泛素结合酶UFC1基因的荧光表达载体构建
基因表达载体的构建3.7
启动子：位于基因的首端的 一段特殊的DNA片断，它是 RNA聚合酶的结合位点，驱 动基因转录出mRNA。
终止子：位于基因的尾端的 一段特殊的DNA片断，能终 止mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别 受体细胞中是否含有目的基 因，从而将含有目的基因的 细胞筛选出来
例3、【2019年江苏33题】下图是某基因工程中构建重组质粒的过
程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr)和氨苄青 霉素抗性基因（ampr）。
为了筛选出转入了重组质粒的菌落，应在筛选平板培养 基中添加 氨苄青霉素 。
1 2 √3 4 √5 6 7 √8 9
平板影印培养法
添加氨苄青霉素的培养基
添加四环素的培养基
基因表达载体的构建概念图
目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代，
基
使目的基因能够表达和发挥作用。
因
目的基因
表 达 载
基因表达载体的组成
启动子 终止子
作 用
RNA聚合酶识别和结合部位
作 用
终止转录
体 的 构
复制原点 标记基因
作 用
DNA复制起点
作 鉴别和筛选导入目的基因 用 的受体细胞
限制酶的选择：一种限制酶切割结果分析
下图箭头表示EcoRⅠ的酶切位点，EcoRⅠ识别序列及切点为
G↓AATTC。
EcoRⅠ
难 EcoRⅠ
EcoRⅠ目的基因 Nhomakorabea点
外源DNA
突
质粒
质粒
抗生素 抗性基因
破
思考讨论：
使用EcoRⅠ一种限制酶切割外源DNA和质粒，构建基因表
达载体时，可以形成哪些连接产物？
怎样构建荧光素酶报告基因载体？
怎样构建荧光素酶报告基因载体？
实验流程：1）查找相关基因启动子区域2）预测启动子可能的结合位点（如果需要进行截断载体构建）3）设计启动子引物（特别重要，一对好的引物能让你快速的扩增出你需要的DNA片段，如果引物不好，无法扩增出目的片段，后面操作无从谈起）4）选择合适的载体（我常用的是PGL3-basic、Pmir-GLO等）5)选择合适的限制性酶切位点并加入引物5端，然后合成引物（查看载体图谱，查看多克隆位点区，MCS。
并结合扩增序列的酶切位点找到最适合的酶切位点）6）PCR 扩增目的DNA片段7）载体和DNA片段双酶切，并按比例连接，转化，鉴定，质粒提取，最后酶切鉴定8）测序 9）测序正确后，质粒转染细胞，然后进行荧光检测。
PS:载体构建一般片段长度越长越难弄，你的2100bp还行，不算难。
但对你一个初学者来说也算是挑战了，所以建议交由专门的生物公司做，当然如果你时间允许也可以自己动手。
一般的DNA聚合酶是只能扩增几百bp，因为目的片段较长而且可能出现大量的碱基错配或者碱基丢失等情况，所以推荐使用高保真酶进行PCR扩增，既能扩增大片段，也能保证扩增产物的完整性。
一般PCR扩增的试剂、酶切试剂、连接等一系列试剂都需要单独购买。
后面荧光检测的试剂也需要单独购买。
就那么多吧，也不是很详细，毕竟质粒重组程序很多，很多细节也很重要，没法一一写来。
荧光素酶报告基因步骤
荧光素酶报告基因步骤
荧光素酶报告基因是分子生物学实验中常用的工具，它可以用
来标记目的基因，以便研究该基因在细胞或生物体中的功能。
本
文将介绍荧光素酶报告基因的步骤。
一、选择适当的报告基因
在生物学研究中，常用的报告基因有GFP（绿色荧光蛋白）、luciferase（荧光素酶）等。
选择适当的报告基因需要考虑许多因素，例如研究目的、检测灵敏度等。
二、构建荧光素酶报告基因表达载体
将所选择的报告基因与荧光素酶的编码序列连接在一起，构建
荧光素酶报告基因表达载体。
该载体可用于后续的质粒转染实验。
三、转染表达载体
将构建好的荧光素酶报告基因表达载体转染至所需的细胞或生
物体中，使其表达。
转染方法包括电穿孔法、化学法、病毒载体
介导转染等。
四、用荧光素酶检测目的基因的表达
在实验中使用荧光素酶底物（如荧光素或共轭体H）进行检测，以判断目的基因在细胞或生物体中的表达水平。
五、分析实验结果
通过荧光素酶检测的实验结果，可以确定目的基因在细胞或生
物体中的表达情况。
若荧光素酶信号的强度高，则说明目的基因
表达较多；若荧光素酶信号的强度低，则说明目的基因表达较少。
总结
以上就是荧光素酶报告基因的步骤。
它是分子生物学研究中常
用的一种技术，可以用来研究基因在细胞或生物体中的表达情况。
在实际操作中，还需要根据需要进行优化和调整。
表达载体的构建方法及步骤之欧阳道创编
表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
荧光素酶质粒构建
荧光素酶质粒构建
荧光素酶质粒构建技术是一种利用荧光素酶来构建一个质粒的
新技术，它为我们构建和定制原核和真核质粒提供了有力的工具。
由于质粒的构建超过了普通的克隆技术，它也被称为合成克隆技术。
荧光素酶质粒构建的原理是在原始质粒的基础上，通过荧光素酶将一系列指定的DNA序列，经过PCR扩增后，分离出指定序列碱基变化的新质粒。
此外，质粒构建还可以通过荧光素酶和适当的酶反应来调节新质粒的结构，这极大地提高了质粒的制备速度和效率。
荧光素酶质粒构建的应用范围广泛，主要有两大类。
第一类是基因组构建，它可以应用于基因组工程，如基因合成和基因改造。
第二类是抗性分析，它可以帮助我们了解以往未知的抗性机制，从而有利于抗性基因的有效筛查和抗菌品种的选育。
此外，荧光素酶质粒构建也可以用于肿瘤治疗研究。
例如，用于肿瘤细胞上的特定基因的构建，以及抗肿瘤抗体的表达系统的构建。
这些研究都可以帮助我们了解抗癌的新机制，从而提高抗癌药物的开发效率。
由于荧光素酶质粒构建技术的出现，它使得质粒的制备变得更加简单、快速而有效。
在质粒构建领域，荧光素酶质粒构建技术已经成为一种新的标准，为我们的研究带来了极大的便利。
总之，荧光素酶质粒构建技术是一种重要的技术，它是构建原核和真核质粒的重要工具，其应用范围十分广泛。
通过质粒的构建，我们可以更好地了解不同的生物体的结构和功能，以及促进药物研发的
过程。
在未来，质粒技术将继续发挥重要作用，为研究带来更多便利，助力生命科学的发展。
人脂联素基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建
人脂联素基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建路玲玲;宰军华;崔琳;李强;张莎莎;金小琴【摘要】This study was designed to clone human adiponectin (AD) promoter and construct its luciferase reporter vectors. Total DNA was extracted from human leukocytes and used for amplifying two types of human AD promoter using polymerase chain reaction (PCR) technique. The amplified fragments were inserted into pGL-3 basic vector to construct two types of pGL-3-AD promoter plasmid containing 1.1 kb and 2.1 kb of human AD promoter. The sequence of two recombinant plasmids was determined using gene sequence analysis. The results showed that the recombinant plasmid pGL-3 basic containing human AD promoter was correctly constructed. The sequence was verified to share 99.6% homology with the sequence published at GenBank. It was concluded that the luciferase reporter vector containing human AD promoter is successfully established, which is useful in biolumines-cence imaging technology in vitro.%目的:克隆不同长度人脂联素基因(AD)启动子片段,构建含人AD启动子片段的荧光素酶报告基因载体并进行测序鉴定.方法:利用PCR技术从人全血基因组DNA中扩增出AD启动子片段,经纯化酶切后克隆入载体pGL-3 basic中,形成重组质粒,筛选阳性克隆进行测序,并与GenBank比对.结果:从人全血基因组DNA中PCR扩增得到1.1 kb和2.1 kb AD启动子片段,构建2种报告基因载体,将其命名为AD promoter1.1-pGL-3 basic和AD promoter2.1-pGL-3 basic,经测序证实所插入的目的片段与GenBank检索的人AD启动子序列99.6％匹配.结论:成功构建了含人AD启动子片段的报告基因载体.【期刊名称】《世界科学技术-中医药现代化》【年(卷),期】2013(000)001【总页数】7页(P55-61)【关键词】脂联素基因;启动子;克隆;人基因组DNA;荧光素酶报告基因【作者】路玲玲;宰军华;崔琳;李强;张莎莎;金小琴【作者单位】河南中医学院第一附属医院郑州450000;河南中医学院第一临床医学院郑州450003【正文语种】中文近年来实验研究表明，脂肪组织是一个代谢活跃、功能复杂的内分泌器官，可以产生多种具有生物活性的物质，如脂联素（Adiponectin,AD）、瘦素（Leptin）、纤溶酶原激活物抑制因子（Plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1）、抵抗素（Resistin）、白介素 6（Interleukin-6,IL-6）和肿瘤坏死因子α（Tumournecrosis factor-alpha,TNF-α）等，统称为脂肪细胞分泌因子（Adipokines,ADS）。
泛素结合酶UFC1基因的荧光表达载体构建
泛素结合酶UFC1基因的荧光表达载体构建摘要利用pEGFP-C3作为载体，构建与绿色荧光蛋白基因相连的泛素结合酶UFC1（ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1）序列的真核表达质粒，观察其在真核细胞中的表达和定位，为进一步研究UFC1基因功能打下了基础。
采用RT-PCR方法从宫颈癌Hela细胞中扩增UFC1基因全长cDNA，双酶切后克隆到真核表达载体pEGFP-C3中，构建并鉴定pEGFP-C3-UFC1质粒。
经脂质体介导转染Hela细胞后，在荧光显微镜下观察目的蛋白在真核细胞内的表达情况。
双酶切鉴定和测序分析均证实，已成功构建pEGFP-C3-UFC1重组载体。
重组载体转染Hela细胞，观察到绿色荧光蛋白表达，还可见绿色荧光呈点状分布于细胞质中；而对照pEGFP-C3质粒转染Hela细胞，绿色荧光蛋白则呈弥散状分布。
成功克隆了UFC1基因，构建了pEGFP-C3-UFC1重组质粒。
AbstractTo construct eukaryotic expression plasmid of ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme（UFC1）gene linked with GFP gene with pEGFP-C3 vector and observe its expression and location in eukaryotic cells，thus it can provide a powerful tool to further studythe function of UFC1 gene.The full-length cDNA of UFC1 gene was amplified from human cervical carcinoma Hela cell by RT-PCR；UFC1 gene was cloned into eukaryotic expression vector pEGFP-C3 after double-digestion；To construct and identify the recombinant plasmid pEGFP-C3-UFC1. Then the plasmid was transfected into Hela cells by liposome，and its expression was detected by observing the expression of enhanced green fluorescent protein（EGFP）through fluorescent microscope. Recombinant pEGFP-C3-UFC1 vector was confirmed by double-digestion and sequencing. The green fluorescence was observed in transfected Hela cells. It was mostly located in the cytoplasm and distributed unequally with pEGFP-C3-UFC1 vector transfected；but it was located in cell whole and distributed equally with control vector pEGFP-C3 transfected. UFC1 gene was successfully cloned and recombinant pEGFP-C3-UFC1 vector was successfully constructed.Key wordsUFC1 gene；clone；eukaryotic expression vectorUFC1的全名为“ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1”，是一个新鉴定的类似泛素结合酶E2[1-2]功能的基因。
泛素折叠修饰因子1作用的研究进展
泛素折叠修饰因子1作用的研究进展沈琼娜【摘要】泛素折叠修饰因子1(Ufm1)是最近发现的一种类泛素蛋白,其三级结构与泛素十分类似,但其氨基酸序列与泛素只有16％的相似性.Ufm1及其修饰系统广泛、稳定地存在于多细胞生物中.Ufm1结合到靶蛋白需要通过一系列的酶级联反应,首先Ufm1被Uab5激活,然后转移给Ufc1及Ufl1,最后Ufm1与靶蛋白结合,并对其进行加工、修饰.Ufm1及其修饰系统参与了内质网应激及其诱导的凋亡,同时也参与了细胞周期、细胞存活、脂肪酸β氧化等生物过程的调控,为进一步研究Ufm1的功能提供了新的方向.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2014(020)019【总页数】3页(P3501-3503)【关键词】泛素折叠修饰因子1;类泛素蛋白;内质网应激;凋亡【作者】沈琼娜【作者单位】蚌埠医学院,安徽蚌埠233000【正文语种】中文【中图分类】Q5泛素折叠修饰因子1(ubiquitin fold modifier 1，Ufm1)是由Komatsu等于2004年首先在HEK293细胞中发现的一种小分子类泛素蛋白，其分子质量为9.1×103[1]。
Ufm1及其修饰系统广泛地、保守地存在于动、植物中，如小鼠的脑、心、肺、肾、肝、腹腔固有巨噬细胞等组织[2]。
Ufm1以前体形式存在，需经特异性蛋白酶进行加工处理，再经过一系列酶级联反应，才能与靶蛋白结合，发挥生物学作用。
1 Ufm1的结构Ufm1是一类小分子类泛素蛋白，由85个氨基酸组成。
Ufm1和泛素及其他类泛素蛋白的氨基酸序列比较，其C端有一个丝-甘氨酸二肽结构，而泛素及其他类泛素蛋白在C端有一个保守的双甘氨酸序列[1，3]。
正因为其C端区域的不同导致了空间构向的多变性，提示Ufm1可能发挥多样的生物学作用。
Ufm1及其修饰系统在动植物体内表达丰富，尤其在分泌蛋白的细胞中表达丰富，如胰腺腺泡、胰岛的朗格汉斯细胞和唾液腺等，其主要分布在细胞质和细胞核[2]。
载体构建操作流程
载体构建操作流程载体构建操作流程一、载体准备1、质粒准备电泳检测载体质量好的质粒为三条带，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）；也有观点认为是质粒两条链没有断裂的超螺旋结构，开环DNA和线性DNA。
超螺旋结构应至少占到90%。
测定质粒浓度用核酸定量仪测定质粒的浓度，A230、A260和A280值。
2、质粒双酶切根据需要的酶切位点，选择对应的酶，查找适合的Buffer，进行单酶切。
以TaKaRa的限制酶为例，双酶切的体系如下：试剂体积质粒<1 μgEnzyme I 1μLEnzyme II 1μL10×X Buffer 2μL灭菌水to 20μL总体积20μL将上述体系置于37℃（不同酶可能存在差异）水浴锅中酶切。
根据酶切效率不同确定酶切时间，可以去除2 μl进行电泳检测。
3、回收质粒凝胶回收参照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒说明书。
1)称量胶块重量，计算胶块体积。
计算胶块体积时，以1mg=1μl进行计向胶块中加入胶块融化液Buffer GM，我们一般用1%的琼脂糖凝胶电泳，所以一般加入3个凝胶体积量。
2)均匀混合后室温15-25℃融化胶块。
此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约5～10分钟）。
3)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
将上述操作的溶液转移至Spin Column 中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。
滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。
4)将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。
5)重复操作步骤。
6)将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm 离心1分钟。
7)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。
UFCI基因在乳腺细胞系中的表达分析
Ｍａ ．２ ｌ ｒ ０ １
Ｕ Ｃ 基 因在 乳 腺 细 胞 中 的 达 分 析 ＦＩ 系 衣 表 万
贺 爱 兰 ， 梦成 ， 东海２ 张 彭
（． １ 湖南人文科技学 院 生命科学 系 ， 湖南 娄底 ４ ７０ ；．湖南人文科技学 院 计 算机系 ， １０ １２ 湖南 娄底 ４７ ０ ） １０ １ ［ 摘 要］ 泛素结合 酶 Ｕ Ｃ Ｆ １是一个新鉴定 的类似泛 素结合 酶 Ｅ ２的基 因。 目前 ， Ｕ Ｃ 对 Ｆ １的功 能研 究报道还 比较 少， 有待 更进 一步 的研 究和探讨 。采用半定 量 Ｒ Ｔ— Ｐ Ｒ技 术分 别检 测一 系列的乳腺 细胞 系 ＭＣ ７ Ｈ Ｌ ０ 、 Ｄ Ｃ Ｆ 、 Ｂ １０ Ｍ Ａ—ＭＢ ３ ２１ 和 Ｍ Ａ— Ｄ ＭＢ一 ５ ４ ３中 Ｕ Ｃ Ｆ １基 因的转录水平 ， 结果显示 ， 正常的 Ｈ Ｌ ０ 在 Ｂ １０乳腺 细胞 系中的表达 最高， 而在乳腺癌 细胞 系 ＭＣ ７ ＭＤ Ｆ ， Ａ—ＭＢ ３ ， Ａ—ＭＢ一 ５ ２ １ＭＤ ４ ３中的表 达明显降低 。Ｕ Ｃ 在 乳腺 细胞 系中的差 异表达 的结果 为将 Ｕ Ｃ Ｆ１ Ｆ １作为新
第 ２期 ２ １ 年 ０ 月 ０１ ３
湖南人文科 技学院学报
Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｎ ｎ Ｉ ｓｉ ｔ ｆＨｕ ｎ ｔ ｓ ｃ ｅ ｃ ｎ ｅ ｈ ｏｏ ｙ ｏ ｒ ａ ｆＨｕ ａ ｎ ｔ ｕ ｅ ｏ ｍａ ｉ ｅ ，Ｓ ｉｎ ｅ ａ ｄ Ｔ ｃ ｎ ｌｇ ｔ ｉ
Ｎｏ． ２
致 患 者 死 亡 的一 个 主 要 原 因 ， 润 和 转 移 是 一 个 多 基 因参 新生牛血 清 、 ｍ ｌＬ谷 氨酰胺 和 １０ｍ 浸 ２ ｏ ／ ０ Ｌ青霉 素和 １０ ０
与、 多步骤进行及多 阶段发展 的过程 。随着分 子生 物学 的 ｍ Ｌ链霉素 ） ． 快速发展 ， 一种新 的途 径引起 人们 的关 注 ， ： 即 泛素 （ ｂｑ １ ２ ２ 总 Ｒ Ａ 的 提 取 ｕ ｉ— ．． Ｎ ｕｔ ）系统 。随着人们对肿瘤发生 的分子机 制进一 步 的了 ｉｎ ｉ
构建表达膜锚定荧光素酶的载体实现细胞自发光成像
学术论著ZHONGGUO YIXUEZHUANGBEI145[文章编号] 1672-8270(2019)10-0145-03 [中图分类号] R-331 [文献标识码] ASelf-luminescence imaging of cells by constructing and expressing a vector of membrane-anchored luciferase/LU Cheng, ZHANG Luo, ZHANG Peng//China Medical Equipment,2019,16(10):145-147.[Abstract] Objective: T o construct a vector capable that stably expressed membrane-anchored Gaussia luciferase (GLuc) so as to achieve self-luminescence imaging of cells. Methods:Adopted signal peptides of epidermal growth factor receptor (EGFR), macrophage colony-stimulating factor receptor (MCSFR) andinterleukin 4 receptor α (IL4R α) to replace the signal peptide of GLuc, and then added membrane spanning domains of EGFR, MCSFR and IL4R α behind GLuc so as to construct and express vector of membrane-anchored GLuc. Adopted lentivirus infection to transfect it into immortalized mouse iBloodMC. And through added GLuc substrate in cell and cultural supernatant to detect sparkle, thus to detect the expression of GLuc. Results: Both iBloodMC GLuc-EGFR and iBloodMC GLuc-IL4R α could stably express luciferase. And the iBloodMC GLuc-EGFR expressed more GLuc,and EGFR got better effect that anchoredGLuc on membrane. Conclusion: The vector that expresses membrane-anchored GLusis successfully constructed. When the vector is transfected into cells, self-luminescence imaging of cells can be achieved after substrate is added.[Key words] Luciferase; Membrane-anchored; Bioluminescence; Self-luminescence imaging[First-author’s address] Department of Medical Engineering, Southern Region of the Fifth Medical Center of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100071, China.[摘要] 目的：构建能稳定表达膜锚定Gaussia荧光素酶(GLuc)的载体，以实现细胞自发光成像。
一鼓作气！荧光素酶报告基因解决方案
一鼓作气！荧光素酶报告基因解决方案01双报告基因检测操作流程02单报告基因检测操作流程二GeneCopoeia 荧光素酶报告基因解决方案1.荧光素酶载体构建GLuc-ON™转录响应（TRE）克隆Genecopoeia 提供 GLuc-ON™ 转录响应 (TRE) 克隆，用于在哺乳动物细胞系上进行快速灵敏的信号通路分析。
这些克隆使用分泌型的 Gaussia Luciferase (GLuc) 作为报告基因，通过灵敏而显著的荧光反应，检测特定信号通路对环境刺激物或其他实验操作的生物应答。
GLuc 基因是一个分泌型的蛋白，无需裂解细胞就能从培养基中获得实验样本进行快速方便的检测。
GLuc-ON™启动子报告克隆GeneCopoeia 提供预制和定制的 GLuc-ON™ 启动子克隆，包括单报告基因载体系统和双报告基因载体系统。
单报告基因载体系统以Gluc 作为启动子的报告基因；双报告基因载体系统以Gluc 作为启动子报告基因，以分泌型碱性磷酸酶（SEAP）作为信号标准化的内参，可在活细胞中对超过 20,000 种人和 18,000 种小鼠启动子进行实时活性分析。
miRNA 3' UTR 克隆GeneCopoeia 提供两套 3'UTR 报告载体。
在 pEZX-MT05 载体中，我们将3' UTR 序列（来源于公开的基因序列数据库）插入到Gaussia 荧光素酶报告基因下游，在哺乳动物细胞中由 SV40 启动子驱动转录生成Gaussia 荧光素酶（Gluc）和3' UTR 靶标序列的嵌合mRNA，因此无需裂解细胞实时监测Gluc 的表达，研究mRNA-miRNA 的相互作用。
在相同载体（pEZX-MT05）上带有分泌型碱性磷酸酶（SEAP）报告基因。
CMV 启动子驱动转录的SEAP 作为同质粒内的对照，这种双报告系统可以对多样本常规转染进行精确比较。
pEZX-MT06 是 Firefly/Renilla 双荧光素酶报告载体。
鳜鱼泛素活化酶、泛素结合酶基因的克隆、表达和功能的开题报告
鳜鱼泛素活化酶、泛素结合酶基因的克隆、表达和
功能的开题报告
一、研究背景：
泛素化是一种重要的后修饰过程，通过连接泛素分子来调控蛋白质
的稳定性、亚细胞定位、相互作用、代谢等多个方面。
泛素化过程中参
与的酶主要有泛素激活酶、泛素结合酶和泛素脱解酶。
其中，泛素结合
酶（UBPs）是具有泛素肽酶活性的蛋白质，能够识别和水解泛素与底物
的结合。
目前已发现的UBPs数量众多，具有多样化的结构和作用，且在多种生物学过程中具有重要作用。
因此，研究UBPs的克隆、表达和功能对于深入理解泛素化调控机制具有重要作用。
二、研究内容：
本研究将以鳜鱼（Megalobrama amblycephala）为模型生物，通过
生物信息学方法筛选出候选的UBP基因，并利用PCR技术进行克隆。
通过构建重组质粒并转化大肠杆菌，利用亲和层析技术纯化目标蛋白。
通
过Western blot和质谱等方法对纯化的蛋白进行鉴定和定量，并在体外
体系中进行UBP肽酶活性鉴定。
此外，结合RNAi和原位杂交技术，还将研究该UBP基因在鳜鱼中的表达模式和功能。
三、研究意义：
该研究将为深入理解UBPs在蛋白质泛素化调控中的作用机制提供基础数据。
同时，揭示鳜鱼中UBP基因的克隆、表达和功能有助于理解鳜
鱼生长、发育和免疫等相关生物学过程，对于进一步挖掘鳜鱼遗传资源，促进其产业发展具有重要意义。
细胞核锚定的泛素化酶
细胞核锚定的泛素化酶细胞核锚定的泛素化酶是一类在细胞核内发挥重要功能的酶。
它们通过调控蛋白质的泛素化修饰，参与了细胞核中多种生物学过程的调控，如DNA修复、基因表达和细胞周期等。
在这篇文章中，我们将深入探讨细胞核锚定的泛素化酶的作用机制以及其在细胞核功能调控中的重要性。
让我们了解一下泛素化修饰的基本概念。
泛素化是一种通过共价连接小分子泛素（ubiquitin）到靶蛋白上来调控蛋白质功能的修饰方式。
泛素化酶作为泛素化修饰的关键酶类，在这一过程中起到了关键的调控作用。
它们能够识别、结合和泛素化靶蛋白，并介导其进一步的调控。
在细胞核中，细胞核锚定的泛素化酶发挥着重要的功能。
首先，它们参与了DNA修复的调控。
细胞核是细胞中DNA修复的重要场所，而泛素化修饰在DNA修复中起到了重要的调控作用。
细胞核锚定的泛素化酶能够识别和泛素化DNA修复相关蛋白，调控其活性和稳定性，从而确保DNA修复过程的顺利进行。
细胞核锚定的泛素化酶还参与了基因表达的调控。
在细胞核中，基因的转录和转录后修饰是基因表达的关键环节。
泛素化修饰在这一过程中也扮演着重要的角色。
细胞核锚定的泛素化酶能够调控转录因子的活性和稳定性，影响基因的转录水平和时间表达，从而调节基因表达的动态平衡。
细胞核锚定的泛素化酶还参与了细胞周期的调控。
细胞周期是细胞生命周期中重要的阶段，也是细胞增殖和分化的关键调控点。
泛素化修饰在细胞周期的调控中发挥重要作用。
细胞核锚定的泛素化酶能够泛素化和调控细胞周期相关蛋白，控制细胞周期的进程和转变。
总结起来，细胞核锚定的泛素化酶作为细胞核中的重要调控酶类，参与了细胞核中多种生物学过程的调控，包括DNA修复、基因表达和细胞周期等。
它们通过调控蛋白质的泛素化修饰，影响相关蛋白的活性和稳定性，从而调节细胞核的功能。
对于理解细胞核功能的调控机制以及相关疾病的发生发展具有重要的意义。
希望本文能够对读者对细胞核锚定的泛素化酶有一个全面的了解，并进一步推动相关研究的深入发展。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
ｍｌｎｓ［ ．ｐ ｌ ｎ ｉ ｒ ｅ ｉ，９ ７ １ （ ）１ ７ １９ ｉ ｅｓ ］ ｐ ｖｍｒＭｉ ｏ １６ ，５ １ ： —１ ． ｄ ＪＡ Ｅ ｍｂ １ 【］Ｒ Ｉ ＪＪＣ Ｉ Ｂ Ｎ Ｆ， Ａ Ｅ Ｔ ｅｆｒ ｅ ｔｔ ｎｏ ｉａ — ９ ＥＤ ，Ａ Ｂ Ｏ Ｓ Ｍ Ｈ Ｌ Ｙ Ｄ Ｅ．ｈ ｅ ｎａｉ ｆｃｇ ｍ ｏ ｒ
烟 处理 的最 佳酶 解 温 度 为 ５ ０℃， 适酶 解 时 间 为 ２ｈ 通过 最 。
扫面 电子 显微 镜对 酶处 理 前后片 烟表 面 的观察 ． 也从 侧 面 表
明 菌株 Ｃ １ 所产 纤 维 素酶对 片烟 中的纤 维 素有降 解 作用 。 一ｌ
【１ 中华人民 共和国 国家 发展和改 革委 员会．Ｂ２ ８ — ０ ３纤维 素酶 １】 Ｑ ５ ３ ２ ０ 制 剂 【］ 京 ： 国 标 准 出 版 社 ，０ ３ Ｓ． 北 中 ２０ ． 【２ 布坎 南 Ｒ 吉本斯 Ｎ 伯杰氏细菌鉴 定手册【 ． １］ Ｅ， Ｅ． Ｍ］ ８版． 北京 ： 科学 出 版社 ，９ ４ ７ ２ ７ ５ １８ ：３ — ３ ． 【３ Ｌ Ｄ Ｎ ，ＣＨ Ｅ Ｆ Ｒ ＫＨ．ａｔ ｉｌ ｈ ｌｇｎ ａｅ ｎ１ Ｓａ ｄ １］ Ｕ ＷＩ ＧＷ Ｓ Ｌ ＩＥ Ｂ ｃｅ ａ ｙｏｅ ｙｂ ｄｏ ６ ｎ ｒ ｐ ｓ ２ Ｓｒ ＮＡｓｑ ｅｃ ａｙｉＪ．ＥＭＳＭｉｒｂｏ ｅ ，９ ４，５ ２ ３ ： ３ Ｒ ｅ ｕｎ ｅａ ｌｓ ［］ ｎ ｓ Ｆ ｃｏｉｌ ｖ １９ １ （ — ） Ｒ
（ ） ５ — ０ ２ ：５ ６ ．
解 菌 和 其所 产 酶 可 直 接 投 入 到醇 化 后 片 烟 中 ， 降解 纤 维 素
含量 ， 少其 不 完全燃 烧产 生 的有 害物 质 ， 高香 烟 品质 。 减 提
１５ ７ ． ５ —１ ３
该 高产 菌 产酶 稳 定 ， 微 生物 处理 醇 化 片烟 、 解大 分 在 降
子 物பைடு நூலகம்质 过程 中处 于 重 要 地 位 。 片烟 表 面 筛 选 的纤 维 素降 从
【４ 杨 霞 ， 陆 ， 川 庆 ． Ｓｒ ＮＡ基 因 序 列 分 析 技 术 在 细 菌 分 类 中 应 １】 陈 王 １ ６ Ｒ 用 的研究进展 叨．西北农林科技 大学学报 ：自然科学 版 ，０ ８ ３ ２０ ，６
ｌａｏ ａｃ ｓｉｆ ｅｃｄｂ ｈ ｄ ｉｏ ｆ ｅｓ［］ ｅｆ ｂ ｃｏａ ｎ ｕｎ ｅ ｙｔｅａｄｔ ｎｏ ａｔ ． Ａ鲥 Ｒ ｄａｃ ｔ ｌ ｉ ｙ ＪＪ ｅ ｅｒｈ， １４ ６ （ ）３ ３ ３ １ ９４，９ ５ ：７ － ８ ． 【０ 陈福 星， 磊 ， １］ 王 莫湘涛． 烟叶 微生物发酵 的探讨 ［ ． 南微生物 通讯 ， Ｊ湖 ］
ｆ１ Ａ ＹＯＡ ＩＣ ＮＣ ． ｃｏ ｉ ｏｙｏ ｅｆｒ ｎａｉ ｆ ｐｎｓ ７ ＭＡ ， Ａ Ｏ Ｆ ＧＭｉｒｂｏ ｇ ｆｈ ｅｍｅｔｔ ｎｏ ａ ｉ Ｔ ｌ ｔ ｏ Ｓ ｈ
ｔ ａｃｓｅ／Ｉｔｒａｉｎｌ ｏ ｇｅｓ ｆ ｃｏｉｌｇ ，９ ３：８ ５ ． ｏ ｃｏ［ｌ ｎｅ ｔ ａ Ｃ ｎｒｓ ｏＭｉｒｂｏｏｙ １５ ４ — ０ ｂ ／ ｎ ｏ 【】Ｅ ＧＬＳ Ｂ Ｌ ， Ｅ Ｔ Ｒ Ａ Ｊ ｓｌｔ ｎ ｏ ｅｍｏ ｉ ｓｆ ｍ ８ Ｎ ＩＨ Ｃ Ｆ，Ｅ ＬＥ Ｊ Ｂ Ｒ Ｅ ． ｏａ ｏ ｆｔ ｒ ｐｌ ｒ Ｉ ｉ ｈ ｅ ｏ
农 业基 础 科学
４ 参 考 文 献
现代 农 业科技
２ １ 年 第 ８期 ０１
【】 １ 朱尊权． 卷烟Ｉｇ［ ． Ｍ］ 北京 ： 北京出版社 ，００ ２０ ． 【】 ２ 石屹 ， 佩兰． 育富钾烟 草品种降 低烟叶焦 油产 生量［】 ２ 牛 培 Ｊ． 中国烟草 科 学 ，９７，（ ：５ １． １９ １４）１ — ７ 【】 功 煊 ， 聪 ， 明 月 ， 应 用含 纳 米 贵 金 属 催 化 材 料 降 低 卷 烟 烟 气 ３吕 聂 赵 等 中Ｃ Ｏ技术研究叨 ， 中国烟草学报 ，０ ３，（ ） １ — ７ ２ ０ ９ ３ ：８ ２ ． ［】 尚 鹏 ． 同 温 度 对 Ｃ ２ 胀 烟 丝 致 香 物 质 及 感 官 质 量 的 影 响 研 究 ４刘 不 Ｏ膨 【］ Ｄ． 北京 ： 国 农 业 科 学 院 ，０ ９ 中 ２０ ． ［】 亚 ， 家 明 ， ５戴 郭 肖怡 宁 ， ． 红 蛋 白 的提 取 及 降 低 卷 烟 烟 气 中 Ｎ 亚 等血 一 硝 胺 含 量 的 初 步 实 验 ［］烟 草 科 技 ，０ １ １ ：９ ２ ． Ｊ， ２０ （ ）１ — １ ［】 ６ 刘士军 ， 金钟 国， 唐铁 斌 ， 生物滤棒 的研制开发【］ 中国烟草学 会 等． Ｃ， ／ ２０ ０ ４年 学 术 年 会 论 文 集 ， 汉 ：出版 者 不祥 ］２０ ． 武 ［ ，０ ４
ｒａ ｌａｔｂ ｃ ｏａ ｄ ｅｆｃ ｆｐ ｒ ｕｔｒ ｎ ｃ ｌｔ ｎｏ ｉａ ｏ ｄ Ｏ ｄｅ ｆｏ ａ ｃ ｎ ｆｅｔｏ ｕ ｅｃ ｌｕ ｅｉｏ ｕａｉ ｎｃｇ ｒａ ｍａａ ｏ ｒ ｎ
图 ８ 片烟 降解 后 的扫 面 电镜照 片
质研 究 表 明 ， 一 Ｃ１ １菌株 所 产纤 维 素酶 活 稳定 ， ｐ 值 ６ — 在 Ｈ ． ０ ８０、 度 ４ ～ ０℃都 有 较 高 活 力 。 催 化 的 最 适 ｐ 值 为 ． 温 ０６ 酶 Ｈ
１ ９ （ ）３ — ９ ９ ０ ２ ：７ ３ ．
７ ， ． 最适 温 度 为 ５℃ 。ｅ 和 Ｃ 酶 活 力 有促 进 作 用 ， ０ Ｏ Ｆ ａ对 Ｍ 对 酶 活 力影 响较 小 ， 而 、 ｏ 、ｎ 、 ａ 酶 活 力 有 不 同程 Ｃ Ｚ Ｎ 对 度 的抑 制 作 用 。 片烟 进 行初 步酶 处 理 研究 表 明 ， 酶对 片 对 该