通过竞争性抑制实验,测定抗体与抗原的结合力。
c. 抗体亚型鉴定:采用分型试剂盒,测定抗体亚型。
三、实验结果1. 单克隆抗体的制备结果通过融合与筛选,成功获得能产生特异性抗人红细胞乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的杂交瘤细胞。
在体外培养下,杂交瘤细胞生长良好,上清液中抗体含量丰富。
2. 单克隆抗体的鉴定结果(1)抗体特异性鉴定:通过ELISA和Western Blot实验,证实该单克隆抗体具有较高的特异性,能与人红细胞乙酰胆碱酯酶特异性结合。
(2)抗体亲和力鉴定:竞争性抑制实验结果显示,该单克隆抗体与抗原的结合力较强,具有较高的亲和力。
(3)抗体亚型鉴定:通过分型试剂盒测定,该单克隆抗体属于IgG型。
四、讨论本实验成功制备了抗人红细胞乙酰胆碱酯酶单克隆抗体,并对其进行了全面的鉴定。
该抗体具有较高的特异性和亲和力,可与人红细胞乙酰胆碱酯酶特异性结合,为后续的生物医学研究和临床诊断提供了有力的工具。
然而,该抗体的制备过程仍需进一步优化,以提高产量和纯度。
抗D-二聚体单克隆抗体的制备和鉴定
![抗D-二聚体单克隆抗体的制备和鉴定](https://img.taocdn.com/s3/m/ffa43b10b5daa58da0116c175f0e7cd184251897.png)
抗D-二聚体单克隆抗体的制备和鉴定抗D-二聚体单克隆抗体的制备和鉴定摘要:D-二聚体(D-dimer)是一种血浆中的溶解产物,是纤维蛋白的降解产物,其含量的增加与血液凝血活动的异常关联密切。
因此,检测D-二聚体的水平在临床上被广泛运用于评估深静脉血栓、肺栓塞等血液凝块的形成程度。
为了更好地研究和利用D-二聚体的相关信息,本文将讨论抗D-二聚体单克隆抗体的制备和鉴定方法。
关键词:D-二聚体;抗体制备;单克隆抗体;鉴定引言D-二聚体是一种具有高度特异性的纤维蛋白降解产物,其在血液中的水平可以反映出机体内凝血系统的活动情况。
D-二聚体水平的升高常常与炎症、血管病变、凝血功能异常等疾病相关,尤其是在深静脉血栓形成和肺栓塞中起着重要作用。
因此,检测和评估D-二聚体的水平对于临床实践具有重要意义。
抗D-二聚体单克隆抗体的制备制备抗D-二聚体单克隆抗体的方法多种多样,其中常用的方法包括杂交瘤技术、免疫化学技术和多肽合成技术等。
杂交瘤技术是目前制备单克隆抗体的主要方法之一。
该方法利用B细胞与肿瘤细胞融合形成杂交瘤细胞,从而获得能够稳定分泌单克隆抗体的细胞株。
具体步骤如下:首先,从小鼠等动物的脾脏或骨髓中获得具有特异性的抗D-二聚体的淋巴细胞;然后,将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,形成杂交瘤细胞;最后,通过筛选和克隆步骤,得到能够稳定分泌抗D-二聚体单克隆抗体的细胞株。
免疫化学技术也是常用的制备抗体的方法之一。
该方法利用化学合成的蛋白质片段来免疫动物,从而诱导动物产生抗D-二聚体的抗体。
具体步骤如下:首先,合成具有D-二聚体特异性抗原特征的多肽;然后,将多肽免疫于动物体内,促使动物产生抗D-二聚体的抗体;最后,通过血清学和免疫学的方法,筛选出能够特异性结合D-二聚体抗原的抗体。
抗D-二聚体单克隆抗体的鉴定鉴定抗D-二聚体单克隆抗体的方法多种多样,其中包括免疫学方法、分子生物学方法和生物化学方法等。
免疫学方法主要包括免疫组化、免疫印迹和免疫沉淀等技术。
利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶ⅲ蛋白的方法
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利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶ⅲ蛋白的方法制备重组人抗凝血酶Ⅲ蛋白的方法如下:
1. 设计并合成抗凝血酶Ⅲ基因的人工合成基因序列。
可以通过基因合成公司购买合成的基因。
2. 将人工合成的抗凝血酶Ⅲ基因序列插入到乳腺生物反应器(例如大肠杆菌)的表达载体中,以便在细胞内高效表达。
3. 转化乳腺生物反应器细胞,使其带有抗凝血酶Ⅲ基因的表达载体。
4. 培养转化细胞,提供适宜的培养基、温度和培养时间,以促进基因的表达和蛋白质的积累。
5. 收集培养物,离心去除细胞残渣,并通过适当的方法(例如超滤、离子交换层析、亲和层析等)纯化抗凝血酶Ⅲ蛋白。
6. 对纯化的抗凝血酶Ⅲ蛋白进行质量控制,包括测定蛋白质浓度和活性,以确保制备的蛋白质具有所期望的功能和纯度。
7. 包装和储存抗凝血酶Ⅲ蛋白,以便在需要时进行使用。
请注意,这只是一种常见的制备方法,具体的步骤和条件可能会因实验室和研究者的要求而有所不同。
此外,进行基因转化和蛋白表达的实验室必须遵守相关的生物安全和伦理规定。
抗凝系统的临床检测
![抗凝系统的临床检测](https://img.taocdn.com/s3/m/478449e1eefdc8d377ee3270.png)
抗凝系统的临床检测发表时间:2011-02-16T11:18:58.653Z 来源:《中外健康文摘》2010年12月第34期供稿作者:闫珍维[导读] 用于防治血管内栓塞或血栓形成的疾病,预防中风或其它血栓性疾病闫珍维 (黑龙江省尚志市妇幼保健院 150600) 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085(2010)34-0138-02【摘要】用于防治血管内栓塞或血栓形成的疾病,预防中风或其它血栓性疾病。
是通过影响凝血过程中的某些凝血因子阻止凝血过程的药物。
正常人由于有完整的血液凝固系统和抗凝及纤溶系统,所以血液在血管内既不凝固也不出血,始终自由流动完成其功能,但当机体处于高凝状态或抗凝及纤溶减弱时,则发生血栓栓塞性疾病。
【关键词】抗凝血类型检测 (一)抗凝血酶-Ⅲ(AT-Ⅲ)测定 1.原理测定方法有多种,常用的有活性测定和定量测定法,此处介绍发色底物法定量测定。
发色底物法测定AT-Ⅲ的原理是将待测的血浆中加入过量的凝血酶,在37℃条件下孵育一定时间,使血浆中的AT-Ⅲ与凝血酶结合,形成1:1的复合物。
然后加入显色底物并继续孵育,剩余的凝血酶作用于显色底物,裂解出显色基团对硝基苯胺(PNA)。
反应体系的显色强度与剩余凝血酶的活性呈正相关,与待测血浆中的AT-Ⅲ活性呈负相关。
2.试剂(1)标准血浆。
(2)底物S2238,浓度为5×10-7mmol/L。
(3)凝血酶溶液牛凝血酶用生理盐水配成7.5~7.7U/ml,每,10ml溶液中加入聚乙二醇6000(PEG 6000)0.8 g混合。
(4)Tris肝素缓冲液0.05mol/L,7.5×10-3mol/L EDTA-Na2,1.75×10-4mmol/L氯化钠,用1mol/L盐酸调节pH至8.4,每升缓冲液中含肝素3万U。
3.操作(1)将标准血浆及待测血浆进行一系列稀释。
(2)将一系列稀释的标准血浆及待测标本与Tris肝素缓冲液混合,于37℃温育5分钟。
人凝血因子Ⅶ单克隆抗体的制备与鉴定
![人凝血因子Ⅶ单克隆抗体的制备与鉴定](https://img.taocdn.com/s3/m/ba285217b80d6c85ec3a87c24028915f804d840e.png)
人凝血因子Ⅶ单克隆抗体的制备与鉴定吕茂民;周华蕾;刘子;章金刚【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2008(19)1【摘要】目的:制备抗人凝血因子Ⅶ单克隆抗体并鉴定其特性.方法:应用杂交瘤融合技术,以重组人凝血因子Ⅶ为抗原免疫BALB/c小鼠;取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA法筛选、融合细胞有限稀释法克隆、克隆化杂交瘤细胞株的亚类鉴定等方法筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特异性进行鉴定;用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行单抗的纯化.结果:获得了3株可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞3E8、3D2和1C5,诱生的腹水效价分别为1∶1×107、1∶1×106和1∶1×106;亚类鉴定表明3B8为IgG2a,其余2株均为IgG1;特异性鉴定显示它们与多种血浆蛋白均无交叉反应,表明单抗是特异的;经过亲和层析,获得了纯化的单抗.结论:获得了特异性的人凝血因子Ⅶ单克隆抗体,为建立人凝血因子Ⅶ检测及纯化方法奠定了基础.【总页数】3页(P73-75)【作者】吕茂民;周华蕾;刘子;章金刚【作者单位】军事医学科学院,野战输血研究所,北京,100850;军事医学科学院,野战输血研究所,北京,100850;军事医学科学院,野战输血研究所,北京,100850;军事医学科学院,野战输血研究所,北京,100850【正文语种】中文【中图分类】Q813.2【相关文献】1.人凝血因子X单克隆抗体的研制及鉴定 [J], 林方昭;肖小璞;黄淑;周昌华;肖玲;周宇;赵青蓉;李湘2.抗人釉原蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 [J], 程岚;束蓉;夏一如;宁航3.重组抗HER2人源化单克隆抗体大规模制备及活性鉴定方法学建立 [J], 陈观平;汪一帆;应栩华4.抗人Ig轻链系列单克隆抗体的研制1.抗人λ轻链亚型/亚群单克隆抗体的制备及特性鉴定 [J], 赵蓉;郑志竑;谢捷明;包少佳;吴国华;邱文萱5.单克隆抗体免疫亲和层析法制备缺凝血因子Ⅸ人基质血浆的初步报告 [J], 王海龄;肖小璞;丁卫;李和因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
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抗凝血酶受体单克隆抗体的制备与鉴定陈万荣 徐 静 刘树玲 刘龙斌 王海涛(军事医学科学 院微生物流行病研究所,北京100071)摘 要 采用杂交瘤技术,获得了4株稳定分泌抗凝血酶受体单克隆抗体(M cAb)杂交瘤细胞株。
4株M cA b均为IgG1 链。
EL ISA交叉试验结果表明,该M cA b不与人凝血酶、凝血酶原和HCV 多肽反应。
4株杂交瘤细胞培养上清液效价为3.2×10-2~1.28×10-3,腹水效价为1.6×10-6~5.12×10-7。
关键词 凝血酶受体 单克隆抗体 酶联免疫吸附试验The Preparation and Identification of Mouse Monoclonal Anti-Thrombin Receptor Antibodies Chen Wanrong,X u J ing,L iu Shuling,et al.(Institute o f M icrobiolog y and Epidemiolog y,Academy of M ilitar y M edical Sciences,Beijing100071)Abstract M ono clo nal antibo dies(M cA b)ag ainst thr ombin r ecept or(T R)w ere pr oduced by fus-ing Sp2/0my elo ma cells w ith spleen cells fro m BA L B/c mice immunized w it h T R.Fo ur hybrido-ma cell lines secr eting specific ant ibodies ag ainst T R w ere obtained by scr eening hybrido ma culture super nat ant s in EL ISA with T R on so lid phase.A ll o f M cA bs w er e Ig G1subclass( ).T here w ere no cr oss-r eact ivities w ith human thr ombin,thro mbog en and HCV peptide in EL ISA.T itr e of hy-br idoma s culture super nat ant s rang ed fro m3.2×10-2to1.28×10-3,and o f ascitic fluid of hy-br idoma s,fro m1.6×10-6to5.12×10-7.Key words thr ombin r ecepto r M cAb EL ISA 凝血酶受体(Throm bin r eceptor,T R)属G-protein受体家族。
T R主要存在于血小板、血管内皮细胞和平滑肌细胞等处,动脉硬化患者血液里TR含量明显增加。
由于上述特征,我们合成了42个氨基酸多肽免疫动物制备McAb,可有以下用途: 建立特异性的酶联免疫测定方法,来测定血中42个氨基酸多肽的水平,提供体内凝血酶原激活T R的证据,并用于心血管系统研究及临床实验室的诊断; 抗-T R M cAb有可能用来阻断凝血酶切割TR,防止动脉硬化、平滑肌增生和血小板激活。
因此,具有作为特异性治疗用药的潜力。
1 材料和方法1.1 试剂 合成的人凝血酶受体(T R)多肽,42个氨基酸,分子量约5000,由美国麻省大学医学院刘龙斌博士提供。
关于T R 多肽的合成与鉴定见文献[1,2]。
羊抗鼠IgG 酶标记抗体为Sigm a公司产品。
胎牛血清为Gibco BRLP公司生产。
Sp2/0骨髓瘤细胞为本室传代保存。
BALB/c小鼠由军事医学科学院动物中心提供。
ELISA封闭液为2% BSA-PBS-T ween-20。
1.2 免疫动物 取TR多肽1mg溶解于1 ml PBS中,与10mg血蓝蛋白(Keyhole・33・细胞与分子免疫学杂志 1997年 13卷 第2期Journal of Cellular and M o lecular Immunolog y Vo l.13N o.21997*美国麻省大学医学院 作者简介:陈万荣,男,48岁,高级实验师limpet hemocyanin)偶联。
免疫动物时,取一定量的T R偶联抗原与等体积福氏完全佐剂混合,制成乳化剂。
第1次免疫100 g/只,皮下注射。
2周后用不完全福氏佐剂第2次免疫,剂量、途径与第1次相同。
2周后取血测定效价。
效价达1∶5000~1∶10000以上时供融合用。
融合前3d,再加强免疫1次。
1.3 抗TR McAb的制备 无菌操作取免疫小鼠脾脏,制备脾细胞悬液按常规方法与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。
以间接ELISA法筛选阳性克隆,用有限稀释法克隆化达到100%阳性为止。
1.4 抗TR McAb的亚类及特异性鉴定 用96孔板条包被T R抗原(2 g/m l)4℃过夜。
用2%BSA-PBS-T ween-20封闭后,加入不同株细胞培养上清液(0.1m l/孔)室温2h,洗板后加入酶标记羊抗鼠Ig G亚类(均1∶500稀释),室温2h后显色,判断结果。
特异性鉴定用凝血酶Ⅱa、凝血酶原Ⅱ和HCV肽与T R M cAb进行ELISA交叉反应试验。
1.5 腹水制备及效价测定 按常规方法进行。
2 结 果2.1 抗TR McAb阳性细胞的筛选 应用B 淋巴细胞杂交瘤技术,融合细胞共384孔,融合率95%。
共获得4株分泌抗TR M cAb 的杂交瘤细胞株,用有限稀释法克隆化3次,阳性率达100%。
这4株分别命名为T R-13、TR-16 T R-22和T R-24。
经扩大培养后,分别制备抗TR McAb的腹水。
培养上清液和腹水中抗TR M cAb的效价见表1。
2.2 抗TR McAb的亚类 对4株抗T R M cAb上清液分别进行了Ig亚类鉴定,均属Ig G1, 链。
于液氮中保存3个月以上,多次传代后仍能稳定分泌抗T R McAb。
用ELISA测定效价均未降低。
表1 4株抗TR M cAb上清液和腹水的ELISA效价Tab1 EL I SA titers o f McAbs in anti-T R ascitic f luid and sup ernatantEL ISA效价杂交瘤细胞株上清液腹 水T R-13 3.20×10-2 1.60×10-6T R-16 3.20×10-2 1.60×10-6T R-22 1.28×10-3 5.12×10-7T R-24 6.40×10-2 3.20×10-6 2.3 抗TR McAb的特异性 应用凝血酶Ⅱa、凝血酶原Ⅱ和HCV多肽与4株抗T R M cAb进行交叉反应,检测结果见表2。
4株抗T R McAb与有关蛋白及多肽均无交叉反应,而与TR合成多肽的反应性很强。
表2 4株抗T R McAb与有关蛋白及多肽的交叉反应Tab2 Cross-reactivities w ith relativep rp teins and p ep tides by EL I SAM cA b的稀释度相关蛋白M cA b(2 g/ml)10-110-210-310-4凝血酶Ⅱa T R-13----T R-16----T R-22----T R-24----凝血酶原ⅡT R-13----T R-16----T R-22----T R-24----HCV多肽T R-13----T R-16----T R-22----T R-24----T R多肽T R-134+4+4+4+T R-164+4+4+4+T R-224+4+4+4+T R-244+4+4+4+・34・3 讨 论我们使用的免疫原是只有42个氨基酸的T R片段,即分子量约5000的小分子多肽类物质,抗原性较弱。
在制备M cAb中,抗原的免疫原性是成功的重要因素,我们用血蓝蛋白与T R多肽的偶联物按常规免疫BALB/c小鼠,获得了分泌高效价的M cAb 的杂交瘤细胞株,这可能与我们应用的偶联方法和血蓝蛋白作为偶联剂有关。
血蓝蛋白与我们筛选出的M cAb无交叉反应,是一种很好的偶联剂。
文献报道,用HCV核心区33肽经SPDP[N-羟基琥珀酰亚胺基-3(2-吡啶基二硫-丙酸酯]方法与鼠血清白蛋白(MSA)交联后脾内直接注射法免疫小鼠等均获得成功[3,4]。
我们采用TR多肽和血蓝蛋白偶联物与福氏完全佐剂等量混合乳化后大剂量多点皮下注射免疫,两周后用不完全佐剂同样方法第2次免疫,1月后取血检测抗体,效价高达1∶10000以上。
这是我们获得高滴度M cAb的有利条件。
关于制备抗TR McAb的研究,国内外未见有报道。
我们对此项工作的研究也刚刚开始。
抗T R M cAb研制的成功,有望能在基础研究和临床应用上产生良好的前景。
参考文献1 V u T-K,Hung D,W heato n V,Coug hlin S.M o lecula r clo ng o f a functional thr ombin recep-to r rev eals a no vel pr oteo ly tic mecha nism o f r e-cepto r act ivat ion.Cell1991;64:10572 V u T-K,Wheato n V,Hung D,Coughlin S.Do-mains specifying thro mbin-r ecepto r inter ac-tio n.N ature1991;353:6743 李保仝,等.HCV核心抗原C33肽单克隆抗体的研制与初步鉴定.细胞与分子免疫学杂志1996;12(1):354 陈万荣,等.脾内直接注射法免疫小鼠制备抗HBC M cA b研究.军事医学科学院院刊1990;14(4):266(收稿1997-01-06 修回1997-02-13)(上接第72页)碱性Helix Loo p Helix(bHLH)因子(也称E2A蛋白)已知是诱导B细胞发育的重要转录因子。
作者研究发现,在IL-2、IL-7和SCF 存在条件下的胸腺器官培养(FT OC)中,一种bHLH在T/NK双能前体细胞向T细胞发育是必需的。
如果在此系统中缺乏bHLH,则双能前体细胞向NK细胞谱系发育。
3.3 Ikaros调控胸腺中谱系的发育 Ikaro s是一种早期造血和淋巴细胞特异性的核转录因子家族的成员,如调控CD3、RAG-1,TdT,Ig H/L的基因。