两个甘蓝CBL基因的基因组解析

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甘蓝主要农艺性状的遗传相关及因子分析

数、球高、球径、球形指数、中心柱长、中心柱长／球高、紧实度、生育期和叶球质量等１０个性状进行遗传相关分
析，结果表明：甘蓝主要农艺性状具有较高的遗传多态性，变异系数（ｖ范围为６９％（高）～２．４其ｃ）．７球５４％
（球径）遗传力为２．２球高）～７７％（；２５％（９．９生育期）除球高外，；其他９个性状之间存在较为紧密的相关关
系。因子分析表明：１０个农艺性状集约于３个主因子上，。Ｆ为丰产因子，中心柱长因子，，Ｆ为Ｆ为球高因子，这
江西农业大学学报
２１，３２：２８— ２３０１３（）０４０５
ｈｔ／ｘｅａ．ａ．ｄ．ｎｔ／ｕｂｏｊｕｅｕｃｐ：ｘ
Ｅ — ｍａｌｎｄｂ７５＠ｓｎ．ｏｉ：ｘ７７ｉａｃｍ
ＡｃａＡｇｉｕｕａｉｅｓａｉＪｎｘｅｓｓｔｒｃｈｒｅＵｎｖｒｉｔｉｇｉｎｉｔｓａ
ｒｎｅｏ２５％（ｅｄｈｉｈ）ｔ９．９（ｒｔｐｒｄ．Ｅｃｐｅｄｈｉｔｔｅｏｅｔｉａａｇｄｆｍ２．２ｒｈａｅｔｏ７７％ｇｏｈｅｉ）ｘｅｔａｅｈ，ｈｔｒｒｔｈｄｇｗｏｈｇｈ９ａｓ
（ｅｅｂｅａｄＦｏｅＩｓｔｔ，ｉｇｉｃｄｍｆｇｉｕｕａＳｉｃｓＮｎｈｎ３２０ＣｉａＶｇｔｌｎｌｒｎｔｕＪｎｘＡａｅｙｏＡｒｌｒｌｃｎｅ，ａｃａｇ００，ｈｎ）ａｗｉｅａｃｔｅ３

甘蓝型油菜SLG基因片段的克隆及序列分析

ＡｎｌｓｓｏｅｆＩｏｐａｉｌｔｃｎｎＢｒｓｉａｎａｓａｙｉｆＳｌ－ｎｃｍｔｂｉｙＬｏｕｓＧｅｅｉａｓｃｐｕｉ
ＫＥＬ－ｉｇＺＥａ，ＵＸｕ —ｏｇＨＥＨａ．ａ，ｎＨＥｉ．ｎｉｎ，ＨＮＧＴｏＷｅＬｎ，ｉｎａｄＣＮＪｎＱｉｇＰＹ
菜中都存在第２类的ＳＧ基因，而且，同二倍体芸薹属物种一样，第２类ＳＧ基因之间具有较高的同源性：只有５ＬＬ
个甘蓝型油菜品种和品系中存在第一类ＳＧ基因，而且这些基因序列之间表现出高度的保守性，即同源性在９％以Ｌ６上，明显高于不同等位基因之间的同源性。这些甘蓝型油菜中的ｃａｓＬｌｓＳＧ基因可能源于同一个自交不亲和单体。Ｉ关键词：甘蓝型油菜；自交不亲和；ＬＳＧ基因：同源性分析
（ｓｔｔｏＶｒｌｇｎｉｔｈｏｏｙＺｅｉｇａｅｆｒｕｔｒｌｃｅｃｓＨａｇｈｕ３０２，ｈｊａｇＣｉａＩｔｕｅｆｉｏｙａｄＢｏｅｎｌｇ，ｈｊｎｄｍｙｏＡｇｉｌａＳｉｎｅ，ｎｚｏ０１Ｚｅｎ，ｈｎ）ｎｉｏｃａＡｃｃｕ１ｉ
Ａｂｓｒｃ：ＳｌｉｃｍｐｔｉｔＳ）ｉｏｅｏｅｍｏｔｉｏｔｎｃａｉｍｓｉｏｒｎｌｎｓｔｒｖｎｂｅｄｎｄｐｏｔａｔｅｆｎｏａｉｌｙ（Ｉｓｎｆｈｓ－ｂｉｔｍｐｒｔａｍｅｈｎｓｎｆｗｅｇｐａｔｐｅｅｔｎｒｅｉｇａｒ — ｌｉｏｉｎｍｏｅｕｃｓｉｇＩａｓｃ，ｅｄｐｏｄｖｒｔｓｏａｓｃｌｒｃａ（ｔｒｔｒｓｎ．ｎＢｒｓｉａｔｉｌｉａｉｉｆｏｏｈｅｅＢｒｓｉａｏｅａｅＣＣ）ａｄＢ．ａｅｔｉＡＡ）ｒｅｆｉｃｍｐｔｉｔ，ｎｃｍｐｓｒｓ（ｗｅｅｓｌｎｏａｂｌｙ－ｉｉｗｈｌｅａｈｄｐｏｄＢ．ａｕａｉｔｓ（ｉｔｍｐｉｉｌｉｎｐｓｖｒｉＡＡＣＣ）ｗｅｅｕｕｌｅｆｃｍｐａｉｌ．ｎｔｅＳｅｐｎｅＳｅｈｅｅｒｓａｌｓｌｏｙ－ｔｅＩＩｒｓｏｓ，ＬＧｅｅｗａｎｆｔｅｂｈｇｎｓｏｅｏｈ

两个菜心CBL基因的克隆、生物信息学分析及其表达特性分析

㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(７):１~９ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.０７.００１收稿日期:２０２２－１０－１７基金项目:国家自然科学基金项目(３２２０２４６５)ꎻ广东省自然科学基金项目(２０１９Ａ１５１５０１１６８０)ꎻ韶关市科技攻关项目(２００８１０２２４５３７５３５)ꎻ韶关学院博士科研启动项目(９９０００６１３)作者简介:朱云娜(１９８２ )ꎬ女ꎬ博士ꎬ讲师ꎬ主要从事蔬菜生理与分子生物学研究工作ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｚｈｕｙｎ３２６＠１２６.ｃｏｍ通信作者:刘建国(１９８１ )ꎬ男ꎬ博士研究生ꎬ助理实验师ꎬ主要从事园艺生理生态研究工作ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｊｇｌｉｕ＠ｓｇｕ.ｅｄｕ.ｃｎ两个菜心ＣＢＬ基因的克隆、生物信息学分析及其表达特性分析朱云娜１ꎬ２ꎬ符质２ꎬ冯慧敏１ꎬ２ꎬ王斌１ꎬ２ꎬ沈雪晴２ꎬ汤婉君２ꎬ刘建国１ꎬ２(１.广东省粤北食药资源利用与保护重点实验室ꎬ广东韶关㊀５１２００５ꎻ２.韶关学院英东生物与农业学院ꎬ广东韶关㊀５１２００５)㊀㊀摘要:本研究以油绿５０１菜心(ＢｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＬ.ｓｓｐ.ｃｈｉｎｅｎｓｉｓｖａｒ.ｕｔｉｌｉｓＴｓｅｎｅｔＬｅｅ)为材料ꎬ采用同源克隆方法对其ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９基因进行克隆ꎬ运用ＤＮＡＭＡＮ和ＭＥＧＡ软件对其编码蛋白序列进行同源性分析和系统进化分析ꎬ并利用ｑＲＴ－ＰＣＲ技术分析二者在菜心组织中及不同氮素形态条件下的表达模式ꎮ结果表明:菜心ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９基因的ｃＤＮＡ全长均为６４２ｂｐꎬ编码２１３个氨基酸ꎬ分别命名为ＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９ꎬ具有ＣＢＬ蛋白结合Ｃａ２＋所必需的ＥＦ－ｈａｎｄ型结构域(ＥＦｈ)ꎮＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９编码的氨基酸序列与拟南芥(Ａｒａｂｉ￣ｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ)㊁大白菜(Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ)等物种的同源性均达９５％以上ꎻ二者分别与大白菜的ＢｒＣＢＬ１㊁ＢｒＣＢＬ９遗传距离最近ꎬ并与拟南芥ＡｔＣＢＬ１㊁ＡｔＣＢＬ９共同聚类为一支ꎮＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９在菜心各组织器官中均有表达ꎬ前者在菜心叶片中表达水平较高ꎬ后者在菜心荚果等组织中表达水平较高ꎻ两者表达受氮素形态及水平影响ꎬ前者在低浓度ＮＯ－３或ＮＨ＋４处理后上调表达ꎬ后者表达随ＮＨ＋４浓度增加而上调表达ꎮ该研究结果可为进一步研究菜心ＣＢＬ１和ＣＢＬ９在氮素吸收利用过程中的功能及其调控机制提供一定理论基础ꎮ关键词:菜心ꎻ氮素形态ꎻ类钙调磷酸酶Ｂ亚基蛋白ꎻ基因克隆ꎻ生物信息学分析ꎻ表达分析中图分类号:Ｓ６３４.９:Ｑ７８１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)０７－０００１－０９ＣｌｏｎｉｎｇꎬＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＴｗｏＣＢＬＧｅｎｅｓｉｎＦｌｏｗｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅＣａｂｂａｇｅＺｈｕＹｕｎｎａ１ꎬ２ꎬＦｕＺｈｉ２ꎬＦｅｎｇＨｕｉｍｉｎ１ꎬ２ꎬＷａｎｇＢｉｎ１ꎬ２ꎬＳｈｅｎＸｕｅｑｉｎｇ２ꎬＴａｎｇＷａｎｊｕｎ２ꎬＬｉｕＪｉａｎｇｕｏ１ꎬ２(１.ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＦｏｏｄａｎｄＭｅｄｉｃｉｎａｌＲｅｓｏｕｒｃｅｓｉｎＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉｏｎꎬＳｈａｏｇｕａｎ５１２００５ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＨｅｎｒｙＦｏｋＣｏｌｌｅｇｅｏｆＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＳｈａｏｇｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈａｏｇｕａｎ５１２００５ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅＣＢＬ１ａｎｄＣＢＬ９ｇｅｎｅｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｂｙｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｃｌｏｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄｆｒｏｍｆｌｏｗｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅ(ＢｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＬ.ｓｓｐ.ｃｈｉｎｅｎｓｉｓｖａｒ.ｕｔｉｌｉｓＴｓｅｎｅｔＬｅｅ)ｖａｒｉｅｔｙＹｏｕｌü５０１ ꎬｗｈｏｓｅｈｏｍｏｌｏｇｙａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｕｓｉｎｇＤＮＡＭＡＮａｎｄＭＥＧＡｓｏｆｔｗａｒｅ.ＡｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｏｆｔｈｅｔｗｏＣＢＬｇｅｎｅｓｉｎｔｉｓｓｕｅｓｏｆｆｌｏｗｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅａｎｄｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｎｉｔｒｏｇｅｎｆｏｒｍｓｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｑＲＴ￣ＰＣＲｍｅｔｈｏｄ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＣＢＬ１ａｎｄＣＢＬ９ｇｅｎｅｓｗｅｒｅｂｏｔｈ６４２ｂｐꎬｗｈｉｃｈｅｎｃｏｄｅｄ２１３ａｍｉｎｏａｃｉｄｓａｎｄｎａｍｅｄＢｃＣＢＬ１ａｎｄＢｃＣＢＬ９ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＢｏｔｈｔｈｅｔｗｏＣＢＬｇｅｎｅｓｐｏｓｓｅｓｓｅｄＥＦ￣ｈａｎｄｄｏｍａｉｎ(ＥＦｈ)ꎬｗｈｉｃｈｗａｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｆｏｒＣＢＬｐｒｏｔｅｉｎｔｏｂｉｎｄＣａ２＋.ＨｏｍｏｌｏｇｙａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｈｏｍｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｔｗｏＣＢＬｇｅｎｅｓｏｆｆｌｏｗｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅｗｉｔｈｔｈｏｓｅｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａａｎｄＢｒａｓｓｉｃａｒａｐａｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎ９５％.Ａｃ￣ｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓꎬｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔＢｃＣＢＬ１ａｎｄＢｃＣＢＬ９ｗｅｒｅｔｈｅｍｏｓｔｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈＢｒＣＢＬ１ａｎｄＢｒＣＢＬ９ｏｆＢ.ｒａｐａꎬａｎｄｃｌｕｓｔｅｒｅｄｉｎｔｏｔｈｅｓａｍｅｂｒａｎｃｈｗｉｔｈＡｔＣＢＬ１ａｎｄＡｔＣＢＬ９ｏｆＡ.ｔｈａｌｉａｎａꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｑＲＴ￣ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓꎬｉｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＢｃＣＢＬ１ａｎｄＢｃＣＢＬ９ｗｅｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆｆｌｏｗｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅꎬＢｃＣＢＬ１ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｈｉｇｈｅｒｉｎｌｅａｖｅｓａｎｄＢｃＣＢＬ９ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｈｉｇｈｅｒｉｎｐｏｄｓ.ＩｎａｄｄｉｔｉｏｎꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＢｃＣＢＬ１ａｎｄＢｃＣＢＬ９ｗｅｒｅａｆｆｅｃｔ￣ｅｄｂｙｔｈｅｆｏｒｍｓａｎｄｌｅｖｅｌｓｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎ.ＢｃＣＢＬ１ｗａｓｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄａｔｔｈｅｌｏｗｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＮＯ－３ｏｒＮＨ＋４ꎬｗｈｉｌｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｃＣＢＬ９ｗａｓｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｏｆＮＨ＋４.Ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｐｒｏ￣ｖｉｄｅｄｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｅｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｉｎｇｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＣＢＬ１ａｎｄＣＢＬ９ｏｆｆｌｏｗ￣ｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｕｐｔａｋｅａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＦｌｏｗｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅꎻＮｉｔｒｏｇｅｎｆｏｒｍｓꎻＣａｌｃｉｎｅｕｒｉｎＢ￣ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎꎻＧｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇꎻＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓꎻＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ㊀㊀钙作为第二信使在植物信号转导中具有重要调控作用[１ꎬ２]ꎮ钙调蛋白(ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎꎬＣａＭ)㊁类钙调蛋白(ＣａＭ－ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎꎬＣＭＬ)㊁类钙调磷酸酶Ｂ亚基蛋白(ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎＢ－ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎꎬＣＢＬ)和钙依赖型蛋白激酶(Ｃａ２＋－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅꎬＣＤ￣ＰＫ)是植物体内常见的钙感受器种类[３ꎬ４]ꎮ除ＣＤＰＫ中含有蛋白激酶结构域外ꎬ其他３个钙感受器都不含激酶结构域ꎬ必须与靶蛋白结合形成复合体才能传递钙信号[４ꎬ５]ꎮＣＢＬ起源于绿藻和苔藓ꎬ现广泛存在于被子植物和裸子植物中ꎬ是一种古老的钙感受器[６]ꎬ具有典型的结合Ｃａ２＋结构域ＥＦ手臂(ＥＦ￣ｈａｎｄ)[１]ꎮ类钙调磷酸酶Ｂ亚基蛋白激酶(ＣＢＬｓ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓꎬＣＩＰＫ)是ＣＢＬ特异结合的蛋白激酶ꎬ通过形成ＣＢＬ－ＣＩＰＫ复合体参与调控植物生长发育和非生物胁迫响应[１ꎬ４ꎬ５]ꎮ不同植物ＣＢＬ成员数量不同ꎬ拟南芥[１ꎬ７]㊁烟草[８]㊁黄瓜[９]㊁大白菜[１０]中分别有１０㊁２０㊁６㊁１３个ＣＢＬｓ成员ꎮ植物ＣＢＬｓ参与种子发芽㊁花粉管萌发等生长发育过程[１ꎬ２]ꎬ也参与响应高盐㊁低温㊁干旱等逆境胁迫[１ꎬ４ꎬ１１－１３]ꎮＣＩＰＫ２３在调控矿质营养转运蛋白方面具有重要作用[１ꎬ４ꎬ１１－１４]ꎮ低钾胁迫下ꎬＡｔＣＢＬ１/ＡｔＣＢＬ９可将ＡｔＣＩＰＫ２３定位到质膜ꎬ使其通过磷酸化激活钾离子通道蛋白(ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＫ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１ꎬＡＫＴ１)ꎬ从而增加拟南芥细胞对Ｋ＋的吸收[１５]ꎮ近年来的研究表明ꎬ水稻早期氮响应因子在蛋白质磷酸化等方面富集[１６]ꎬ而氮转运蛋白活性也依赖于外界氮信号所触发的磷酸化[１７]ꎬ因此ꎬ蛋白磷酸化在氮信号传导㊁氮代谢方面发挥重要作用ꎮ如:ＣＢＬ－ＣＩＰＫ复合体通过调控氮转运蛋白磷酸化水平调控拟南芥氮信号通路[１８－２０]ꎻＡｔＣＢＬ１/９－ＡｔＣＩＰＫ２３通过磷酸化修饰ꎬ调控拟南芥硝态氮转运蛋白(ｎｉｔｒａｔｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１.１ꎬＮＲＴ１.１)亲和性的转变ꎬ以适应不同浓度硝酸盐(ＮＯ－３)条件下对ＮＯ－３的吸收[１８]ꎻ在高铵(ＮＨ＋４)胁迫下ꎬＡｔＣＢＬ１－ＡｔＣＩＰＫ２３可调控铵态氮转运蛋白(ａｍｍｏｎｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒꎬＡＭＴ)ＡＭＴ１.１和ＡＭＴ１.２的磷酸化ꎬ使其失去活性ꎬ避免吸收过量ＮＨ＋４[１９ꎬ２１]ꎮ我们最近研究发现ꎬ菜心铵转运蛋白ＢｃＡＭＴ１ｓ可与ＣＩＰＫ２３互作[２２]ꎬ菜心ＣＩＰＫ２３表达受氮素水平和氮素形态的影响(待发表)ꎮ不同ＣＢＬｓ可能参与同一种非生物胁迫ꎬ相同ＣＢＬ可能参与不同非生物胁迫响应[１]ꎮ为此ꎬ本文选择可与ＣＩＰＫ２３互作的ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９为研究对象ꎬ采用同源克隆法获得菜心ＣＢＬ１和ＣＢＬ９的全长序列ꎬ并分析其生物学特性㊁组织表达特性以及对不同氮素形态的响应ꎬ以期为提高菜心氮素吸收利用的作用机理研究提供一定的理论支撑ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料及样品处理供试菜心(ＢｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＬ.ｓｓｐ.ｃｈｉｎｅｎｓｉｓｖａｒ.ｕｔｉｌｉｓＴｓｅｎｅｔＬｅｅ)品种为油绿５０１ (由广州市农业科学研究院选育)ꎬ于２０２１年３５月在广东省韶关市韶关学院英东生物与农业学院生态园玻璃温室内培养ꎮ将菜心种子用７.５％的ＮａＣｌＯ消毒１０ｍｉｎꎬ用无菌水清洗４~５次ꎬ然后播种于海绵块上进行育苗ꎬ待幼苗长至三叶一心时移植到改良霍格兰营养液中进行培养ꎮ之后根据不同２㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀试验要求进行处理㊁取样ꎮ１.１.１㊀基因表达组织特异性分析的样品采集㊀菜心幼苗移栽后生长３０~４０ｄꎬ待角果结荚后ꎬ分别取根㊁茎㊁叶㊁花㊁叶柄㊁荚果㊁花蕾㊁薹茎等组织样品ꎬ用于基因表达的组织特异性分析ꎮ每个样品设３个生物学重复ꎬ每重复取４~６株ꎬ液氮速冻后保存在－８０ħ冰箱中备用ꎮ１.１.２㊀不同水平氮素处理试验的样品处理㊀菜心移苗后在１个剂量的改良霍格兰营养液中培养４ｄꎬ取出用蒸馏水冲洗根部ꎬ然后转移到缺氮营养液中再培养４ｄꎬ将菜心苗分苗移栽到１㊁４㊁８ｍｍｏｌ/ＬＮＨ４Ｃｌ/ＮａＮＯ３营养液中处理２ｈꎬ分别对叶片和根系进行取样ꎬ每个样品设３个生物学重复ꎬ每重复取４~６株ꎬ液氮速冻后置于－８０ħ冰箱保存备用ꎮ１.２㊀总ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ合成采用Ｅａｓｔｅｐ®Ｓｕｐｅｒ植物总ＲＮＡ提取试剂盒[普洛麦格(北京)生物技术有限公司]提取总ＲＮＡꎬ采用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔｗｉｔｈｇＤＮＡＥｒａｓｅｒ试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]反转录合成ｃＤＮＡꎮ１.３㊀菜心ＣＢＬｓ基因克隆在ＮＣＢＩ数据库(ｈｔｔｐｓ://ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｂｌａｓｔ.ｃｇｉ)查找拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ)ＡｔＣＢＬ１㊁ＡｔＣＢＬ９的基因序列ꎬ然后在大白菜(Ｂｒａｓ￣ｓｉｃａｒａｐａ)基因组进行ＢＬＡＳＴ比对ꎬ得到与其同源性最高的ＢｒＣＢＬ１(ＸＭ＿００９１３８６０７.３)㊁ＢｒＣＢＬ９(ＸＭ＿００９１３０６９０.３)基因序列ꎮ菜心是大白菜的一个变种ꎬ亲缘关系较近ꎬ因此根据大白菜ＢｒＣＢＬ１㊁ＢｒＣＢＬ９基因序列设计同源引物用于克隆菜心相应的基因ꎮ利用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５.０软件设计引物ꎬ引物序列见表１ꎮ设置２０μＬＰＣＲ反应体系:ＰｒｉｍｅｒｓｔａｒＭａｘｐｒｉｍｅｒ１０μＬꎬｃＤＮＡ模板链１μＬꎬ上下游引物各１μＬꎬ加ｄｄＨ２Ｏ补充至２０μＬꎮＰＣＲ反应程序:９８ħ预变性５ｍｉｎꎻ９８ħ２０ｓꎬ５８ħ２０ｓꎬ７２ħ１ｍｉｎꎬ３５个循环ꎻ７２ħ延伸１ｍｉｎꎮ回收扩增产物ꎬ连接到ｐＭＤ２０－Ｔ载体并转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞ꎬ将经ＰＣＲ鉴定的阳性克隆送广州擎科生物技术有限公司测序ꎮ１.４㊀生物信息学分析利用表２所列软件对菜心ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９基因编码蛋白及其氨基酸序列进行分析ꎮ㊀㊀表１㊀所用引物及其序列引物序列(５ᶄ－３ᶄ)用途ＣＢＬ１Ｆ:ＡＴＧＧＧＣＴＧＣＴＴＣＣＡＡＴＣＡＡＡＧＲ:ＴＣＡＴＧＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＢＬ９Ｆ:ＡＴＧＧＧＣＴＧＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡＣＲ:ＴＣＡＡＧＴＣＧＣＡＡＴＣＴＣＡＴＣＣＡＣ基因克隆ｑ－ＣＢＬ１Ｆ:ＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＧＡＴＴＴＴＧＲ:ＣＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＴＡＡＡＧＡＴｑ－ＣＢＬ９Ｆ:ＧＧＡＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＧＡＣＣＧＡＲ:ＴＧＧＡＡＡＣＧＴＧＧＴＣＧＴＴＡＴＧＴ荧光定量ＰＣＲＧＡＤＰＨＦ:ＣＡＧＧＴＴＴＧＧＡＡＴＴＧＴＣＧＡＧＧＲ:ＧＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＣＡＣＣＴＴＴＣＡｃｔｉｎ２Ｆ:ＧＡＣＴＡＣＧＡＧＣＡＮＧＡＧＮＴＮＧＡＧＡＣＲ:ＣＴＧＴＴＧＧＡＡＮＧＴＧＣＴＧＡＧＧＧＡ荧光定量ＰＣＲ内参㊀㊀表２㊀所用软件及其网址软件网址用途ＰｒｏｔＰａｒａｍｈｔｔｐｓ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｐａｒａｍ/蛋白质理化特性分析ＥｘＰＡＳｙＰｒｏｔＳｃａｌｅｈｔｔｐｓ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｓｃａ/蛋白疏水性分析Ｃｅｌｌ－Ｐｌｏｃ２.０ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｓｂｉｏ.ｓｊｔｕ.ｅｄｕ.ｃｎ/ｂｉｏｉｎｆ/Ｃｅｌｌ－ＰＬｏｃ－２/ＰｒｏｔＣｏｍｐｖ.９.０ｈｔｔｐ://ｌｉｎｕｘ１.ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ.ｃｏｍ/ｂｅｒｒｙ.ｐｈｔｍｌ?ｇｒｏｕｐ＝ｐｒｏｇｒａｍｓ＆ｓｕｂｇｒｏｕｐ＝ｐｒｏｌｏｃ＆ｔｏｐｉｃ＝ｐｒｏｔｃｏｍｐｐｌ蛋白亚细胞定位ＴＭＨＭＭＳｅｒｖｅｒ２.０ｈｔｔｐｓ://ｓｅｒｖｉｃｅｓ.ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ.ｄｔｕ.ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅ.ｐｈｐ?ＴＭＨＭＭ－２.０蛋白质跨膜结构分析ＮｅｔＰｈｏｓ３.１ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ＮｅｔＰｈｏｓ/磷酸化位点分析ＳｉｇｎａｌＰ５.０ｈｔｔｐｓ://ｓｅｒｖｉｃｅｓ.ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ.ｄｔｕ.ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅ.ｐｈｐ?ＳｉｇｎａｌＰ－５.０蛋白质信号肽预测Ｅｘｐａｓｙｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/蛋白质二级结构分析ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/蛋白质三维结构预测ＳＭＡＲＴｈｔｔｐ://ｓｍａｒｔ.ｅｍｂｌ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ.ｄｅ/保守结构域分析ＳＴＲＩＮＧｈｔｔｐｓ://ｓｔｒｉｎｇ－ｄｂ.ｏｒｇ/蛋白互作分析１.５㊀基因表达量的ｑＲＴ－ＰＣＲ分析按照１.２中的方法提取菜心样品的ＲＮＡ并反转录为ｃＤＮＡꎬｃＤＮＡ样品用ＲＮａｓｅ－ＦｒｅｅｄｄＨ２Ｏ稀释５倍后作为模板ꎬ利用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ®ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭ进行荧光定量ＰＣＲ分析ꎮ扩增体系:２ˑＳＹＢＲＧｒｅｅｎＴａｑＴＭ１０μＬꎬ１０μｍｏｌ/Ｌ上下游引物各０.４μＬꎬｃＤＮＡ模板２μＬꎬ用ＲＮａｓｅ￣ＦｒｅｅｄｄＨ２Ｏ补充到２０.０μＬꎮ扩增程序:９５ħ预变性３ｍｉｎꎬ９５ħ１０ｓꎬ６０ħ３０ｓꎬ循环４０次ꎮ以ＧＡＤＰＨ和Ａｃｔｉｎ２为内参基因ꎬ用２－ΔΔＣｔ计算基因相对表达量[２３]ꎮ１.６㊀数据统计分析与作图用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０１０整理数据ꎬ用ＳＰＳＳ１９.０进行统计分析ꎬ用Ｄｕｎｃａｎｓ法进行显著性分析ꎬ用ＳｉｇｍａＰｌｏｔ１１.０作图ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀菜心ＣＢＬ１、ＣＢＬ９基因的克隆以菜心叶片ｃＤＮＡ为模板ꎬ用ＣＢＬ１－Ｆ㊁ＣＢＬ１－３㊀第７期㊀㊀㊀朱云娜ꎬ等:两个菜心ＣＢＬ基因的克隆㊁生物信息学分析及其表达特性分析Ｒ和ＣＢＬ９－Ｆ㊁ＣＢＬ９－Ｒ引物进行ＰＣＲ扩增ꎬ均获得约６５０ｂｐ的基因片段(图１)ꎮ经测序ꎬ克隆得到的基因片段长度均为６４２ｂｐꎮ通过ＢＬＡＳＴ在线比对ꎬ菜心ＣＢＬ１基因片段与拟南芥的ＡｔＣＢＬ１(ＮＭ＿００１３４１２３８.１)㊁甘蓝型油菜(Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ)的ＢｎＣＢＬ１(ＸＭ＿０１３８８１８４６.３)㊁大白菜的ＢｒＣＢＬ１(ＸＭ＿００９１３８６０７.３)的核苷酸序列同源性分别为９１.１２％㊁９８.２９％㊁９８.４４％ꎻ而菜心ＣＢＬ９基因片段与ＡｔＣＢＬ９(ＮＭ＿１２４０８１.４)㊁ＢｎＣＢＬ９(ＸＭ＿０１３８４０９１２.３)㊁ＢｒＣＢＬ９(ＸＭ＿００９１３０６９０.３)的核苷酸序列同源性分别为９２.２１％㊁９９.６９％㊁９９.６９％ꎮ初步表明所克隆的两个基因片段分别为菜心ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９基因序列ꎮ将这两个基因分别命名为ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９ꎮＭ:ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１:ＢｃＣＢＬ１基因扩增条带ꎻ２:ＢｃＣＢＬ９基因扩增条带ꎮ图１㊀菜心ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９基因的ＰＣＲ扩增图谱２.２㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９的氨基酸序列分析利用ＰｒｏｔＰａｒａｍ和ＥｘＰＡＳｙＰｒｏｔＳｃａｌｅ对Ｂｃ￣ＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９编码蛋白序列进行分析ꎬ结果显示ꎬＢｃＣＢＬ１编码２１３个氨基酸ꎬ分子量为２４.６０ｋＤꎬ原子组成为Ｃ１１０９Ｈ１７２５Ｎ２７７Ｏ３３６Ｓ９ꎬ理论等电点(ｐＩ)为４.６４ꎬ平均疏水率为－０.１７３ꎬ脂肪酸系数为８９.２０ꎬ不稳定系数为３６.３５ꎮＢｃＣＢＬ９编码２１３个氨基酸ꎬ分子量为２４.４１ｋＤꎬ原子组成为Ｃ１０９７Ｈ１７０３Ｎ２７５Ｏ３３８Ｓ８ꎬｐＩ为４.５８ꎬ平均疏水率为－０.１８５ꎬ脂肪酸系数为８８.３１ꎬ不稳定系数为３４.６９ꎮＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９均为可溶性亲水蛋白ꎮ通过ＳｉｇｎａｌＰ５.０预测分析发现二者均无信号肽序列ꎬ为非分泌型蛋白ꎮＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９均有多个丝氨酸磷酸位点(ｓｅｒ)和苏氨酸磷酸位点(Ｔｈｒ)ꎮ利用Ｃｅｌｌ－Ｐｌｏｃ２.０和ＰｒｏｔＣｏｍｐｖ.９.０预测ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９亚细胞定位ꎬ均定位于细胞膜上ꎻＴＭＨＭＭＳｅｒｖｅｒ２.０分析结果表明二者均无跨膜结构ꎮ２.３㊀ＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９的二㊁三级结构分析运用Ｅｘｐａｓｙ的ＳＯＰＭＡ对ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９蛋白的二级结构进行预测分析ꎬ结果(图２)显示ꎬＢｃＣＢＬ１蛋白含有α－螺旋(ａｌｐｈａｈｅｌｉｘ)５０.７０％㊁β－折叠延伸链(ｅｘｔｅｎｄｅｄｓｔｒａｎｄ)１１.７４％㊁β－转角(ｂｅ￣ｔａｔｕｒｎ)５.１６％㊁无规则卷曲(ｒａｎｄｏｍｃｏｉｌ)３２.３９％ꎬ而ＢｃＣＢＬ９蛋白的α－螺旋㊁β－折叠延伸链㊁β－转角㊁无规则卷曲分别为５２.１１％㊁７.９８％㊁６.５７％㊁３３.３３％ꎮ可见ꎬ两者的主要组成部分均为α－螺旋ꎬβ－折叠延伸链㊁β－转角㊁无规则卷曲则散布于蛋白结构中ꎮ三级结构预测结果与该结果一致ꎮ另外ꎬＢｃＣＢＬ１蛋白三级结构为单体结构ꎬ而ＢｃＣＢＬ９蛋白三级结构为二聚体结构(图３)ꎮ２.４㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９氨基酸序列同源性比对及系统进化分析将ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９与ＡｔＣＢＬ１(ＮＰ＿５６７５３３.１)㊁ＡｔＣＢＬ９(ＮＰ＿１９９５２１.１)㊁ＢｒＣＢＬ１(ＸＰ＿００９１３６８５５.１)㊁ＢｒＣＢＬ９(ＸＰ＿００９１２８９３８.１)进行氨基酸序列多重比对分析ꎬ结果(图４)显示ꎬＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９与两个物种ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９的氨基酸相似性介于９５.３１％~１００％ꎬ其中ꎬＢｃＣＢＬ１与ＢｒＣＢＬ１相似性高达１００％ꎬＢｃＣＢＬ９与ＢｒＣＢＬ９相似性为９９.５３％ꎮ蓝色代表α－螺旋ꎻ绿色代表β－转角ꎻ紫色代表β－折叠延伸链ꎻ红色代表无规则卷曲ꎮ图２㊀ＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９蛋白二级结构预测４㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀图３㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９蛋白三级结构预测图４㊀菜心㊁拟南芥㊁大白菜ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９氨基酸序列多重比对结果㊀㊀利用ＳＭＡＲＴ在线工具对两个菜心ＣＢＬ基因编码氨基酸进行保守结构域分析ꎬ结果(图５)表明ꎬＢｃ￣ＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９均具有ＣＢＬ蛋白结合Ｃａ２＋所必需的ＥＦ－ｈａｎｄ型结构域(ＥＦｈ)ꎬ保守结构域均为３个且位置相同ꎬ位于第７１~９９㊁１０８~１３６㊁１５２~１８０位氨基酸ꎬＦＡＮＲＩＦＤＭＦＤＶＫＲＫＧＶＩＤＦＧＤＦＶＲＳＬＮＶＦ(ＢｃＣＢＬ１)和ＦＡＮＲＩＦＤＬＦＤＶＫＲＫＧＶＩＤＦＧＤＦＶＲＳＬＮＶＦ(ＢｃＣＢＬ９)ꎬＫＩＤＦＴＦＲＬＹＤＭＤＣＴＧＦＩＥＲＱＥＶＫＱＭＬＩＡＬ(ＢｃＣＢＬ１)和ＫＴＤＦＴＦＲＬＹＤＭＤＣＴＧＦＩＥＲＱＥＶＫＱＭＬＩＡＬ(Ｂｃ￣ＣＢＬ９)ꎬＩＬＤＫＴＦＥＤＡＤＶＮＱＤＧＫＩＤＫＬＥＷＳＤＦＶＮＫＮ(ＢｃＣＢＬ１)和ＩＬＤＱＴＦＥＤＡＤＶＤＲＤＧＫＩＤＫＴＥＷＳＤ￣ＦＶＩＫＮ(ＢｃＣＢＬ９)ꎮ图５㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９保守结构域分析进化树分析结果(图６)表明ꎬＢｃＣＢＬ１与ＢｒＣＢＬ１图６㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９与拟南芥㊁大白菜ＣＢＬｓ的进化树分析５㊀第７期㊀㊀㊀朱云娜ꎬ等:两个菜心ＣＢＬ基因的克隆㊁生物信息学分析及其表达特性分析亲缘关系最近ꎬＢｃＣＢＬ９与ＢｒＣＢＬ９亲缘关系最近ꎬ其次分别为ＡｔＣＢＬ１和ＡｔＣＢＬ９ꎬ且菜心㊁大白菜㊁拟南芥的ＣＢＬ１与ＣＢＬ９同聚类在一个分支ꎬ而与拟南芥㊁大白菜的其他ＣＢＬ成员相距较远ꎮ进一步表明本研究分离得到的２个菜心ＣＢＬ基因属于植物ＣＢＬｓ基因家族成员ꎬ编码类钙调磷酸酶Ｂ亚基蛋白ꎮ２.５㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９在菜心不同器官中的表达分析由图７可知ꎬＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９在菜心根㊁茎㊁叶㊁叶柄㊁薹茎㊁花蕾㊁花㊁荚果中均有表达ꎮＢｃＣＢＬ１在菜心叶中表达量最高ꎬ显著高于其他器官ꎬ其次为根㊁茎ꎻ在叶柄㊁薹茎㊁花蕾㊁花㊁荚果中表达量相对较低ꎬ且器官间无显著差异ꎮＢｃＣＢＬ９在菜心荚果中表达量最高ꎬ其次为薹茎ꎬ两者间差异显著且均显著高于其他器官ꎻ在叶㊁叶柄㊁花㊁根㊁茎中表达量相对较低ꎬ在花蕾中的表达量最低ꎬ显著低于其他器官ꎬ仅为荚果中表达量的３.３３％ꎮ两个基因均以菜心根系中ＢｃＣＢＬ１的相对表达量为１进行比较分析ꎮ不同小写字母表示在Ｐ<０.０５水平上差异显著ꎬ下同ꎮ图７㊀ＢｃＣＢＬ１(Ａ)和ＢｃＣＢＬ９(Ｂ)在菜心不同器官中的表达分析２.６㊀ＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９对不同氮素形态的响应由图８可知ꎬＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９表达量受氮素形态及其水平影响ꎬ二者表现出不同的表达模式ꎮＢｃＣＢＬ１在低浓度氮条件表达量较高ꎬ表达量有随氮浓度增加而明显下降的趋势ꎻ在８ｍｍｏｌ/ＬＮＯ－３(或ＮＨ＋４)条件下ꎬ菜心根和叶中的ＢｃＣＢＬ１表达量也较高ꎬ为１ｍｍｏｌ/ＬＮＯ－３(或ＮＨ＋４)条件下的５.９２％~４１.４１％ꎮＢｃＣＢＬ１表达还受不同氮素形态影响ꎬ在相同浓度条件下ꎬＮＨ＋４处理的菜心根中ＢｃＣＢＬ１表达量最高ꎬＮＯ－３处理的次之ꎬＮＨ４ＮＯ３处理的最低(图８Ａ)ꎻ在菜心叶中ꎬＢｃＣＢＬ１表达也呈现出与根中类似的变化规律(图８Ｂ)ꎮ由图８Ｃ看出ꎬ在菜心根中ꎬＢｃＣＢＬ９表达量随着ＮＨ＋４浓度增加显著增加ꎬ８ｍｍｏｌ/ＬＮＨ＋４处理下最高ꎬ分别是中㊁低浓度ＮＨ＋４处理下的１.９６倍和４８.１６倍ꎻ而在ＮＯ－３和ＮＨ４ＮＯ３处理下ꎬ随其浓度增加ꎬＢｃＣＢＬ９表达量均呈现出先下降后上升的趋势ꎬ且不同浓度处理间差异显著ꎬ但表达量最高值分别出现在低浓度和高浓度处理时ꎮ在菜心叶中(图８Ｄ)ꎬＢｃＣＢＬ９表达水平随ＮＯ－３浓度增加而降低ꎬ中㊁高浓度处理间表达量差异不显著ꎬ但显著低于低浓度处理ꎻ在ＮＯ－３和ＮＨ４ＮＯ３处理下ꎬＢｃ￣ＣＢＬ９表达水平随浓度的变化趋势与根系中相似ꎬ但变化幅度略小ꎬ其中ꎬ中浓度与高浓度ＮＨ＋４处理间㊁低浓度与高浓度ＮＨ４ＮＯ３处理间差异不显著ꎮ此外ꎬ与ＢｃＣＢＬ１相比ꎬ无论在菜心根还是叶中ꎬＢｃＣＢＬ９均保持较高的表达水平ꎬ暗示两基因可能在氮素吸收利用方面发挥着不同作用ꎮ２.７㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９蛋白互作关系在ＳＴＲＩＮＧ交互式数据库中输入ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９蛋白序列ꎬ选择拟南芥为所属物种ꎬ利用拟南芥蛋白构建互作关系网络ꎬ据此推测Ｂｃ￣ＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９的互作蛋白ꎮ由图９推测可知ꎬＢｃＣＢＬ１蛋白与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族(ＣＩＰＫ１㊁ＣＩＰＫ３㊁ＣＩＰＫ７㊁ＣＩＰＫ８㊁ＣＩＰＫ９㊁ＣＩＰＫ１５㊁ＣＩＰＫ２３㊁ＳＯＳ２㊁ＳＩＰ３)㊁钾离子通道蛋白ＡＫＴ１具有互作关系ꎻ而ＢｃＣＢＬ９蛋白也可与ＡＫＴ１和ＣＩＰＫ家族蛋白互作ꎬ但其互作网络中未包含ＣＩＰＫ７和ＣＩＰＫ１５ꎬ此外ꎬ菜心ＢｃＣＢＬ９还可与免疫亲和蛋白(ＦＫＢＰ１２)和ＡＴ２Ｇ２００５０蛋白互作ꎮ６㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀横坐标的Ｎ㊁Ａ㊁ＮＡ分别代表ＮＯ－３㊁ＮＨ＋４㊁ＮＨ４ＮＯ３ꎬ１㊁４㊁８分别指３种浓度处理ꎬ单位均为ｍｍｏｌ/Ｌꎮ两个基因均以１ｍｍｏｌ/ＬＮＯ－３处理的菜心根系ＢｃＣＢＬ１表达量为１进行比较分析ꎮ图８㊀ＢｃＣＢＬ１(Ａ㊁Ｂ)和ＢｃＣＢＬ９(Ｃ㊁Ｄ)对不同氮素形态的响应图９㊀ＢｃＣＢＬ１(Ａ)和ＢｃＣＢＬ９(Ｂ)蛋白的互作网络３㊀讨论与结论本研究从菜心中克隆到两个完整的ＣＢＬ基因ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９ꎬ开放阅读框均为６４２ｂｐꎬ均编码２１３个氨基酸残基ꎻＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９蛋白均具有ＣＢＬ蛋白结合Ｃａ２＋所必需的ＥＦ－ｈａｎｄ结构域ꎻ与大白菜㊁拟南芥ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９的氨基酸序列同源性均在９５％以上ꎬ聚类于同一进化分支ꎬ但与其他ＣＢＬ成员的遗传距离较远ꎮＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９编码蛋白均为稳定性蛋白ꎬ具有较强的亲水性ꎬ定位于细胞质膜上ꎬ无跨膜结构ꎬ无信号肽ꎬ与拟南芥ＡｔＣＢＬ１㊁ＡｔＣＢＬ９[２４]和唐古特白刺Ｎｔ￣ＣＢＬ的定位结果一致[１１]ꎮＣＢＬ定位于质膜上表明其可能通过结合膜蛋白在细胞中发挥作用[１１]ꎮＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９蛋白结构的主要组成部分均为α－螺旋ꎬ散布β－折叠延伸链㊁β－转角㊁无规则７㊀第７期㊀㊀㊀朱云娜ꎬ等:两个菜心ＣＢＬ基因的克隆㊁生物信息学分析及其表达特性分析卷曲ꎻ然而ꎬＢｃＣＢＬ１为单体结构ꎬＢｃＣＢＬ９蛋白为二聚体结构ꎬ暗示两者可能发挥着不同的生物学功能ꎮ基因在不同组织中的表达特性可能暗示其在相应表达部位的生物学功能[２５]ꎮ在已研究的植物中ꎬ多数ＣＢＬ在各个组织或器官中具有不同程度表达ꎬ在某些组织中具有表达优势[８]ꎮ本研究结果表明ꎬＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９在菜心根㊁茎㊁叶㊁叶柄㊁薹茎㊁花蕾㊁花㊁荚果中均有表达ꎬ其中ꎬＢｃ￣ＣＢＬ１在叶中的表达量远高于在其他组织中ꎬ而ＢｃＣＢＬ９在荚果中的表达量显著高于在其他组织中ꎬ暗示两基因可能分别主要在菜心叶和荚果生长发育过程中发挥作用ꎮ研究报道ꎬＣＢＬ１/９可与ＣＩＰＫ２３形成ＣＢＬ－ＣＩＰＫ复合体参与拟南芥氮信号通路调控[１８ꎬ１９]ꎬ并可响应低温㊁高盐㊁干旱㊁低钾等多种逆境胁迫ꎬ在植物生长发育过程和非生物胁迫中具有重要作用[１３ꎬ２０]ꎮ本研究结果表明ꎬＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９确实可响应外界氮素变化ꎬ二者的表达水平不仅受不同氮素形态影响ꎬ也受氮素水平影响ꎬ但二者呈现出不同的变化趋势ꎮ其中ꎬＢｃＣＢＬ１在低浓度(１ｍｍｏｌ/Ｌ)单一氮源(ＮＯ－３或ＮＨ＋４)条件上调表达ꎬ而在中(４ｍｍｏｌ/Ｌ)㊁高浓度(８ｍｍｏｌ/Ｌ)或混合氮源(ＮＨ４ＮＯ３)条件下调表达ꎬ甚至不表达ꎻＢｃＣＢＬ９在低浓度ＮＨ＋４条件下表达量低ꎬ在中㊁高浓度ＮＨ＋４条件下表达量高ꎬ而在ＮＯ－３和ＮＨ４ＮＯ３处理时ꎬＢｃＣＢＬ９在低/高氮浓度下表达水平较高ꎬ在中等浓度下表达量较低ꎮ这与ＡｔＣＢＬ１/９受低浓度ＮＯ－３诱导上调表达而在高浓度ＮＯ－３时下调表达[１８]的结论一致ꎮＳｔｒａｕｂ[２４]报道ꎬ拟南芥ＡｔＣＢＬ１表达依赖于ＮＨ＋４ꎬ缺氮后恢复供２ｍｍｏｌ/ＬＮＨ＋４可诱导其表达ꎬ供ＮＨ＋４３０ｍｉｎ时ꎬＡｔＣＢＬ１表达量达到峰值ꎬ随后开始下降ꎻ而ＡｔＣＢＬ９表达量在供ＮＨ＋４３０ｍｉｎ后才开始增加ꎬ随后基本无明显变化ꎮ本研究主要对供不同浓度不同形态氮素２ｈ后ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９基因在菜心中的表达情况进行分析ꎬ并未比较不同供氮时间对二者表达量的影响ꎬ可在今后研究中增加该项目ꎮ通过ＳＴＲＩＮＧ交互式数据库ꎬ利用拟南芥ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９蛋白构建互作蛋白网络ꎬ据此推测菜心的ＢｃＣＢＬ１与ＣＩＰＫ１㊁ＣＩＰＫ３㊁ＣＩＰＫ７㊁ＣＩＰＫ８㊁ＣＩＰＫ９㊁ＣＩＰＫ１５㊁ＣＩＰＫ２３等ＣＩＰＫ家族成员及钾离子通道蛋白ＡＫＴ１互作ꎻ而ＢｃＣＢＬ９虽可与ＡＫＴ１㊁ＣＩＰＫｓ互作ꎬ但ＣＩＰＫ成员不包含ＣＩＰＫ７和ＣＩＰＫ１５ꎬ此外ꎬＢｃＣＢＬ９还可与ＦＫＢＰ１２和ＡＴ２Ｇ２００５０蛋白互作ꎮＳＴＲＩＮＧ数据库对ＡＴ２Ｇ２００５０蛋白注释为含有蛋白磷酸酶２Ｃ和环核苷酸结合/激酶结构域蛋白ꎬ参与调控蛋白质磷酸化ꎮＡｔＣＢＬ１/９受低浓度ＮＯ－３诱导表达ꎬ促进其与ＣＩＰＫ２３形成复合体以调控ＡｔＮＲＴ１.１磷酸化水平ꎬ从而促进ＮＯ－３运输[１８]ꎮ在拟南芥中ꎬＡｔＣＢＬ１与ＡｔＣＩＰＫ２３形成ＣＢＬ－ＣＩＰＫ复合体ꎬ参与调控ＡｔＡＭＴ１.１和ＡｔＡＭＴ１.２蛋白磷酸化水平ꎬ从而调控拟南芥根系对ＮＨ＋４的吸收ꎬ而ＡｔＣＢＬ９并未参与调控[１９ꎬ２１ꎬ２４]ꎮ本研究发现菜心ＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９表达均受不同氮素形态和氮素水平影响ꎬ二者在不同氮素形态下如何调控氮素吸收利用ꎬ是否存在功能冗余现象ꎬ仍需进一步研究ꎮ综上ꎬ本研究分离得到的ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９基因属于菜心ＣＢＬ基因家族成员ꎬ具有组织表达特异性ꎬ受氮素不同形态不同水平影响ꎬ但两者表达模式不同ꎬ可能参与调控不同氮素条件下的氮吸收与利用过程ꎬ具体作用机制还需进一步探究ꎮ在今后研究中ꎬ可将氮素供应时间进一步细化ꎬ观察ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９基因在不同供氮时间下的表达模式ꎬ再利用ＶＩＧＳ对基因进行沉默ꎬ验证其功能ꎮ本研究结果可对进一步探究菜心氮素吸收利用分子机制提供一定的理论依据ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀张传鹏ꎬ戴绍军ꎬ魏建华ꎬ等.ＣＢＬ家族在植物逆境胁迫响应和生长发育中的作用[Ｊ].现代农业科技ꎬ２０１３ꎬ５:２３０－２３１ꎬ２３４.[２]㊀ＭäｈｓＡꎬＳｔｅｉｎｈｏｒｓｔＬꎬＨａｎＪＰꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎＢ￣ｌｉｋｅＣａ２＋ｓｅｎｓｏｒｓＣＢＬ１ａｎｄＣＢＬ９ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｐｏｌｌｅｎｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄｐｏｌｌｅｎｔｕｂｅｇｒｏｗｔｈｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔꎬ２０１３ꎬ６(４):１１４９－１１６２.[３]㊀曾后清ꎬ张夏俊ꎬ张亚仙ꎬ等.植物类钙调素生理功能的研究进展[Ｊ].中国科学:生命科学ꎬ２０１６ꎬ４６(６):７０５－７１５. [４]㊀马瑞ꎬ李世贵ꎬ刘维刚ꎬ等.植物ＣＢＬ－ＣＩＰＫ信号系统的功能及其响应非生物胁迫作用机制研究进展[Ｊ].植物生理学报ꎬ２０２１ꎬ５７(３):５２１－５３０.[５]㊀王海波ꎬ李芙蓉ꎬ杨金翠ꎬ等.ＣＢＬ－ＣＩＰＫ信号系统参与小桐子抗冷性形成的生物信息学分析[Ｊ].广西植物ꎬ２０２２ꎬ４２(６):９９６－１００７.[６]㊀ＷｅｉｎｌＳꎬＫｕｄｌａＪ.ＴｈｅＣＢＬ￣ＣＩＰＫＣａ２＋￣ｄｅｃｏｄｉｎｇｓｉｇｎａｌｉｎｇｎｅｔ￣８㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀ｗｏｒｋ:ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２００９ꎬ１８４(３):５１７－５２８.[７]㊀ＫｏｌｕｋｉｓａｏｇｌｕＵꎬＷｅｉｎｌＳꎬＢｌａｚｅｖｉｃＤꎬｅｔａｌ.Ｃａｌｃｉｕｍｓｅｎｓｏｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ:ｇｅｎｏｍｉｃｓｏｆｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐ￣ｓｉｓａｎｄｒｉｃｅＣＢＬ￣ＣＩＰＫｓｉｇｎａｌｉｎｇｎｅｔｗｏｒｋｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏ￣ｇｙꎬ２００４ꎬ１３４(１):４３－５８.[８]㊀曾文艺ꎬ周思如ꎬ左同鸿ꎬ等.普通烟草ＣＢＬ基因家族全基因组鉴定与分析[Ｊ/ＯＬ].分子植物育种ꎬ２０２２－０１－１０.ＤＯＩ:２０２２.４６.１０６８.Ｓ.２０２２０１１０.１３１７.０１０.[９]㊀曹齐卫ꎬ刘明毓ꎬ陈伟ꎬ等.黄瓜ＣＢＬ基因的鉴定和特征分析[Ｊ].核农学报ꎬ２０１６ꎬ３０(１１):２１２７－２１３２. [１０]李利斌ꎬ王殿峰ꎬ刘立锋ꎬ等.大白菜ＣＢＬ家族基因的鉴定和遗传进化分析[Ｊ].山东农业科学ꎬ２００９ꎬ５:４－７ꎬ１１. [１１]黎梦娟ꎬ朱礼明ꎬ霍俊男ꎬ等.唐古特白刺ＮｔＣＢＬ１㊁ＮｔＣＢＬ２基因克隆及表达分析[Ｊ].南京林业大学学报(自然科学版)ꎬ２０２１ꎬ４５(３):９３－９９.[１２]张俊文ꎬ魏建华ꎬ王宏芝ꎬ等.ＣＢＬ－ＣＩＰＫ信号系统在植物应答逆境胁迫中的作用与机制[Ｊ].自然科学进展ꎬ２００８ꎬ１８(８):８４７－８５６.[１３]ＭａＸꎬＬｉＱＨꎬＹｕＹＮꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＣＢＬ￣ＣＩＰＫｐａｔｈｗａｙｉｎｐｌａｎｔｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｓｔｒｅｓｓｓｉｇｎａｌｓ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏ￣ｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０２０ꎬ２１(１６):５６６８.[１４]ＲóｄｅｎａｓＲꎬＶｅｒｔＧ.ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｒｏｏｔｎｕｔｒｉｅｎｔｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓｂｙＣＩＰＫ２３: Ｏｎｅｋｉｎａｓｅｔｏｒｕｌｅｔｈｅｍａｌｌ [Ｊ].ＰｌａｎｔａｎｄＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０２０ꎬ６２(４):５５３－５６３.[１５]ＢｅｈｅｒａＳꎬＬｏｎｇＹꎬＳｃｈｍｉｔｚ￣ＴｈｏｍＩꎬｅｔａｌ.ＴｗｏｓｐａｔｉａｌｌｙａｎｄｔｅｍｐｏｒａｌｌｙｄｉｓｔｉｎｃｔＣａ２＋ｓｉｇｎａｌｓｃｏｎｖｅｙＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｒｅ￣ｓｐｏｎｓｅｓｔｏＫ＋ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２０１７ꎬ２１３(２):７３９－７５０.[１６]ＹａｎｇＨＣꎬＫａｎＣＣꎬＨｕｎｇＴＨꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｅａｒｌｙａｍｍｏｎｉｕｍｎｉｔｒａｔｅ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｓｉｎｒｉｃｅｒｏｏｔｓ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１７ꎬ７(１):１６８８５.[１７]ＸｕａｎＷꎬＢｅｅｃｋｍａｎＴꎬＸｕＧＨ.Ｐｌａｎｔｎｉｔｒｏｇｅｎｎｕｔｒｉｔｉｏｎ:ｓｅｎｓ￣ｉｎｇａｎｄｓｉｇｎａｌｉｎｇ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ３９:５７－６５.[１８]ＨｏＣＨꎬＬｉｎＳＨꎬＨｕＨＣꎬｅｔａｌ.ＣＨＬ１ｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｓａｎｉｔｒａｔｅｓｅｎｓｏｒｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２００９ꎬ１３８(６):１１８４－１１９４. [１９]ＳｔｒａｕｂＴꎬＬｕｄｅｗｉｇＵꎬＮｅｕｈäｕｓｅｒＢ.ＴｈｅｋｉｎａｓｅＣＩＰＫ２３ｉｎｈｉｂ￣ｉｔｓａｍｍｏｎｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ２０１７ꎬ２９(２):４０９－４２２.[２０]ＴａｎｇＲＪꎬＷａｎｇＣꎬＬｉＫＬꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＣＢＬ￣ＣＩＰＫｃａｌｃｉｕｍｓｉｇ￣ｎａｌｉｎｇｎｅｔｗｏｒｋ:ｕｎｉｆｉｅｄｐａｒａｄｉｇｍｆｒｏｍ２０ｙｅａｒｓｏｆｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２０ꎬ２５(６):６０４－６１７. [２１]ＨａｏＤＬꎬＺｈｏｕＪＹꎬＹａｎｇＳＹꎬｅｔａｌ.Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｍｍｏｎｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０２０ꎬ２１(１０):３５５７.[２２]朱云娜.菜心ＢｃＡＭＴ１ｓ在铵硝营中调控铵吸收的作用机理研究[Ｄ].广州:华南农业大学ꎬ２０１８.[２３]ＬｉｖａｋＫＪꎬＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎＴＤ.Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｌａｔｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄａｔａｕｓｉｎｇｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎｄｔｈｅ２－ΔΔＣＴｍｅｔｈｏｄ[Ｊ].Ｍｅｔｈｏｄｓꎬ２００１ꎬ２５(４):４０２－４０８.[２４]ＳｔｒａｕｂＴ.Ｐｌａｎｔａｍｍｏｎｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ(ＡＭＴ)ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｉｎｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｎｅｔｗｏｒｋｓ[Ｄ].Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ:ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＨｏｈｅｎｈｅｉｍꎬ２０１６.[２５]翟莹ꎬ邱爽ꎬ张军ꎬ等.大豆中３个Ｄｏｆ转录因子的生物信息学及表达分析[Ｊ].华北农学报ꎬ２０１９ꎬ３４(６):１４－１９.９㊀第７期㊀㊀㊀朱云娜ꎬ等:两个菜心ＣＢＬ基因的克隆㊁生物信息学分析及其表达特性分析。

两个菜心CBL基因的克隆、生物信息学分析及其表达特性分析

两个菜心CBL基因的克隆、生物信息学分析及其表达特性分析
作者：朱云娜符质冯慧敏王斌沈雪晴汤婉君刘建国
来源：《山东农业科学》2023年第07期
摘要：本研究以‘油綠501’菜心（Brassica campestris L.ssp. chinensis var.uilisa Tsen et Lee）为材料，采用同源克隆方法对其CBL/、CBL9基因进行克隆，运用DNAMAN和MECA软件对其编码蛋白序列进行同源性分析和系统进化分析，并利用qRT-PCR技术分析二者在菜心组织中及不同氮素形态条件下的表达模式。

结果表明：菜心CBLI、CBL9基因的cDNA全长均为642 bp，编码213个氨基酸，分别命名为Bc CBL1和BcCBL9，具有CBL蛋白结合Ca2+所必需的EF-hand型结构域（EFh）。

BcCBL1、BcCBL9编码的氨基酸序列与拟南芥（Arabidopsis thalicma）、大白菜（Brassica rapa）等物种的同源性均达95%以上；二者分别与大白菜的BrCBLl、BrCBL9遗传距离最近，并与拟南芥ALCBLI、ALCBL9共同聚类为一支。

BcCBLI和BcCBL9在菜心各组织器官中均有表达，前者在菜心叶片中表达水平较高，后者在菜心荚果等组织中表达水平较高；两者表达受氨素形态及水平影响，前者在低浓度NO3-或NH4+处理后上调表达，后者表达随NH4浓度增加而上调表达。

该研究结果可为进一步研究菜心CBL1和CBL9在氮素吸收利用过程中的功能及其调控机制提供一定理论基础。

关键词：菜心；氨素形态；类钙调磷酸酶B亚基蛋白；基因克隆；生物信息学分析；表达分析
中图分类号：S634.9；Q781 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2023）07-0001-09。

甘蓝型油菜S-GT基因克隆、hpRNAi载体构建及遗传转化

（湖北大学生命科学学院，湖北武汉４０６）３０２
摘要：根据发表的甘蓝型油菜ＳＧ－Ｔ基因ｃＤＮＡ序列设计引物，以甘蓝型油菜总ＤＮＡ为模板进行ＰＲＣ扩增，获得ＧＴ基因全长．根据获得的基因序列设计引物扩增出ＳＧ－Ｔ基因序列相同但是带有不同酶切位点
的作用下可生成异硫氰酸盐，嗯唑烷硫酮等有毒代谢物，影响其作为饲料的适口性和动物生长，降低种
子硫甙一直是油菜育种的一个目标＿．２经过油菜科研人员的努力，］目前的油菜已基本实现双低（芥酸、低低硫甙）但是双低油菜的抗性普遍较低，，推测可能与植株整体硫甙降低有关＿］研究表明，３． “ 硫甙是十字花科等植物中一类活跃的次生代谢物，持正常硫甙水平是植物的一种自我保护机制，水解物可有效维其提高植物的抗虫抗病能力，甙的另一重要生理功能是在硫胁迫时作为一种硫的有效贮藏形式＿．硫５ｊＴｉｈｄｏｉｔｇｕｏｙｔａｓｅａｅ（－是催化硫甙核心结构合成的一个关键酶＿］在本研究ｈｏｙｒｘｍａｅ１ｃｓ１ｎｆｒｓＳＧＴ）ｒ５．中我们克隆了甘蓝型油菜中硫甙合成关键酶ＳＧ－Ｔ基因，构建了该基因的种子特异性干扰载体，进行并了农杆菌介导的遗传转化，性筛选和ＰＲ初步鉴定，望只在种子中降低硫甙而不影响植株其它器抗Ｃ期官的硫甙水平．

大白菜、甘蓝和黑芥CBL1基因的比较分析

ｏｆＮａｔｉｏｎａｌＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔＣｅｎｔｅｒｆｏｒＶｅｇｅｔａｂｌｅｓ／ＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｃｉｎａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｒｅｅｎｈｏｕｓｅＶｅｇｅｔａｂｌｅＢｉｏｌｏｇｙ，
（１．山东省农业科学院蔬菜花卉研究所／国家蔬菜改良中心山东分中心／山东省设施蔬菜生物学重点实验室，
山东济南２５０１００；２．海阳市农业技术推广站，山东海阳２６５１００）
摘
要：ＣＢＬ１基因在植物非生物逆境应答及发育过程中具有重要功能。本试验在解析大白菜、甘蓝和黑
Ｊｉｎａｎ２５０１００，Ｃｈｉｎａ；２．ＨａｉｙａｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＥｘｔｅｎｓｉｏｎＳｔａｔｉｏｎ，Ｈａｉｙａｎｇ２６５１００，Ｃｈｉｎａ）
芥ＣＢＬ１的基础上，对它们进行了系统地比较分析，为进一步研究ＣＢＬ１基因在芸薹属植物中的分子进化和功
能奠定基础。
关键词：芸薹属；ＣＢＬ１；结构；进化；顺式元件
中图分类号：￥６３４．１＋￥６３５．１＋￥６３７．１文献标识号：Ａ文章编号：１００１－４９４２（２０１４）１２－０００１－０３

甘蓝型油菜SLG基因片段的克隆及序列分析

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(5): 764−769/zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@基金项目: 国家自然科学基金项目(30600397); 中国博士后科学基金(2005038643); 浙江省自然科学基金项目(Y305140); 2006年度浙江省博士后科研项目择优资助项目(2006-BSH-40)作者简介: 柯丽萍(1976–), 女, 博士, 研究方向为油菜分子生物学。

E-mail ：kelip@*通讯作者(Corresponding author): 陈锦清, 男, 研究员, 主要从事油料作物基因工程与品质改良研究。

Tel (Fax): 0571-********;E-mail: j.q.chen@Received(收稿日期): 2007-12-05; Accepted(接受日期): 2007-12-22.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00764甘蓝型油菜SLG 基因片段的克隆及序列分析柯丽萍郑滔吴学龙何海燕陈锦清*(浙江省农业科学院病毒学与生物技术所, 浙江杭州310021)摘要: 通过不同甘蓝型油菜中SLG 基因的克隆及序列分析, 探索了甘蓝型油菜中是否存在与芸薹属二倍体中相同或相似的S -locus 基因。

对10个甘蓝型油菜品种和品系中SLG 基因的PCR 扩增和序列比较分析发现, 这些甘蓝型油菜中都存在第2类的SLG 基因, 而且, 同二倍体芸薹属物种一样, 第2类SLG 基因之间具有较高的同源性; 只有5个甘蓝型油菜品种和品系中存在第一类SLG 基因, 而且这些基因序列之间表现出高度的保守性, 即同源性在96%以上, 明显高于不同等位基因之间的同源性。

这些甘蓝型油菜中的class I SLG 基因可能源于同一个自交不亲和单体。

关键词: 甘蓝型油菜; 自交不亲和; SLG 基因; 同源性分析Analysis of Self-Incompatibility Locus Gene in Brassica napusKE Li-Ping, ZHENG Tao, WU Xue-Long, HE Hai-Yan, and CHEN Jin-Qing *(Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, Zhejiang, China)Abstract : Self-incompatibility (SI) is one of the most important mechanisms in flowering plants to prevent inbreeding and pro-moter outcrossing. In Brassica , the diploid varieties of Brassica oleracea (CC) and B. campestris (AA) were self-incompatibility, while the amphidiploid B. napus varieties (AACC) were usually self-compatible. In the SI response, SLG gene was one of the S -locus genes that supposed to contribute to receptor —ligand interactions and signal transduction. SLG gene shares a similarity of 85–98% with eSRK (SRK ectodomain) in the same S haplotype, while in different S haplotypes, the SLGs and SRKs behave dif-ferently. In order to make out whether the S -locus exist in B. napus , the SLG gene in the S -locus in several varieties of B. napus were cloned. By PCR analysis and sequences comparison, the class II SLG gene was found in all tested varieties of B. napus , while class I SLG genes were only found in 5 of the 10 tested varieties. Further studies indicated that the five varieties that had the class I SLG genes were probably derived from the same S haploid years ago. The results would provide scientific reference for further study and exploitation on the mechanistic studies of self-compatibility in Brassica napus L. Keywords: Brassica napus ; Self-incompatibility; SLG gene; Homologous analysis芸薹属中二倍体物种甘蓝(Brassica oleracea , CC)、白菜和白菜型油菜(B. campestris , AA)存在广泛的自交不亲和性, 而其相应的异源四倍体种甘蓝型油菜(B. napus , AACC)通常表现为自交亲和[1]。

甘蓝基因组测序分析完成

（光明日报）
３Ｓ・
素在植物生长发育中作用的理解，也为水稻及其他植
物通过 “ 根工程 ”改良营养吸收及非生物胁迫耐受性
提供了极具潜力的靶标基因和思路。
（中国科学报）
作物种间和种内基因组呈现多层次不对称的进化规律。
该研究成果近日在线发表在国际权威学术期刊Ｎａｔｕｒｅ
ＰｈｙｓｉｃａｌｌｙＩｎｔｅｒａｃｔｗｉｔｈＰＩＬｌｔｏＲｅｇｕｌａｔｅＩｔｓ
甘蓝基因组测序是白菜、甘蓝和油菜等芸薹属全基因组测序项目的一部分，上述成果在中国农科院油料研究所和蔬菜花卉研究所、华大基因研究院的主导下，联合国内外多家科研机构共同完成。我国主要油料作物油菜（基因组命名为ＡＡＣＣ）、主要蔬菜作物白菜（基因组为ＡＡ）和甘蓝（基因组为ＣＣ）同属于芸薹属作物，而油菜是由白菜和甘蓝杂交后进化而来的。甘蓝和白菜共同祖先种的基因组含三份同源基因组（三倍化，称为亚基因组）。研究还发现，甘蓝基
ＳｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄＰｈｏｔｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ” 。该研究阐释了模式植物拟南芥ＰＩＬｌ蛋
白通过与光形态建成的关键负调控因子ＣＯＰ１以及红
从而愚弄鸟儿去吃它。
（中国科学报）

基于蛋白组学的甘蓝自交不亲和性相关新基因的克隆与功能探索

基于蛋白组学的甘蓝自交不亲和性相关新基因的克隆与功能探索显花植物的有性生殖过程是一个包括从花粉接触柱头到受精完成的连续的复杂的过程,能否成功授粉是其中至关重要的一步。

大多数雌雄同体植物进化出自交不亲和系统(Self-incompatibility,SI)来阻止自交、促进杂交、保持物种多样性。

根据遗传机制的不同,自交不亲和分为孢子体型自交不亲和(Sporophytic self-incompatibility,SSI)与配子体型自交不亲和(Gametophyticself-incompatibilty,GSI)。

芸薹属甘蓝由单一S位点基因控制自交不亲和反应,是典型的孢子体型自交不亲和植物,其自交不亲和信号传导途径是研究植物细胞间信号传导的模式系统。

蛋白质是生命活动的直接体现者,随着人类和各种生物基因组测序的完成,生物研究进入到后基因组时代,其中蛋白质组学是后基因组时代研究的重要手段之一。

蛋白质双向电泳(Two dimensional Electrophoresis,2-DE)技术由于能够同时在一张胶上分离几千甚至上万个蛋白质点,成为了蛋白质组学研究的主要支撑技术之一,质谱技术的发展又使其更广泛的应用于蛋白质组学研究。

酵母双杂交技术、pull-down等方法也为在体内、体外研究蛋白质相互作用提供了简单、高效、快捷的途径。

本文利用蛋白质双向电泳技术分离、鉴定SI 甘蓝自花、异花授粉不同时间点柱头差异表达蛋白质。

筛选出自花授粉特异表达和异花授粉上调表达蛋白质,分析它们在花器官、叶片等组织和授粉过程中m RNA表达量变化。

利用pull-down和质谱技术分离、鉴定了甘蓝柱头与SI相关新基因CML27相互作用的蛋白质;研究了SI相关基因SRBP1 RNA结合力;利用酵母双杂交技术检测了SI新因子Bo ROH1与Bo Exo70A1之间的相互作用,主要的工作与结果如下:甘蓝柱头差异表达蛋白质的分离与鉴定(1)SI甘蓝柱头差异表达蛋白质的分离与鉴定通过形态学观察和亲和指数测定两种方法鉴定了SI甘蓝A4自交不亲和性和与F1杂交亲和性。

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)千粒重性状遗传体系分析

千粒重分组 Grouping of 1 0002seed weight (g)
χ
214 - 216 216 - 218 218 - 310 310 - 312 312 - 314 314 - 316 316 - 318 318 - 410 410 - 412 412 - 414 414 - 416
Ξ基金项目 :江苏省自然科学基金资助项目 (BK99197) ;国家 863 资助项目 (2001AA241111) 。作者简介 :戚存扣 (1953 - ) ,男 ,江苏太州人 ,研究员 ,博士 ,主要从事油菜遗传育种研究。Tel :025284390372 ; E2mail :qck @jaas1ac1cn Received (收稿日期) :2003207231 ,Accepted (接受日期) :20032112251
(1 Institute of Industrial Crops , Jiangsu Academy of Agricultural Sciences , Nanjing 210014 , Jiangsu ;2 Key Laboratory of Germplasm and Breeding , Ministry of Agriculture , Nanjing Agricultural University , Nanjing 210095 , Jiangsu , China)
2 结果
211 6 个家系群体千粒重分布( 表 1) HSTC14 ( P13 ) 千粒重较低 ,平均为 3115 g ;宁油 7 号 ( P2 ) 千粒重较高 ,为 3176 g ,F1 杂种的平均为 3133 g ,低于中亲值。表明该组合千粒重无杂种优势。 B2∶2 家系群体千粒重呈单峰偏态分布 ,但 B1∶2 和 F2∶3 家系群体千粒重分布均呈多峰偏态。可能有主基因效应控制千粒重的表现。

甘蓝抽薹结实相关性状的基因定位与分析

甘蓝抽薹结实相关性状的基因定位与分析甘蓝抽薹结实相关性状的基因定位与分析摘要：甘蓝蔬菜作为重要的蔬菜类别之一，其抽薹结实性状的调控机制一直备受关注。

本研究以甘蓝抽薹结实性状为研究对象，通过基因定位与分析，深入探讨了该性状的遗传机制。

1. 引言甘蓝抽薹结实性状是指甘蓝蔬菜在不同生长阶段，特别是薹头形成阶段的结实能力。

这一性状的差异直接影响着甘蓝的产量和品质，因此对其遗传机制的研究具有重要意义。

2. 材料与方法本研究选取了一组甘蓝品种，包括抽薹结实能力较强的和较弱的两类。

通过遗传杂交和自交系选育，得到了一批F1代和F2代的个体。

利用分子标记技术对这些个体进行基因定位，确定与抽薹结实性状相关的候选基因。

同时，还对甘蓝抽薹结实性状进行了表型观察和统计分析。

3. 结果与分析通过分析F2代群体的遗传分离现象，发现甘蓝抽薹结实性状服从单基因控制的遗传规律。

在分子标记与性状的相关性分析中，发现了几个可能存在关联的基因位点。

进一步的功能验证实验表明，这些基因可能与甘蓝抽薹结实性状的表达调控有关。

4. 讨论甘蓝抽薹结实性状的遗传机制是复杂的，受多个基因的共同调控。

本研究通过基因定位与分析，初步揭示了其中的一些关键基因。

然而，还需要进一步的研究，以明确这些基因在甘蓝抽薹结实性状调控中的具体功能和作用机制。

5. 结论本研究通过基因定位与分析，初步揭示了甘蓝抽薹结实性状的一些相关基因。

这为进一步探索甘蓝蔬菜抽薹结实性状的遗传机制提供了一定的理论基础。

未来的研究可以通过基因克隆和功能验证等手段，深入研究抽薹结实性状的调控网络，并为甘蓝的栽培改良提供科学依据。

6.通过遗传杂交和自交系选育甘蓝品种，我们成功地得到了F1代和F2代的个体，并利用分子标记技术对其进行基因定位，以确定与抽薹结实性状相关的候选基因。

通过对F2代群体的遗传分离现象的分析，发现甘蓝抽薹结实性状服从单基因控制的遗传规律。

在分子标记与性状的相关性分析中，我们发现了几个可能存在关联的基因位点，并通过进一步的功能验证实验证明了这些基因可能与甘蓝抽薹结实性状的表达调控有关。

结球甘蓝CBF_家族特征分析及低温诱导基因BoCBF1、BoCBF2a_和BoCBF3_表达分析

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２４ꎬ４０(１):１５６￣１６４ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ张㊀伟ꎬ余方伟ꎬ李建斌ꎬ等.结球甘蓝ＣＢＦ家族特征分析及低温诱导基因ＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ和ＢｏＣＢＦ３表达分析[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２４ꎬ４０(１):１５６￣１６４.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２４.０１.０１７结球甘蓝ＣＢＦ家族特征分析及低温诱导基因ＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ和ＢｏＣＢＦ３表达分析张㊀伟ꎬ㊀余方伟ꎬ㊀李建斌ꎬ㊀于㊀利ꎬ㊀王神云(江苏省农业科学院蔬菜研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室ꎬ江苏南京２１００１４)收稿日期:２０２３￣０２￣０６基金项目:南京市科技计划项目(２０２１０９０２１)ꎻ江苏省重点研发计划项目(ＢＥ２０２１３７６)ꎻ江苏省种业振兴揭榜挂帅项目[ＪＢＧＳ(２０２１)０６７]ꎻ国家自然科学基金项目(３１９０２００９)ꎻ国家现代农业产业技术体系建设专项(ＣＡＲＳ￣２３￣Ｇ４２)作者简介:张㊀伟(１９８９－)ꎬ男ꎬ安徽安庆人ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ研究方向为甘蓝遗传育种与分子生物学ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈａｎｇｗｅｉ＠ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ通讯作者:王神云ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｗａｎｇｓｈｅｎｙｕｎ＠ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ㊀㊀摘要:㊀转录因子ＣＢＦ在植物对低温胁迫的响应和增强植物的抗寒性方面发挥着重要作用ꎮ为分析结球甘蓝ＣＢＦ家族成员的氨基酸序列特征ꎬ探究其是否受低温诱导表达ꎬ本研究利用结球甘蓝９２３全基因组数据库对其进行蛋白质理化特征㊁系统发育关系㊁编码基因结构以及２ħ低温胁迫下编码基因表达水平分析ꎮ结果表明ꎬ共鉴定到７个ＢｏＣＢＦ基因ꎬ系统发育分析后分成２个亚组(Ⅰ和Ⅱ)ꎮＢｏＣＢＦ蛋白的氨基酸长度为２０３~２８３ａａꎬ全部是亲水性蛋白质ꎮ在结球甘蓝０２－１２中ꎬＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ和ＢｏＣＢＦ３基因在叶㊁花㊁芽和角果中基本不表达ꎬ在愈伤组织㊁根和茎中表达量较低ꎮ转录组测序和实时荧光定量ＰＣＲ分析发现ꎬ在耐寒结球甘蓝９２３和不耐寒结球甘蓝Ｄ９中ꎬＢｏＣＢＦ２ｂ㊁ＢｏＣＢＦ２ｃ基因不受低温诱导表达ꎬＢｏＣＢＦ２ａ基因低温诱导表达最为迅速ꎬ其次是ＢｏＣＢＦ１和ＢｏＣＢＦ３基因ꎮＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ和ＢｏＣＢＦ３基因的相对表达量在低温胁迫３~６ｈ达到最大值ꎬ相对表达量达到最大值后急剧下降ꎬ在２４ｈ降至最低ꎮ本研究结果为后续开展ＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ和ＢｏＣＢＦ３基因调控结球甘蓝响应低温胁迫机理研究奠定了基础ꎮ关键词:㊀结球甘蓝ꎻＣＢＦ基因家族ꎻ低温胁迫ꎻ基因表达中图分类号:㊀Ｓ６３５㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２４)０１￣０１５６￣０９ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＣＢＦｆａｍｉｌｙｉｎｃａｂｂａｇｅａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｌｏｗ￣ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ￣ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓＢｏＣＢＦ１ꎬＢｏＣＢＦ２ａꎬａｎｄＢｏＣＢＦ３ＺＨＡＮＧＷｅｉꎬ㊀ＹＵＦａｎｇ￣ｗｅｉꎬ㊀ＬＩＪｉａｎ￣ｂｉｎꎬ㊀ＹＵＬｉꎬ㊀ＷＡＮＧＳｈｅｎ￣ｙｕｎ(ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｅｇｅｔａｂｌｅＣｒｏｐｓꎬＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＪｉａｎｇｓｕＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＣＢＦｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓａｎｄｅｎｈａｎｃｉｎｇｃｏｌｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｐｌａｎｔｓ.ＩｎｏｒｄｅｒｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＣＢＦｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒｓｉｎｃａｂｂａｇｅａｎｄｅｘ￣ｐｌｏｒｅｗｈｅｔｈｅｒｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｏＣＢＦｇｅｎｅｓｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅꎬｔｈｅｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｄａｔａｂａｓｅｏｆｃａｂｂａｇｅ９２３ｗａｓｕｓｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙＢｏＣＢＦｇｅｎｅｍｅｍｂｅｒｓａｎｄａｎａｌｙｚｅｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓꎬｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓꎬｇｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓꎬａｎｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｕｎｄｅｒ２ħｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔａｔｏｔａｌｏｆｓｅｖｅｎＢｏＣＢＦｇｅｎｅｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｎｄｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｗｏｓｕｂ￣ｇｒｏｕｐｓ(ⅠａｎｄⅡ)ａｆｔｅｒｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓ.ＴｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｌｅｎｇｔｈｏｆＢｏＣＢＦｐｒｏｔｅｉｎｓｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ２０３ａａｔｏ２８３ａａꎬａｌｌｏｆｗｈｉｃｈｗｅｒｅｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ.ＢｏＣＢＦ１ꎬＢｏＣＢＦ２ａꎬａｎｄＢｏＣＢＦ３ｇｅｎｅｓｗｅｒｅｎｏｔｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｌｅａｖ￣ｅｓꎬｆｌｏｗｅｒｓꎬｂｕｄｓａｎｄｓｉｌｉｑｕｅｓｏｆｃａｂｂａｇｅ０２￣１２ꎬａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｗｅｒｅｌｏｗｉｎｃａｌｌｕｓꎬｒｏｏｔｓａｎｄｓｔｅｍｓｏｆ６５１ｃａｂｂａｇｅ０２￣１２.Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｏＣＢＦ２ｂａｎｄＢｏＣＢＦ２ｃｇｅｎｅｓｗａｓｎｏｔｉｎｄｕｃｅｄｂｙｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｉｎｃｏｌｄ￣ｉｎｔｏｌｅｒａｎｔｃａｂｂａｇｅ９２３ａｎｄｃｏｌｄ￣ｉｎｔｏｌｅｒａｎｔｃａｂｂａｇｅＤ９ꎬｗｈｉｌｅＢｏＣＢＦ２ａｇｅｎｅｗａｓｍｏｓｔｒａｐｉｄｌｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅꎬｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙＢｏＣＢＦ１ａｎｄＢｏＣＢＦ３ｇｅｎｅｓ.ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＢｏＣＢＦ１ꎬＢｏＣＢＦ２ａꎬａｎｄＢｏＣＢＦ３ｇｅｎｅｓｒｅａｃｈｅｄｔｈｅｍａｘｉｍｕｍａｔ３－６ｈａｆｔｅｒｌｏｗｔｅｍｐｅｒａ￣ｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｈａｒｐｌｙａｆｔｅｒｒｅａｃｈｉｎｇｔｈｅｍａｘｉｍｕｍꎬａｎｄｒｅａｃｈｅｄｔｈｅｌｏｗｅｓｔａｔ２４ｈ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｕｄｙｐｒｏｖｉｄｅａｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＢｏＣＢＦ１ꎬＢｏＣＢＦ２ａａｎｄＢｏＣＢＦ３ｇｅｎｅｓｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓｉｎｃａｂｂａｇｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｃａｂｂａｇｅꎻＣＢＦｇｅｎｅｆａｍｉｌｙꎻｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓꎻｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ㊀㊀结球甘蓝(Ｂｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａｖａｒ.ｃａｐｉｔａｔａＬ.)ꎬ是十字花科芸薹属蔬菜ꎬ可形成叶球ꎬ含有丰富的维生素Ｃ和矿物质ꎬ营养极为丰富ꎮ甘蓝常被烹食或者生食ꎬ是追求健康饮食人群喜爱的食物之一ꎻ由于其具有较强的适应性和抗逆性ꎬ全国各地均有种植ꎬ年种植面积约９ˑ１０５ｈｍ２[１]ꎬ是中国重要的保障供应蔬菜之一ꎮ低温是影响作物产量和营养品质的一种非生物胁迫[２]ꎮ结球甘蓝喜温和冷凉气候ꎬ种子发芽适宜温度为２０~２５ħꎬ结球期适宜温度为１５~２０ħꎮ结球甘蓝的适应能力较强ꎬ但过低的温度仍然会减缓其生长速度ꎬ降低营养品质ꎻ特别是在１~４ħ低温条件下ꎬ植株很容易通过春化作用发生先期抽薹 [３]ꎻ０ħ以下的冻害温度会导致幼苗或叶球冻伤或是直接冻死ꎬ严重影响产量[４￣５]ꎮ结球甘蓝植株不同生长时期的耐寒性也不同ꎬ具有６~８片叶的幼苗其耐寒性比较强ꎬ能忍耐－５~－２ħ的低温冻害ꎻ经过低温驯化的幼苗ꎬ能忍耐短期－１２~－８ħ的低温严寒ꎻ成熟期的叶球耐寒性虽不如幼苗时期ꎬ但早熟品种的叶球能忍耐短期－５~－３ħ的低温ꎬ中㊁晚熟品种的叶球能忍耐短期－８~－５ħ的低温[６]ꎮ低温信号途径是依赖于ＣＢＦ(Ｃ￣ｒｅｐｅａｔｂｉｎｄｉｎｇｆａｃｔｏｒ)转录因子的ＩＣＥ１￣ＣＢＦ￣ＣＯＲ信号转导途径ꎮ在低温胁迫下ꎬＩＣＥ１转录因子可直接与３个低温响应基因(ＣＢＦ１㊁ＣＢＦ２㊁ＣＢＦ３)基因启动子区域结合[７]ꎬ被激活的ＣＢＦ转录因子与冷诱导基因(ＣＯＲ)启动子区域ＣＲＴ/ＤＲＥ元件结合ꎬ诱导ＣＯＲ基因的转录ꎬ使其迅速响应低温胁迫ꎬ从而提高植株的耐冷性[８]ꎮＡｔＣＢＦ１㊁ＡｔＣＢＦ２和ＡｔＣＢＦ３基因在拟南芥４号染色体上串联排列ꎬ不依赖ＡＢＡ信号转导ꎬ受低温胁迫诱导表达ꎬ在响应低温胁迫的基因调控中发挥重要作用[９￣１０]ꎮ而ＡｔＣＢＦ４与ＡｔＣＢＦ１㊁ＡｔＣＢＦ２㊁ＡｔＣＢＦ３成员的基因功能不同ꎬ依赖ＡＢＡ信号转导ꎬ不受低温胁迫诱导表达ꎬ但在抗旱过程中发挥一定的作用[１１]ꎮ有研究结果表明过量表达ＡｔＣＢＦ１㊁ＡｔＣＢＦ２和ＡｔＣＢＦ３基因能大幅提高拟南芥植株的抗冻性ꎬ其下游大量的ＣＯＲ基因被诱导表达[９￣１０]ꎮ与野生型拟南芥相比ꎬｃｂｆ１/ｃｂｆ２/ｃｂｆ３３突变体在冷驯化后表现出强烈的冻敏感表型ꎬ且ＡｔＣＢＦ基因的突变影响了拟南芥全转录组中１０％~２０％的ＣＯＲ基因表达[１２￣１３]ꎮ此外ꎬ在油菜㊁番茄㊁大麦㊁玉米及水稻等作物中也发现ＣＢＦ基因具有冷诱导表达特征[１４￣１８]ꎮ单子叶植物和双子叶植物的ＣＢＦ基因均与低温胁迫响应密切相关ꎬ说明植物中ＣＢＦ基因在低温信号途径中发挥的作用相对保守ꎮ本研究为了探索与拟南芥同为十字花科的结球甘蓝作物中ＣＢＦ基因是否也存在冷诱导特性ꎬ对结球甘蓝全基因组中ＣＢＦ家族成员进行鉴定ꎬ并分析其编码的蛋白特征㊁基因结构㊁系统发育㊁不同器官/组织表达量以及２ħ低温胁迫下的基因表达模式等ꎬ挑选出候选低温诱导基因ꎬ为进一步开展ＢｏＣＢＦ基因响应低温胁迫的研究提供参考ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀结球甘蓝ＣＢＦ家族成员鉴定拟南芥ＡｔＣＢＦ蛋白氨基酸序列(ＡｔＣＢＦ１￣ＡＴ４Ｇ２５４９０㊁ＡｔＣＢＦ２￣ＡＴ４Ｇ２５４７０㊁ＡｔＣＢＦ３￣ＡＴ４Ｇ２５４８０㊁ＡｔＣＢＦ４￣ＡＴ５Ｇ５１９９０)从ＮＣＢＩ数据库获取ꎮ结球甘蓝和大白菜全基因组序列分别参考结球甘蓝９２３[１９]和大白菜Ｃｈｉｉｆｕ￣４０１￣４２Ｖ３.０[２０]基因组ꎮ将ＡｔＣＢＦ蛋白氨基酸序列用ＢＬＡＳＴＰ分别搜索结球甘蓝和大白菜全基因组序列ꎬ获取候选结球甘蓝ＢｏＣＢＦ和大白菜ＢｒＣＢＦ蛋白氨基酸序列ꎮ利用Ｐｆａｍ３５.０和ＳＭＡＲＴ数据库分析候选ＢｏＣＢＦ和ＢｒＣＢＦ蛋白的保守结构域ꎬ剔除不含ＡＰ２(ＰＦ００８４７)结构域的候选蛋白质ꎬ确定ＢｏＣＢＦ和ＢｒＣＢＦ家族成员ꎮ１.２㊀ＢｏＣＢＦ蛋白理化特征及系统发育分析采用ＰｒｏｔＰａｒａｍ工具分析ＢｏＣＢＦ蛋白的理化特７５１张㊀伟等:结球甘蓝ＣＢＦ家族特征分析及低温诱导基因ＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ和ＢｏＣＢＦ３表达分析征ꎬ包括氨基酸序列长度㊁相对分子质量㊁理论等电点㊁不稳定指数㊁脂肪族氨基酸指数和总平均亲水性等特征ꎮ采用ＭＥＧＡｖ７.０.２６软件对ＢｏＣＢＦ㊁ＢｒＣＢＦ和ＡｔＣＢＦ蛋白氨基酸序列进行聚类分析ꎬ选择最大似然法(Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值设定为１０００)绘制系统发育树ꎮ１.３㊀ＢｏＣＢＦ基因结构㊁物理位置及亚细胞定位预测分析㊀㊀在结球甘蓝９２３全基因组数据库中分别获取ＢｏＣＢＦ基因的ｇＤＮＡ和ＣＤＳ序列ꎬ利用在线工具ＧＳＤＳ２.０(ｈｔｔｐ://ｇｓｄｓ.ｇａｏ￣ｌａｂ.ｏｒｇ/)绘制外显子￣内含子结构图ꎮ根据ＢｏＣＢＦ基因的物理位置ꎬ使用ＭａｐＣｈａｒｔｖ２.３软件绘制ＢｏＣＢＦ基因染色体位置图ꎮ采用在线软件ＢａＣｅｌＬｏ和Ｐｌａｎｔ￣ｍＰＬｏｃ[２１￣２２]对ＢｏＣＢＦ蛋白的亚细胞定位进行预测ꎮ１.４㊀ＣＢＦ基因进化约束值分析和基因组加倍事件发生时间估计㊀㊀通过ＤｎａＳＰｖ６软件[２３]计算结球甘蓝和拟南芥ＣＢＦ基因之间的进化约束值(非同义替换率Ｋａ/同义替换率Ｋｓ)ꎮ非同义替换率计算公式为非同义替换的ＳＮＰ数/非同义替换位点数ꎬ同义替换率计算公式为同义替换的ＳＮＰ数/同义替换位点数ꎮ利用同义替换率来估算结球甘蓝和拟南芥之间全基因组加倍事件发生的时间ꎮ估算公式为加倍事件发生时间(Ｔ)＝Ｋｓ/２λ[拟南芥每年每个同义替换位点发生替换的速率(λ)为１.５ˑ１０－８][２４]ꎮ１.５㊀不同器官/组织及低温胁迫下ＢｏＣＢＦ基因表达量分析㊀㊀选取耐寒结球甘蓝９２３和不耐寒结球甘蓝Ｄ９为试验材料ꎬ将其种子播种在３２孔穴盘中ꎬ放进人工气候室中正常管理ꎬ环境条件设置:白天温度为２５ħꎬ光照时间１４ｈꎬ夜晚温度为１８ħꎮ待结球甘蓝长至五叶一心ꎬ转移至春化室进行２ħ低温胁迫ꎬ处理不同时间(０ｈ㊁３ｈ㊁６ｈ㊁１２ｈ㊁２４ｈ)后进行取样ꎬ将叶片放入锡箔纸并立即于液氮中冷冻ꎬ在－８０ħ冰箱中保存备用ꎮ选择低温胁迫处理０ｈ㊁６ｈ㊁２４ｈ的叶片样品送广州基奥迪生物科技有限公司进行转录组测序ꎮ此外ꎬ从ＮＣＢＩ的ＧＥＯ数据库下载了结球甘蓝０２￣１２正常生长条件下７个不同器官/组织(芽㊁愈伤组织㊁花㊁叶㊁根㊁角果和茎)的转录组数据(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ｇｅｏ/ｑｕｅｒｙ/ａｃｃ.ｃｇｉ?ａｃｃ＝ＧＳＥ４２８９１ꎬＧＳＥ４２８９１数据集)用于ＢｏＣＢＦ基因不同器官/组织的表达量分析ꎮ以结球甘蓝９２３基因组作为转录组分析的参考基因组ꎬ以ＦＰＫＭ值来表示结球甘蓝ＢｏＣＢＦ基因在不同器官/组织及低温胁迫下的表达量ꎬ利用Ｅｘｃｅｌ软件计算平均值和标准差ꎬ绘制柱形图ꎮ１.６㊀ＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ和ＢｏＣＢＦ３基因相对表达水平分析㊀㊀将上述保存的低温处理０ｈ㊁３ｈ㊁６ｈ㊁１２ｈ㊁２４ｈ的叶片样品分别提取植物总ＲＮＡꎬ并合成第一链ｃＤＮＡꎮ参照结球甘蓝９２３基因组[１９]序列ꎬ利用ＢｅａｃｏｎＤｅｓｉｇｎｅｒ７.７软件分别设计ＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ㊁ＢｏＣＢＦ３基因和内参基因ＢｏＡｃｔｉｎ２的特异引物序列(表１)ꎮ利用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ染料法在罗氏荧光定量ＰＣＲ仪器上进行ＰＣＲ反应ꎬ试验采取３次技术重复ꎬ通过２－әәＣｔ计算方法计算基因的相对表达水平和标准差[２５]ꎮ表１㊀实时荧光定量ＰＣＲ引物Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｆｏｒｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ基因名称㊀㊀正向引物序列(５ᶄң３ᶄ)㊀㊀㊀㊀㊀反向引物序列(５ᶄң３ᶄ)㊀㊀㊀㊀㊀ＢｏＣＢＦ１ＧＡＴＴＴＧＧＣＴＣＧＧＴＡＣＴＴＴＣＣＴＴＣＡＧＣＣＡＴＡＣＴＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＢｏＣＢＦ２ａＣＧＡＧＧＡＧＴＴＣＧＣＣＴＴＡＧＡＡＡＡＴＣＧＴＧＴＣＡＴＴＡＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＧＢｏＣＢＦ３ＴＡＣＧＧＡＴＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＡＧＣＣＡＴＡＴＣＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＢｏＡｃｔｉｎ２ＣＣＡＧＡＧＧＴＣＴＴＧＴＴＣＣＡＧＣＣＡＴＣＧＴＴＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＡＡＴＧＴＴＡＣ２㊀结果与分析２.１㊀结球甘蓝ＣＢＦ家族成员鉴定㊁理化特征及系统发育分析㊀㊀通过对结球甘蓝和大白菜全基因组数据库ＢＬＡＳＴＰ搜索以及ＡＰ２保守结构域的在线验证ꎬ分别鉴定到７个ＢｏＣＢＦ蛋白和６个ＢｒＣＢＦ蛋白(表２)ꎮＢｏＣＢＦ蛋白的氨基酸序列长度为２０３~２８３ａａꎬ相对分子质量为２.２５ˑ１０４~３.１１ˑ１０４ꎮＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ㊁ＢｏＣＢＦ２ｃ㊁ＢｏＣＢＦ３㊁ＢｏＣＢＦ４ａ㊁ＢｏＣＢＦ４ｂ理８５１江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期论等电点为４.５８~６１４ꎬ为弱酸性蛋白质ꎻＢｏＣＢＦ２ｂ理论等电点为７６３ꎬ为弱碱性蛋白质ꎮ蛋白质的不稳定指数为４５７８~６８３２ꎬ均超过临界值４０ꎮ此外ꎬＢｏＣＢＦ蛋白的脂肪族氨基酸指数为５６７８~７３２０ꎬ总平均亲水性指数为－０５９８~－０３１４ꎬ均为亲水性蛋白质ꎮ表２㊀结球甘蓝ＣＢＦ家族成员理化特征Ｔａｂｌｅ２㊀ＰｈｙｓｉｃａｌａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＣＢＦｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒｓｉｎｃａｂｂａｇｅＣＢＦ家族结球甘蓝ＣＢＦ基因结球甘蓝ＣＢＦ蛋白基因编号㊀所在染色体开放阅读框长度(ｂｐ)氨基酸长度(ａａ)相对分子质量理论等电点不稳定指数脂肪族氨基酸指数总平均亲水性指数ＢｏＣＢＦ１ＢｏｌＯ＿８ｇ１６５９０.１染色体８７５３２５０２.７９ˑ１０４４.８５４７.９９６０.２０－０.５０４ＢｏＣＢＦ２ａＢｏｌＯ＿７ｇ５６３７０.１染色体７６１２２０３２.２５ˑ１０４５.８９４９.７３７３.２０－０.３１４ＢｏＣＢＦ２ｂＢｏｌＯ＿３ｇ１９１００.１染色体３８５２２８３３.１１ˑ１０４７.６３４９.３６６６.６４－０.４１２ＢｏＣＢＦ２ｃＢｏｌＯ＿３ｇ１９０８０.１染色体３６１５２０４２.２６ˑ１０４５.７９４７.７９６５.６９－０.３９０ＢｏＣＢＦ３ＢｏｌＯ＿８ｇ１６６１０.１染色体８８３４２７７３.０５ˑ１０４４.５８４５.７８６０.６９－０.４８０ＢｏＣＢＦ４ａＢｏｌＯ＿９ｇ４０７００.１染色体９６６３２２０２.４５ˑ１０４６.１４６１.６０６０.４１－０.５１５ＢｏＣＢＦ４ｂＢｏｌＯ＿９ｇ４０７３０.１染色体９７１１２３６２.５３ˑ１０４５.３２６８.３２５６.７８－０.５９８㊀㊀采用ＭＥＧＡｖ７.０.２６软件对结球甘蓝㊁大白菜和拟南芥１７个ＣＢＦ蛋白氨基酸序列构建系统发育树(图１)ꎮＣＢＦ蛋白被分成２个亚组ꎬ亚组Ⅰ包含１２个ＣＢＦ蛋白ꎬ亚组Ⅱ包含５个ＣＢＦ蛋白ꎮ其中亚组Ⅰ包括５个结球甘蓝ＣＢＦ蛋白(ＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ㊁ＢｏＣＢＦ２ｂ㊁ＢｏＣＢＦ２ｃ和ＢｏＣＢＦ３)ꎬ４个大白菜ＣＢＦ蛋白和３个拟南芥ＣＢＦ蛋白ꎮ亚组Ⅱ包括２个结球甘蓝ＣＢＦ蛋白(ＢｏＣＢＦ４ａ和ＢｏＣＢＦ４ｂ)ꎬ２个大白菜ＣＢＦ蛋白和１个拟南芥ＣＢＦ蛋白ꎮ相比拟南芥ＣＢＦ家族成员ꎬ结球甘蓝和大白菜ＣＢＦ家族成员之间的亲缘关系更近ꎮ图１㊀结球甘蓝㊁大白菜和拟南芥ＣＢＦ蛋白系统发育分析Ｆｉｇ.１㊀ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＣＢＦｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｃａｂｂａｇｅꎬＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅａｎｄＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ２.２㊀ＢｏＣＢＦ基因结构㊁物理位置及其编码蛋白质的亚细胞定位预测分析㊀㊀ＢｏＣＢＦ２ｂ基因包含３个外显子和２个内含子ꎬＢｏＣＢＦ２ｃ基因包含２个外显子和１个内含子ꎬＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ㊁ＢｏＣＢＦ３㊁ＢｏＣＢＦ４ａ和ＢｏＣＢＦ４ｂ均只有１个外显子ꎬ没有内含子(图２)ꎮ此外ꎬ本研究还分析了７个ＢｏＣＢＦ基因在结球甘蓝染色体上的物理位置分布ꎬ其中ＢｏＣＢＦ２ｂ和ＢｏＣＢＦ２ｃ串联分９５１张㊀伟等:结球甘蓝ＣＢＦ家族特征分析及低温诱导基因ＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ和ＢｏＣＢＦ３表达分析布在３号染色体上ꎬＢｏＣＢＦ２ａ位于７号染色体上ꎬＢｏＣＢＦ１和ＢｏＣＢＦ３串联分布在８号染色体上ꎬＢｏＣＢＦ４ａ和ＢｏＣＢＦ４ｂ串联分布在９号染色体上(图３)ꎮ㊀㊀为了预测ＢｏＣＢＦ蛋白亚细胞定位信息ꎬ分别利用ＢａＣｅｌＬｏ和Ｐｌａｎｔ￣ｍＰＬｏｃ工具在线进行预测(表３)ꎮ结果表明ꎬ结球甘蓝ＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ㊁ＢｏＣＢＦ２ｂ㊁ＢｏＣＢＦ２ｃ㊁ＢｏＣＢＦ３和ＢｏＣＢＦ４ａ蛋白均被预测定位于细胞核中ꎬＢｏＣＢＦ４ｂ被预测可能定位在细胞质或细胞核中ꎮ图２㊀ＢｏＣＢＦ基因外显子￣内含子结构图Ｆｉｇ.２㊀Ｔｈｅｅｘｏｎ￣ｉｎｔｒｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＢｏＣＢＦｇｅｎｅｓ图３㊀ＢｏＣＢＦ基因在染色体上的物理位置分布Ｆｉｇ.３㊀ＰｈｙｓｉｃａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＢｏＣＢＦｇｅｎｅｓｏｎｔｈｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ表３㊀ＢｏＣＢＦ蛋白亚细胞定位预测Ｔａｂｌｅ３㊀ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＢｏＣＢＦｐｒｏｔｅｉｎｓ蛋白质ＢａＣｅｌＬｏ亚细胞定位预测Ｐｌａｎｔ￣ｍＰＬｏｃ亚细胞定位预测ＢｏＣＢＦ１细胞核细胞核ＢｏＣＢＦ２ａ细胞核细胞核ＢｏＣＢＦ２ｂ细胞核细胞核ＢｏＣＢＦ２ｃ细胞核细胞核ＢｏＣＢＦ３细胞核细胞核ＢｏＣＢＦ４ａ细胞核细胞核ＢｏＣＢＦ４ｂ细胞质细胞质㊁细胞核２.３㊀ＣＢＦ基因进化约束值分析和基因组加倍事件发生时间估计㊀㊀除ＡｔＣＢＦ４与ＢｏＣＢＦ４ｂ同源基因对外ꎬ其余６个ＣＢＦ直系同源基因对的进化约束值(Ｋａ/Ｋｓ)均远小于１(０.１５６~０２９４)ꎬ表明进化中ＣＢＦ基因以纯化选择作用为主(表４)ꎮ在结球甘蓝和拟南芥的直系同源基因对中ꎬ同义替换率为０.４９０~０８１５ꎮ以拟南芥每年每个同义替换位点发生替换的速率(λ)为参考ꎬ利用结球甘蓝和拟南芥的直系同源基因对的同义替换率(Ｋｓ)估算ꎬ结球甘蓝和拟南芥之间全基因组加倍事件发生的时间大致发生在１.６３ˑ１０７~０６１江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期２.７２ˑ１０７年前ꎮ由表４可知ꎬ相比同源基因ＡｔＣＢＦ２ꎬＢｏＣＢＦ２ａ㊁ＢｏＣＢＦ２ｂ㊁ＢｏＣＢＦ２ｃ基因可能发生了全基因组三倍化事件(ＷＧＴ)ꎬ且它们的发生时间为１.６３ˑ１０７~１.９７ˑ１０７年前ꎬ这与芸薹族物种与拟南芥进行分化后经历了一次额外的全基因组三倍化事件的时间(１.３０ˑ１０７~１.７０ˑ１０７年前)相符合[２６]ꎮ表４㊀结球甘蓝和拟南芥ＣＢＦ基因进化约束值及基因组加倍事件发生时间预测Ｔａｂｌｅ４㊀ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｖａｌｕｅｓａｎｄｔｈｅｔｉｍｅｏｆｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｅｖｅｎｔｓｂｅｔｗｅｅｎｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓＣＢＦｇｅｎｅｐａｉｒｓｏｆｃａｂｂａｇｅａｎｄＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ直系同源基因对同义替换率非同义替换率进化约束值加倍事件发生时间(年)ＡｔＣＢＦ１ＢｏＣＢＦ１０.６８５０.１０７０.１５６２.２８ˑ１０７ＡｔＣＢＦ２ＢｏＣＢＦ２ａ０.５９２０.１４００.２３７１.９７ˑ１０７ＢｏＣＢＦ２ｂ０.５６６０.１６２０.２８６１.８９ˑ１０７ＢｏＣＢＦ２ｃ０.４９００.１４４０.２９４１.６３ˑ１０７ＡｔＣＢＦ３ＢｏＣＢＦ３０.８１５０.１４８０.１８２２.７２ˑ１０７ＡｔＣＢＦ４ＢｏＣＢＦ４ａ０.６３２０.１０５０.１６６２.１１ˑ１０７ＢｏＣＢＦ４ｂ－０.６１３－－２.４㊀结球甘蓝不同器官/组织及低温胁迫下ＢｏＣＢＦ基因表达量分析㊀㊀本研究分析了５个ＢｏＣＢＦ基因在结球甘蓝７个不同器官/组织中的表达量(图４)ꎮ其中ＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ和ＢｏＣＢＦ３基因在甘蓝多个器官/组织中基本不表达(ＦＰＫＭ<１)ꎬ仅在愈伤组织㊁根和茎中有较低的表达量ꎮＢｏＣＢＦ４ａ基因仅在愈伤组织㊁根和茎中有中等表达量ꎬＢｏＣＢＦ４ｂ基因在茎中表达量中等ꎬ在根中表达量较高ꎮ图４㊀转录组测序分析结球甘蓝０２￣１２不同器官/组织中ＢｏＣＢＦ基因表达量Ｆｉｇ.４㊀ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｏＣＢＦｇｅｎｅｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｒｇａｎｓ/ｔｉｓｓｕｅｓｏｆｃａｂｂａｇｅ０２￣１２ａｎａｌｙｚｅｄｂｙｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ㊀㊀本研究还分析了５个ＢｏＣＢＦ基因在低温胁迫下的表达模式(图５)ꎬ耐寒结球甘蓝９２３和不耐寒结球甘蓝Ｄ９中ＢｏＣＢＦ２ｂ和ＢｏＣＢＦ２ｃ基因的表达量均为０ꎮ在未进行低温处理时(０ｈ)ꎬＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ和ＢｏＣＢＦ３基因在耐寒结球甘蓝９２３和不耐寒结球甘蓝Ｄ９中的表达量几乎为０ꎬＢｏＣＢＦ４ａ和１６１张㊀伟等:结球甘蓝ＣＢＦ家族特征分析及低温诱导基因ＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ和ＢｏＣＢＦ３表达分析ＢｏＣＢＦ４ｂ基因表达量较低ꎮ低温胁迫处理０~６ｈꎬＢｏＣＢＦ１和ＢｏＣＢＦ２ａ基因迅速响应ꎬ表达量上升ꎬ其中不耐寒结球甘蓝Ｄ９中ＢｏＣＢＦ２ａ基因表达量急剧升高ꎻ低温胁迫６ｈ后至２４ｈꎬ耐寒结球甘蓝９２３和不耐寒结球甘蓝Ｄ９中ＢｏＣＢＦ１和ＢｏＣＢＦ２ａ基因的表达量急剧下降ꎮ此外ꎬ低温胁迫０~２４ｈꎬ耐寒结球甘蓝９２３中ＢｏＣＢＦ４ａ和ＢｏＣＢＦ４ｂ基因表达量基本没有变化ꎬ说明ＢｏＣＢＦ４ａ和ＢｏＣＢＦ４ｂ基因不受低温诱导表达ꎮ不耐寒结球甘蓝Ｄ９中ＢｏＣＢＦ４ａ和ＢｏＣＢＦ４ｂ基因表达量在低温胁迫０~６ｈ下降ꎬ在低温胁迫６ｈ后至２４ｈ表达量急剧上升ꎮ㊀㊀根据前期拟南芥响应低温信号途径的研究结果[２７]ꎬ可知拟南芥中响应低温胁迫的ＡｔＣＢＦ基因家族成员主要为ＡｔＣＢＦ１㊁ＡｔＣＢＦ２和ＡｔＣＢＦ３ꎬ且基因快速响应的时间为低温胁迫０~３ｈꎮ结合图５的分析结果ꎬ本研究选取ＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ和ＢｏＣＢＦ３基因ꎬ通过实时荧光定量ＰＣＲ分析两个不同耐寒性结球甘蓝品种在低温胁迫０ｈ㊁３ｈ㊁６ｈ㊁１２ｈ和２４ｈ后这３个基因的相对表达量ꎮ如图６所示ꎬ不耐寒结球甘蓝Ｄ９中ＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ和ＢｏＣＢＦ３基因的相对表达量在低温胁迫３ｈ达到最大值ꎻ耐寒结球甘蓝９２３中ＢｏＣＢＦ２ａ和ＢｏＣＢＦ３基因的相对表达量在低温胁迫３ｈ达到最大值ꎬＢｏＣＢＦ１基因相对表达量在低温胁迫６ｈ达到最大ꎮＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２和ＢｏＣＢＦ３基因的相对表达量达到峰值后急剧下降ꎬ在２４ｈ降至最低ꎮ图５㊀转录组测序分析ＢｏＣＢＦ基因在２ħ低温胁迫下的表达量Ｆｉｇ.５㊀ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｏＣＢＦｇｅｎｅｓｕｎｄｅｒ２ħｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ３㊀讨论低温对结球甘蓝栽培有较大影响ꎬ产量及品质均受到严重影响ꎮ依赖于ＣＢＦ(Ｃ￣ｒｅｐｅａｔｂｉｎｄｉｎｇｆａｃ￣ｔｏｒ)转录因子的ＩＣＥ１￣ＣＢＦ￣ＣＯＲ信号转导途径是植物响应低温胁迫信号的重要途径之一[７￣８]ꎮ此外ꎬ拟南芥㊁大麦㊁玉米㊁水稻㊁小麦㊁葡萄和番茄等作物ＣＢＦ基因的功能已经被广泛研究[１０ꎬ１６￣１８ꎬ２８￣３０]ꎮ本研究探究了与拟南芥同属十字花科的结球甘蓝ＢｏＣＢＦ基因的低温诱导特性ꎬ对进一步解析ＢｏＣＢＦ基因响应低温胁迫具有重要的意义ꎮＡｔＣＢＦ１㊁ＡｔＣＢＦ２和ＡｔＣＢＦ３基因串联排列在拟南芥４号染色体上ꎮ在结球甘蓝中ꎬ仅ＢｏＣＢＦ１和ＢｏＣＢＦ３串联排列在８号染色体上ꎬＢｏＣＢＦ２ａ位于７号染色体ꎬＢｏＣＢＦ２ｂ和ＢｏＣＢＦ２ｃ串联分布在３号染色体上ꎮ推测结球甘蓝中与拟南芥ＡｔＣＢＦ２同源的ＢｏＣＢＦ２基因发生了基因复制或丢失现象ꎬ导致加倍后的ＢｏＣＢＦ２ａ㊁ＢｏＣＢＦ２ｂ㊁ＢｏＣＢＦ２ｃ基因与ＢｏＣＢＦ１和ＢｏＣＢＦ３不在同一条染色体上ꎮ此外ꎬ研究发现除ＢｏＣＢＦ２ｂ和ＢｏＣＢＦ２ｃ含有内含子序列外ꎬ其他２６１江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期图６㊀实时荧光定量ＰＣＲ分析２ħ低温胁迫下ＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ和ＢｏＣＢＦ３基因相对表达水平Ｆｉｇ.６㊀ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＢｏＣＢＦ１ꎬＢｏＣＢＦ２ａꎬａｎｄＢｏＣＢＦ３ｕｎｄｅｒ２ħｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓ￣ｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲＢｏＣＢＦ基因与拟南芥ＡｔＣＢＦ基因结构一致ꎬ均无内含子结构ꎬ表明ＣＢＦ基因在植物进化过程中具有较高的保守性ꎮ与ＢｏＣＢＦ２ａ基因结构相比ꎬ发生全基因组三倍化事件后形成的ＢｏＣＢＦ２ｂ和ＢｏＣＢＦ２ｃ基因结构在进化过程中发生了变异ꎬ出现了较长的内含子序列ꎬ导致其基因功能也随之发生了变化ꎮ拟南芥中ＡｔＣＢＦ１㊁ＡｔＣＢＦ２和ＡｔＣＢＦ３基因不依赖ＡＢＡ信号转导ꎬ受低温胁迫诱导表达ꎬ是低温诱导的关键基因[７￣８]ꎮ本研究发现结球甘蓝９２３和Ｄ９中ＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ㊁ＢｏＣＢＦ３㊁ＢｏＣＢＦ４ａ和ＢｏＣＢＦ４ｂ基因受低温胁迫诱导表达ꎬ而结球甘蓝９２３和Ｄ９中ＢｏＣＢＦ２ｂ㊁ＢｏＣＢＦ２ｃ被发现不受低温胁迫诱导表达ꎮ其中ꎬ结球甘蓝Ｄ９中ＢｏＣＢＦ４ａ和ＢｏＣＢＦ４ｂ基因在低温处理６ｈ后至２４ｈ时表达量上升ꎬ可能是由于受到节律调节或者光调控的影响ꎮ结合转录组测序和实时荧光定量ＰＣＲ分析发现ꎬ耐寒结球甘蓝９２３和不耐寒结球甘蓝Ｄ９中ＢｏＣＢＦ２ａ基因响应低温胁迫诱导最为迅速ꎬ其次是ＢｏＣＢＦ１和ＢｏＣＢＦ３ꎮ本研究还发现在耐寒结球甘蓝９２３和不耐寒结球甘蓝Ｄ９中ＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ和ＢｏＣＢＦ３基因受低温胁迫诱导后基因相对表达量变化趋势均为先上升后下降ꎬ仅表达水平出现高低的差异ꎮ综上所述ꎬ本研究结果为后续开展ＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ和ＢｏＣＢＦ３基因调控结球甘蓝响应低温胁迫机理研究奠定了基础ꎮ参考文献:[１]㊀杨丽梅ꎬ方智远ꎬ庄㊀木ꎬ等. 十二五我国甘蓝遗传育种研究进展[Ｊ].中国蔬菜ꎬ２０１６(１１):１￣６.[２]㊀ＣＨＩＮＮＵＳＡＭＹＶꎬＺＨＵＪꎬＺＨＵＪＫ.Ｃｏｌｄｓｔｒｅｓｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２００７ꎬ１２(１０):４４４￣４５１.[３]㊀徐㊀磊ꎬ林碧英ꎬ林义章.春化作用与甘蓝类蔬菜的生育障碍(综述)[Ｊ].亚热带植物科学ꎬ２００２ꎬ３１(４):７３￣７６. [４]㊀张㊀伟ꎬ余方伟ꎬ李建斌ꎬ等.甘蓝蔗糖合成酶基因家族鉴定及响应低温胁迫表达模式分析[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２０２１ꎬ４９(２):２４￣３２.[５]㊀山㊀溪ꎬ秦文斌ꎬ张振超ꎬ等.低温对结球甘蓝幼叶氮代谢活性及光合色素的影响[Ｊ].南方农业学报ꎬ２０１９ꎬ５０(１２):２７２８￣２７３３.[６]㊀蔡㊀青ꎬ李成琼ꎬ司㊀军.结球甘蓝耐寒性研究进展[Ｊ].长江蔬菜ꎬ２００９(２):１￣３.[７]㊀ＴＡＮＧＫꎬＺＨＡＯＬꎬＲＥＮＹꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＩＣＥ１ｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｃｏｌｄｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｂｙｂｉｎｄｉｎｇｔｏｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓｏｆＣＢＦａｎｄＣＯＲｇｅｎｅｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０２０ꎬ６２(３):２５８￣２６３.[８]㊀ＤＩＮＧＹꎬＳＨＩＹꎬＹＡＮＧＳ.Ａｄｖａｎｃｅｓａｎｄｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｉｎｕｎｃｏｖｅ￣ｒｉｎｇｃｏｌｄｔｏｌｅｒａｎｃｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙ￣ｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２０１９ꎬ２２２(４):１６９０￣１７０４.[９]㊀ＧＩＬＭＯＵＲＳＪꎬＺＡＲＫＡＤＧꎬＳＴＯＣＫＩＮＧＥＲＥＪꎬｅｔａｌ.Ｌｏｗｔｅｍ￣ｐｅｒａｔｕｒｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＣＢＦｆａｍｉｌｙｏｆＡＰ２ｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣ｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｏｒｓａｓａｎｅａｒｌｙｓｔｅｐｉｎｃｏｌｄ￣ｉｎｄｕｃｅｄＣＯＲｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓ￣ｓｉｏｎ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ１９９８ꎬ１６(４):４３３￣４４２.[１０]ＬＩＵＱꎬＫＡＳＵＧＡＭꎬＳＡＫＵＭＡＹꎬｅｔａｌ.Ｔｗｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃ￣ｔｏｒｓꎬＤＲＥＢ１ａｎｄＤＲＥＢ２ꎬｗｉｔｈａｎＥＲＥＢＰ/ＡＰ２ＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏ￣ｍａｉｎｓｅｐａｒａｔｅｔｗｏｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｐａｔｈｗａｙｓｉｎｄｒｏｕｇｈｔ￣ａｎｄｌｏｗ￣ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ１９９８ꎬ１０(８):１３９１￣１４０６. [１１]ＨＡＡＫＥＶꎬＣＯＯＫＤꎬＲＩＥＣＨＭＡＮＮＪＬꎬｅｔａｌ.Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃ￣ｔｏｒＣＢＦ４ｉｓａｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆｄｒｏｕｇｈｔａｄａｐｔａｔｉｏｎｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２００２ꎬ１３０(２):６３９￣６４８.[１２]ＪＩＡＹꎬＤＩＮＧＹꎬＳＨＩＹꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｃｂｆｓｔｒｉｐｌｅｍｕｔａｎｔｓｒｅｖｅａｌｔｈｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆＣＢＦｓｉｎｃｏｌｄａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎａｎｄａｌｌｏｗｔｈｅｄｅｆｉ￣ｎｉｔｉｏｎｏｆＣＢＦｒｅｇｕｌｏｎｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２０１６ꎬ２１２(２):３４５￣３５３.[１３]ＺＨＡＯＣꎬＺＨＡＮＧＺꎬＸＩＥＳꎬｅｔａｌ.ＭｕｔａｔｉｏｎａｌｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅｃｒｉｔｉｃａｌｒｏｌｅｏｆＣＢＦｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎｃｏｌｄａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎｉｎＡｒａ￣３６１张㊀伟等:结球甘蓝ＣＢＦ家族特征分析及低温诱导基因ＢｏＣＢＦ１㊁ＢｏＣＢＦ２ａ和ＢｏＣＢＦ３表达分析ｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１６ꎬ１７１(４):２７４４￣２７５９. [１４]ＪＡＧＬＯＫＲꎬＫＬＥＦＦＳꎬＡＭＵＮＤＳＥＮＫＬꎬｅｔａｌ.ＣｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＣ￣ｒｅｐｅａｔ/ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｆａｃｔｏｒｃｏｌｄ￣ｒｅｓｐｏｎｓｅｐａｔｈｗａｙａｒｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｉｎＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓａｎｄｏｔｈｅｒｐｌａｎｔｓｐｅｃｉｅｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２００１ꎬ１２７(３):９１０￣９１７. [１５]ＨＳＩＥＨＴＨꎬＬＥＥＪＴꎬＹＡＮＧＰＴꎬｅｔａｌ.ＨｅｔｅｒｏｌｏｇｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＣ￣ｒｅｐｅａｔ/ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｆａｃｔｏｒ１ｇｅｎｅｃｏｎｆｅｒｓｅｌｅｖａｔｅｄｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｃｈｉｌｌｉｎｇａｎｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｅｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｍａｔｏ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２００２ꎬ１２９(３):１０８６￣１０９４.[１６]ＣＨＯＩＤＷꎬＲＯＤＲＩＧＵＥＺＥＭꎬＣＬＯＳＥＴＪ.ＢａｒｌｅｙＣｂｆ３ｇｅｎｅｉ￣ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎꎬａｎｄｍａｐｌｏｃａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓ￣ｉｏｌｏｇｙꎬ２００２ꎬ１２９(４):１７８１￣１７８７.[１７]ＱＩＮＦꎬＳＡＫＵＭＡＹꎬＬＩＪꎬｅｔａｌ.ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｎｏｖｅｌＤＲＥＢ１/ＣＢＦｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｃｏｌｄ￣ｒｅ￣ｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＺｅａｍａｙｓＬ[Ｊ].ＰｌａｎｔａｎｄＣｅｌｌＰｈｙｓｉ￣ｏｌｏｇｙꎬ２００４ꎬ４５(８):１０４２￣１０５２.[１８]ＤＵＢＯＵＺＥＴＪＧꎬＳＡＫＵＭＡＹꎬＩＴＯＹꎬｅｔａｌ.ＯｓＤＲＥＢｇｅｎｅｓｉｎｒｉｃｅꎬＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ.ꎬｅｎｃｏｄｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒｓｔｈａｔｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｄｒｏｕｇｈｔ￣ꎬｈｉｇｈ￣ｓａｌｔ￣ａｎｄｃｏｌｄ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２００３ꎬ３３(４):７５１￣７６３.[１９]ＧＵＯＮꎬＷＡＮＧＳꎬＧＡＯＬꎬｅｔａｌ.ＧｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓｈｅｄｓｌｉｇｈｔｏｎｔｈｅｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｖａｒｉａｎｔｓｔｏＢｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａｄｉｖｅｒ￣ｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ[Ｊ].ＢＭＣＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０２１ꎬ１９(１):９３.[２０]ＣＨＥＮＨꎬＷＡＮＧＴꎬＨＥＸꎬｅｔａｌ.ＢＲＡＤＶ３.０:ａｎｕｐｇｒａｄｅｄＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅｄａｔａｂａｓｅ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０２２ꎬ５０:１４３２￣１４４１.[２１]ＰＩＥＲＬＥＯＮＩＡꎬＭＡＲＴＥＬＬＩＰＬꎬＦＡＲＩＳＥＬＬＩＰꎬｅｔａｌ.ＢａＣｅｌＬｏ:ａｂａｌａｎｃｅｄｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｐｒｅｄｉｃｔｏｒ[Ｊ].Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓꎬ２００６ꎬ２２(１４):ｅ４０８￣ｅ４１６.[２２]ＣＨＯＵＫＣꎬＳＨＥＮＨＢ.Ｐｌａｎｔ￣ｍＰＬｏｃ:ａｔｏｐ￣ｄｏｗｎｓｔｒａｔｅｇｙｔｏａｕｇ￣ｍｅｎｔｔｈｅｐｏｗｅｒｆｏｒｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇｐｌａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１０ꎬ５(６):ｅ１１３３５.[２３]ＲＯＺＡＳＪꎬＦＥＲＲＥＲ￣ＭＡＴＡＡꎬＳÁＮＣＨＥＺ￣ＤＥＬＢＡＲＲＩＯＪＣꎬｅｔａｌ.ＤｎａＳＰ６:ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎａｌｙｓｉｓｏｆｌａｒｇｅｄａｔａｓｅｔｓ[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎꎬ２０１７ꎬ３４(１２):３２９９￣３３０２.[２４]ＫＯＣＨＭＡꎬＨＡＵＢＯＬＤＢꎬＭＩＴＣＨＥＬＬＯＬＤＳＴꎬｅｔａｌ.Ｃｏｍｐａｒａ￣ｔｉｖｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｈａｌｃｏｎｅｓｙｎｔｈａｓｅａｎｄａｌｃｏｈｏｌｄｅｈｙ￣ｄｒｏｇｅｎａｓｅｌｏｃｉｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓꎬＡｒａｂｉｓꎬａｎｄｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｒａ(Ｂｒａｓｓｉ￣ｃａｃｅａｅ)[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＥｖｏｌｕｔｉｏｎꎬ２０００ꎬ１７(１０):１４８３￣１４９８.[２５]ＬＩＶＡＫＫＪꎬＳＣＨＭＩＴＴＧＥＮＴＤ.Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｌａｔｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓ￣ｓｉｏｎｄａｔａｕｓｉｎｇｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎｄｔｈｅ２－әәＣｔｍｅｔｈｏｄ[Ｊ].Ｍｅｔｈｏｄｓꎬ２００１ꎬ２５(４):４０２￣４０８.[２６]ＣＨＥＮＧＦꎬＭＡＮＤＡＫＯＶＡＴꎬＷＵＪꎬｅｔａｌ.Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇｔｈｅｄｉｐ￣ｌｏｉｄａｎｃｅｓｔｒａｌｇｅｎｏｍｅｏｆｔｈｅｍｅｓｏｈｅｘａｐｌｏｉｄＢｒａｓｓｉｃａｒａｐａ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ２０１３ꎬ２５(５):１５４１￣１５５４.[２７]ＳＨＩＹꎬＤＩＮＧＹꎬＹＡＮＧＳ.Ｃｏｌｄｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｉｔｓｉｎｔｅｒ￣ｐｌａｙｗｉｔｈｐｈｙｔｏｈｏｒｍｏｎｅｓｄｕｒｉｎｇｃｏｌｄａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔａｎｄＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ５６(１):７￣１５.[２８]ＭＯＲＲＡＮＳꎬＥＩＮＩＯꎬＰＹＶＯＶＡＲＥＮＫＯＴꎬｅｔａｌ.ＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｗｈｅａｔａｎｄｂａｒｌｅｙｂｙｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＤＲＥＢ/ＣＢＦｆａｃｔｏｒｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１１ꎬ９(２):２３０￣２４９.[２９]ＺＨＡＮＧＸꎬＦＯＷＬＥＲＳＧꎬＣＨＥＮＧＨꎬｅｔａｌ.Ｆｒｅｅｚｉｎｇ￣ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏｍａｔｏｈａｓａｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＣＢＦｃｏｌｄｒｅｓｐｏｎｓｅｐａｔｈｗａｙꎬｂｕｔａＣＢＦｒｅｇ￣ｕｌｏｎｔｈａｔｄｉｆｆｅｒｓｆｒｏｍｔｈａｔｏｆｆｒｅｅｚｉｎｇ￣ｔｏｌｅｒａｎｔＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２００４ꎬ３９(６):９０５￣９１９.[３０]ＸＩＡＯＨꎬＳＩＤＤＩＱＵＡＭꎬＢＲＡＹＢＲＯＯＫＳꎬｅｔａｌ.ＴｈｒｅｅｇｒａｐｅＣＢＦ/ＤＲＥＢ１ｇｅｎｅｓｒｅｓｐｏｎｄｔｏｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅꎬｄｒｏｕｇｈｔａｎｄａｂ￣ｓｃｉｓｉｃａｃｉｄ[Ｊ].ＰｌａｎｔꎬＣｅｌｌ＆Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔꎬ２００６ꎬ２９(７):１４１０￣１４２１.(责任编辑:成纾寒)４６１江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期。

甘蓝OguCMS花药败育特征及转录组分析

甘蓝OguCMS花药败育特征及转录组分析甘蓝OguCMS花药败育特征及转录组分析植物的繁殖过程对于种群的生存和进化至关重要。

在许多作物中，包括甘蓝，雄花的花药败育（CMS，Cytoplasmic Male Sterility）是一种常见的现象。

在CMS植株中，雄蕊退化，导致花粉产生量显著减少或完全缺失，从而无法进行正常的授粉和繁殖。

虽然甘蓝OguCMS已经被广泛运用于杂交育种中，但其花药败育发生的分子机制仍不完全清楚。

本文通过分析甘蓝OguCMS的花药败育特征及转录组数据，揭示了其背后的转录调控网络和关键基因。

研究结果显示，与正常的有性生殖过程相比，甘蓝OguCMS的花药在形态上出现显著退化的特征。

正常花蕾中的花药通常由四个药隔和四对花丝组成，而OguCMS的花药则只能发育出一对退化的药隔和一对不完全形成的花丝。

这种花药失去正常的结构和功能，导致无法正常产生可授粉的花粉。

此外，OguCMS的花粉粒形态异常，表面纹饰减少，大小不均匀。

综上所述，甘蓝OguCMS的花药败育是由于雄蕊的结构缺陷和花粉形态异常所致。

为了揭示甘蓝OguCMS花药败育的分子机制，我们使用转录组学方法分析了OguCMS花药和正常花药的基因表达谱。

通过对比两者的基因表达差异，我们发现了一系列与花药发育和花粉生产相关的基因。

其中，一些基因在OguCMS中显著下调，包括多种转录因子和信号传导分子。

这些基因可能参与了花药败育的调控网络，并直接或间接影响了雄蕊的发育和花粉的产生。

在转录组数据中，我们还发现了一批与能源代谢和细胞分裂相关的基因在OguCMS中显著上调。

这表明OguCMS植株在花药败育过程中需要大量的能量供应，以维持雄蕊的发育和花药的分裂。

此外，一些与细胞壁合成和修饰相关的基因也被发现在OguCMS中显著上调，这可能与花药细胞壁的改变和退化有关。

通过进一步的功能富集分析，我们确定了一些关键基因和通路，例如细胞壁代谢途径、激素信号通路和转录因子调控网络。

甘蓝细胞质雄性不育材料的分子鉴定

甘蓝细胞质雄性不育材料的分子鉴定摘要：根据Genebank中orf224和orfl38基因序列的保守区设计特异引物，对2个甘蓝不育材料PM、QM的mtDNA进行PCR扩增。

试验结果表明，orfl38特异引物对2个不育材料的mtDNA扩增出350 bp大小的清晰条带；不育材料的特异片段与萝卜Ogu CMS所具有的Ogu orfl38基因同源度达92.55%，长度均为297 bp，因此，初步推断2个不育材料是Ogura胞质雄性不育类型。

关键词：甘蓝；细胞质雄性不育：分子鉴定中图分类号：S635.1文献标识码：A文章编号：1001-3547（2015）08-0008-04结球甘蓝（Brassica oleracea L var. capitata L_），属十字花科芸薹属，为一种重要的蔬菜类作物。

由于不结球白菜杂种优势非常明显，目前国内外主要推广的品种大多数为Fi代。

不结球白菜杂种一代过去主要采用自交不亲和系繁殖，但繁殖成本较高，且亲本生活力易下降，制种时杂交率很难达到100%，容易出现假杂种；利用雄性不育系制种，不仅亲本繁殖容易、杂种一代纯度高，而且有利于新品种的自身保护。

细胞质雄性不育（CMS）是一种不能产生有活力花粉的母性遗传现象，是由线粒体基因组的重排引起的。

CMS相关基因产生一种新的蛋白质，直接或间接破坏线粒体正常的生理功能，从而导致花粉败育，研究证明，高等植物CMS与其线粒体基因密切相关。

目前比较常见的不育类型主要有波里马不育胞质（Pol CMS）、萝卜不育胞质（Ogu CMS）和甘蓝型油菜不育胞质（Nap CMS）等。

芸薹属中波里马不育胞质、萝卜不育胞质研究较多，二者利用比较广泛。

研究发现，几乎所有的细胞质雄性不育均与线粒体基因变异有关，其中起主要作用的是重要基因和未知片段重组形成的开放读码框（ORF）。

人们在分子鉴定方面对不育类型进行了研究，可以有效区分CMS类型。

张德双等利用orfl38引物证实了所获得的白菜CMS96胞质不育系mtDNA的特异序列与Ogu CMS有高度同源，为Ogu CMS不育类型。

甘蓝型油菜CBF基因家族的鉴定和表达分析

作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2021, 47(12): 2394 2406 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9E-mail: zwxb301@DOI: 10.3724/SP.J.1006.2021.04259甘蓝型油菜CBF基因家族的鉴定和表达分析解盼1,4刘蔚1康郁1华玮1钱论文1,2,3官春云1,2,3,*何昕1,2,3,*1湖南农业大学南方粮油作物协同创新中心, 湖南长沙 410128; 2湖南农业大学油料作物研究所, 湖南长沙 410128; 3国家油料作物改良中心湖南分中心, 湖南长沙 410128; 4 湖南农业大学风景园林与艺术设计学院, 湖南长沙 410128摘要: 低温是影响植物生长发育的重要环境胁迫因子, ICE1 (inducer of CBF expression1)–CBF (C-repeat(CRT)-binding factors)–COR (cold responsive)在植物响应低温胁迫的信号途径中具有重要作用。

为探究CBF(C-repeat-binding factors)基因在甘蓝型油菜(Brassica napus L.)中的进化以及在低温胁迫应答反应中的功能, 本研究以4个拟南芥CBF基因为基础序列, 鉴定出11个甘蓝型油菜、6个白菜和5个甘蓝CBF基因, 并对它们的分子特性、蛋白保守结构域和系统进化树、基因结构及基因染色体分布、甘蓝型油菜CBF基因组织表达模式以及不同逆境和激素处理下的表达模式进行系统的比较分析。

结果表明, 在11个甘蓝型油菜CBF基因中, 可分为亚组I (CBF1/2/3)和亚组II (CBF4) 2个亚组。

转录组测序结果表明, 所有甘蓝型油菜CBF基因受低温诱导表达, 其中亚组Ib的4个基因对冷胁迫响应迅速且持续时间长, 亚组II中2个基因对冷胁迫响应表达较弱, 但它们在根中表达量明显高于叶片, 并且参与盐胁迫和渗透胁迫响应; 甘蓝型油菜中CBF基因家族对冻害响应更强烈, 其中亚组I中的BnaA08g30930D、BnaCnng49280D、BnaAnng34260D、BnaC07g39680D和亚组II中BnaA10g07630D、BnaC09g28190D对冻害响应尤为显著。

结球甘蓝BoLH01和BoLH02基因的克隆与表达

作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(8): 1371 1379/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@ DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01371结球甘蓝BoLH01和BoLH02基因的克隆与表达张林成1高启国1,*蒲全明1任雪松1刘豫东1朱利泉2王小佳11 西南大学园艺园林学院 / 南方山地园艺学教育部重点实验室, 重庆 400716;2 西南大学农学与生物科技学院, 重庆 400716摘要: bHLH类转录因子在植物叶片形态建成和发育过程中发挥重要的生理功能。

本文通过结球甘蓝转录组数据分析, 筛选出莲座期和结球期的茎尖间与叶片间均显著差异表达的2个bHLH类转录因子, 命名为BoLH01和BoLH02基因, 获得了2个基因的编码序列, 其中BoLH01基因CDS全长为966 bp、编码321个氨基酸; BoLH02基因CDS全长870 bp、编码289个氨基酸; 序列分析表明BoLH01和BoLH02分别与拟南芥AtbHLH18和AtbHLH19氨基酸同源相似性最高, 达81%和74%, 均具典型bHLH结构域特点和完全保守的13E-16R和9H-13E-17R以及Leu23对应的关键氨基酸位点; 分子进化上BoLH01、BoLH02与AtTCP2/3/4/10/24亲缘关系较近, 与AtTCP9/11/14/15较远; 转录组和荧光定量PCR分析表明BoLH01和BoLH02在平展的莲座叶中表达量较低, 在卷曲的球叶中高量表达; 序列分析BoHB7、BoHB12和BoILL6的ATG上游均包含能被bHLH功能域识别的E-box序列, 对BoHB7、BoHB12和BoILL6荧光定量PCR分析表明, 三者与BoLH01和BoLH02在不同时期叶片中表达量的变化趋势完全一致; 说明BoLH01和BoLH02可能通过正向调控BoHB7、BoHB12、BoILL6基因的表达来参与甘蓝叶片卷曲的调控。

甘蓝型油菜及其亲本种BAC末端重复序列分析

甘蓝型油菜及其亲本种BAC末端重复序列分析关键词:甘蓝型油菜(Brassica napus);亲本种;BAC末端;重复序列BAC End Repeat Sequence Analysis of Brassica napus and Its Parental SpeciesAbstract: The repeat sequences’ composition and proportion, GC content in BAC end sequences of Brassica species and its parental species Brassica napus, B. rapa, B. oleracea were comparatively analyzed. The proportion of BAC and repeat sequences in B. napus, B. rapa, B. oleracea was 18.98%, 19.37%, 19.45%, respectively. The repeat sequences in BAC end of the three species could be classified into 6 types of retrotransposon, transposon, miRNAs, microsatellite, simple sequence repeat and low complexity sequence, among which retrotransposon contributed to the highest proportion; and the ratio of rDNA in B. napus was much higher than that in the other two species.Key words: Brassica napus; parental species; BAC end; repeat sequence1935年日本学者总结前人的实验结果,并在细胞学研究的基础上,提出了禹氏三角假说[1],认为芸薹属栽培种包括3个二倍体基本种:白菜(Brassica rapa,AA,2n=20)､甘蓝(B. oleracea,CC,2n=18)和黑芥(B. nigra,BB,2n=16),以及3个四倍体复合种:甘蓝型油菜(B. napus,AACC,2n=38)､芥菜型油菜(B. juncea,AABB,2n=36)和埃塞俄比亚芥(B. carinata,BBCC,2n=34),其种间关系如图1所示:尽管前人对甘蓝型油菜､白菜和甘蓝3个物种的基因组进行了许多基于细胞学､遗传学的比较分析,但由于基因组测序成本的限制,很少有直接大规模利用3个基因组的序列进行比较生物学分析的报道｡细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosomes,BAC)文库的构建对于基因组的测序起着至关重要的作用｡BAC克隆载体一般可以插入100~300 kb的外源基因组片段[2]｡对每个插入的外源基因组序列进行末端测序可得BAC末端序列,每个末端序列的长度约为500 bp｡本研究利用甘蓝型油菜及其亲本种白菜和甘蓝的BAC末端序列,对其所含重复序列的组成和比例､GC含量进行了初步的比较｡1材料与方法1.13个物种BAC末端序列信息来源及概况甘蓝型油菜的BAC末端序列主要来源于中英合作测序项目(BBSRC-funded UK-China),所测的品种是Brassica napus“Tapidor”,共有73 728个BAC,测序所用的载体为pBAC/SACB1,所用的酶是HindⅢ,共得到了93 165条BAC末端序列,均以JBnB命名｡白菜和甘蓝的BAC末端序列均来源于GenBank数据库,检索词分别为:Brassica rapa BAC-end和Brassica oleracea BAC-end｡白菜的BAC末端序列主要来自3个BAC文库,KBrH､KBrB和KBrS,分别含有56 483､50 688､14 256个BAC,测序所用的酶分别是HindⅢ､BamHⅠ､BamHⅠ,KBrH文库和KBrB文库的载体均是pCUGIBACI,所测的品种均是Brassica rapa,sub.pekinensis,var. Chiifu-401,得到的白菜BAC末端序列共198 490条;甘蓝的BAC末端序列来自JBo文库,共包含33 792个BAC,测序所用的载体为pBiBAC2,酶是HindⅢ,所测品种为Brassica oleracea var. alboglabra｡1.2BAC末端序列分析方法1.2.1载体序列和其他污染序列的去除用SeqClean(/tgi/software/)修正序列中载体及一些低质量或者低复杂度序列的脚本,所用到的关于污染的数据库来自ftp:///pub/UniVec/,下载后先用formatdb工具格式化后被Seqclean 使用｡1.2.2重复序列的分析用RepeatMasker软件(/RMDownload.html)分析BAC末端序列含有的重复序列,重复序列库从网站/accountservices/register.php下载｡2结果与分析2.13个物种BAC末端序列基本信息本研究分析的甘蓝型油菜BAC末端序列的碱基数占其全基因组的1/24,白菜BAC末端的碱基数约占其全基因组的1/3,甘蓝BAC末端的碱基数约占其全基因组的1/9(表1)｡从GC含量来看,甘蓝型油菜和白菜的相似性较大,即甘蓝型油菜的AACC基因组多呈现出AA基因组的特征｡对3个物种的BAC末端序列长度分布进行分析比较,发现甘蓝型油菜和白菜的BAC末端序列在长度分布上都出现了1个以上的峰值,而甘蓝的长度分布呈现较好的正态分布｡造成多峰值的原因可能是不同的内切酶或不同的批次测序,也有可能是人为的操作误差｡从BAC末端长度(最小/最大/平均长度)来看,甘蓝型油菜和甘蓝的相似性较大,多呈现CC基因组特征,但是由于测序受到多种因素影响,其可能不能代表基因组结构之间的真正关系｡2.23个物种BAC末端重复序列分析结果甘蓝型油菜的BAC末端序列共有9 338 370 bp的碱基被检测为重复序列,占全部BAC序列的18.98%｡白菜的BAC末端序列共有29 934 706 bp的重复序列,占全部BAC序列的19.37%｡甘蓝的BAC末端序列有13 028 006 bp为重复序列,占全部BAC序列的19.45%｡3个物种的重复单元都可分为6大类:反转座子(Retroelements)､转座子(DNA transposons)､小RNA(small RNA,rDNA)､微卫星(Satellites)､简单重复序列(Simple repeats)和低复杂度序列(Low complexity)(表2)｡对3个物种的重复序列分布进行比较,发现在6大类序列中反转座子所占比重最大,其中包括了最常见的重复家族Gypsy和Copia(可编码反转录酶或整合酶),其次为小RNA(rDNA)序列｡这表明了3个物种(AACC､AA､CC)基因组在成分上的相似性｡但是3个物种不完全相同的重复序列比例显示了3个物种间的差异｡白菜和甘蓝的重复序列占p研究表明,分析一个物种的BAC末端序列也是研究一个物种基因组特性的好方法,研究的准确性在于所测序的BAC末端是从BAC文库中随机挑选的,BAC末端序列已经被认为是高特异性的序列标记[3]｡由于BAC末端对整个基因组的代表性作用,也有很多科学家用BAC末端序列进行比较基因组学的研究[4]｡本研究所用的甘蓝型油菜末端序列有93 165条,总碱基数为49 182 844 bp,约占甘蓝型油菜全基因组的1/24｡虽然用于分析的BAC末端序列条数是有限的,对整个基因组的覆盖率也是有限的,但从理论上来说其在基因组是随机分布的,在一定程度上能代表其基因组的特征｡GC含量是一个基因组的重要特征｡甘蓝型油菜､白菜和甘蓝的BAC末端序列GC含量分别是40.8%､40.5%和38.5%,拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组的GC 含量是42.7%｡植物基因组都含有大量的转座元素(TE),比如转座子､反转座子等｡在本研究中,甘蓝型油菜､白菜､甘蓝的TE含量分别是11.39%､13.42%､14.12%｡其中两种重要而且含量较高的反转座子Gypsy与Copia在3个物种中的比例分别是1∶1.05､1∶2.01､1∶1.53,其在拟南芥中是1∶1[5,6],水稻(Oryza sativa)中为2∶1[7,8],苹果(Malus pumila)中是1∶3[9]｡En-Spm转座子是一类自主型转座系统,在白菜中含量很高,而在甘蓝中,LINEs 和Hobo-Activator的含量明显高于其他两个物种,其中Hobo-Activator最早是科学家在调查猴的DNA转座子时发现的超家族,并戏称为“太空侵略者”｡对于甘蓝型油菜中的两类rDNA,SSU_rRNA_Ath 2007年作为植物界编码rRNA的基因收录在repeatmasker的repbase中,序列来源是拟南芥18 S rRNA｡LSU_rRNA_Ath是同一时间收录进来的拟南芥5.8 S rRNA｡有研究表明很多异源多倍体中的核rDNA 存在同步进化现象(指个体或者种群内基因的重复单位之间发生随机而定向纯合的进化方式),如Wenden等[10]对棉属的5个四倍体种(AADD基因组)及二倍体亲本种(AA或DD)的18 S rDNA基因的ITS区和5.8 S rDNA区域进行了分析,发现所有的二倍体､四倍体只有单一的序列,不存在基因座多态性,说明二倍体､四倍体ITS区重复单位间的序列杂合性很低或不存在,它们之间已经接近或完全纯合[10]｡但是对芸薹属的多倍体复合体的研究结果却相反,Waters等[11]对6个栽培种B. rapa(AA)､B. nigra(BB)､B. oleracea(CC)､B. juncea(AABB)､B. carianta(BBCC)､B. napus(AACC)的研究发现多倍体种同时具有两个二倍体祖先种的rDNA重复序列,而且在B. napus和B. juncea中,两个亲本rDNA序列的摩尔数相等,表明这些多倍体中rDNA未发生同步进化｡本研究中甘蓝型油菜rDNA的含量明显高于其他两个物种中该重复元素含量,很好地佐证了该结论｡参考文献:[1] NAGAHARU U. 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甘蓝型油菜株高QTL定位及主效QTL区间候选基因预测

甘蓝型油菜株高QTL定位及主效QTL区间候选基因预测姜成红;耿鑫鑫;魏文辉;姜慧芳【摘要】为了研究油菜株高的遗传基础,以2个甘蓝型油菜株系DH-7-9(矮杆)×DH-G-42(高杆)杂交后代连续自交的重组自交系群体(190个家系)为材料,在西宁和武汉2种环境下进行株高性状鉴定,结果显示,该重组自交系群体的株高表现连续变异并且符合正态分布.利用前期构建的遗传连锁图,结合2种环境下株高性状鉴定数据,采用WinQTLcart 2.5软件复合区间作图法(CIM)进行QTL定位和效应估计,结果表明,在2种环境下共检测到11个与株高性状相关的QTL,单个QTL可解释的表型变异为1.17％～10.45％.在A10连锁群上,主效QTL(qPH-X-A10或qPH-W-A10)在两环境下可重复检测到,可解释10.24％～ 10.45％的表型变异.将156个拟南芥株高基因与该主效QTL置信区间对应的油菜基因组上的723个基因进行同源比较分析,在主效QTL区域内预测到2个株高候选基因BnaA10g07740D 和BnaA10g12020D,其对应的拟南芥同源基因分别为A TGA20ox2、GA5/ATGA20ox1和STA1,均与拟南芥株高相关.%For studying the genetic basis controlling the plant height of rapeseed (Brassica napus),a recombinant inbred line population(190 lines) derived from a cross between a dwarf B.napus line DH-7-9 and a tall B.napus line DH-G-42 constructed by selfing for successive generations was used as material.This population was grown in Xining and Wuhan.The plant heights of individual lines were measured.The QTLs of plant height were detected using the genetic map constructed before by the complex interval graph method (CIM) of WinQTLcart 2.5 software under two environments.The results showed that a total of 11 putative QTLs for plant height were detectedunder two environments,each of them explained 1.17％-10.45％ of phenotypic variation.In linkage group A10,one major QTL(qPH-X-A10 or qPH-W-A10) was identified under two environments repeatedly,explaining 10.24％-10.45％ of the phenotypic variation.We collected 156 genes associated with the plant height of Arabidopsis thaliana and then searched the genomic region corresponding to the major QTL confidence interval to screen the possible candidate genes in B.napus.Two candidategenes,BnaA10g07740D and BnaA10g12020D,associated with plant height were founded.They had three ortholcgous genesATGA20ox2,GA5/ATGA20ox1 and STA1,all involving in plant height differentiation of A.thaliana.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2017(046)008【总页数】5页(P27-31)【关键词】甘蓝型油菜;株高;QTL定位;候选基因【作者】姜成红;耿鑫鑫;魏文辉;姜慧芳【作者单位】中国农业科学院油料作物研究所/农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室,湖北武汉430062;中国农业科学院油料作物研究所/农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室,湖北武汉430062;中国农业科学院油料作物研究所/农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室,湖北武汉430062;中国农业科学院油料作物研究所/农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室,湖北武汉430062【正文语种】中文【中图分类】S565.4油菜(Brassica napus)是世界范围内广泛种植的主要油料作物，也是我国唯一的冬季油料作物，我国油菜栽培面积和总产量均居世界第1位[1]。

甘蓝是雌雄同株植物．研究人员培育...

11．⽢蓝是雌雄同株植物．研究⼈员培育了体细胞含有两种外源抗⾍基因（分别⽤A和B表⽰）的转基因⽢蓝．体细胞含两种抗⾍基因的⽢蓝表现为强抗⾍，含⼀种抗⾍基因的植株表现为弱抗⾍，没有抗⾍基因的植株不抗⾍（普通⽢蓝）．实验室转基因获得⼀株强抗⾍植株，甲⼄丙三位同学认为这两种基因在染⾊体上的整合位点存在如图所⽰的情况（细胞中只有2个抗⾍基因，不考虑染⾊体的交叉互换）．请设计实验并分析可能的结果．I实验步骤：转基因⽢蓝与普通⽢蓝杂交．II预期结果及结论：如果⼦代均为弱抗⾍植株，则这两种基因在染⾊体上的整合位点如甲图所⽰．如果⼦代中有$\frac{1}{2}$为强抗⾍，$\frac{1}{2}$为不抗⾍，则这两种基因在染⾊体上的整合位点如⼄图所⽰．如果⼦代中有$\frac{1}{4}$为强抗⾍，有$\frac{1}{2}$为弱抗⾍，有$\frac{1}{4}$为不抗⾍，则这两种基因在染⾊体上的整合位点如丙图所⽰．分析 1、基因⼯程的基本操作步骤主要包括四步：①⽬的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将⽬的基因导⼊受体细胞；④⽬的基因的检测与表达．2、基因分离定律的实质：在杂合⼦的细胞中，位于⼀对同源染⾊体上的等位基因，具有⼀定的独⽴性；⽣物体在进⾏减数分裂形成配⼦时，等位基因会随着同源染⾊体的分开⽽分离，分别进⼊到两个配⼦中，独⽴地随配⼦遗传给后代．3、基因⾃由组合定律的实质是：位于⾮同源染⾊体上的⾮等位基因的分离或⾃由组合是互不⼲扰的；在减数分裂过程中，同源染⾊体上的等位基因彼此分离的同时，⾮同源染⾊体上的⾮等位基因⾃由组合．解答解：要判断⽬的基因插⼊的位点，可将转基因⽢蓝与普通⽢蓝杂交．（1）甲与普通⽢蓝杂交，⼦代均为弱抗⾍植株；（2）⼄与普通⽢蓝杂交，⼦代中有$\frac{1}{2}$为强抗⾍，$\frac{1}{2}$为不抗⾍；（3）丙与普通⽢蓝杂交，⼦代中有$\frac{1}{4}$为强抗⾍，有$\frac{1}{2}$为弱抗⾍，有$\frac{1}{4}$为不抗⾍．故答案为：转基因⽢蓝与普通⽢蓝杂交⼦代均为弱抗⾍植株⼦代中有$\frac{1}{2}$为强抗⾍，$\frac{1}{2}$为不抗⾍⼦代中有$\frac{1}{4}$为强抗⾍，有$\frac{1}{2}$为弱抗⾍，有$\frac{1}{4}$为不抗⾍点评本题考查基因⼯程、基因分离定律和基因⾃由组合定律的实质及应⽤，要求考⽣识记基因⼯程的原理及具体操作步骤；掌握基因分离定律和基因⾃由组合定律的实质，能根据图中信息进⾏准确的计算．。

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因的进化和功能研究以及甘蓝抗逆分子育种具有
重要意义。本研究利用比较基因组学的方法，甘蓝基从
因组中鉴定出两个ＣＬ基因，别命名为Ｂ分
踟Ｃ１ＢＣＬ。并对这两个基因预测编码的砚和ｏＢ２
感受器与其相互作用的蛋白激酶ＣＰＩＫ构成ＣＬＢ
式植物拟南芥和单子叶模式植物水稻基因组中，
和生理水平上响应的精细调控机制。许多研究表
ＣＬ基因家族均含有ｌ成员 ’ ＢＯ个。关于ＣＬＢ的研究，在拟南芥中较为详尽¨￣，，－，］在豆３．１１１，５０３６６类、稻、米、树、粱和大白菜中也有研水玉杨高究Ｊ，些研究均表明，Ｂ这ＣＬ基因在植
２结果与分析
２Ｉ甘蓝ＣＬ基因的鉴定和结构特征分析．Ｂ
以和ＡＣＰ２ｔＩＫ３互作，调节钾离子转运载体ＨＴＫ１的功能．Ｊ】。据此推断，ｏＢＩ和ＢＣＬ６ＢＣＬｏＢ２在钾的吸收和干旱等逆境响应以及ＡＡ信号转导过Ｂ
蛋白的氨基酸序列一致性为９％；ｏＢ２与６ＢＣＬＡＣＬｔＢ１的核苷酸序列一致性分析利用ＭＧ４１来构建进化树，ＥＡ．采用Ｂｏｓａｓ—Ｎｉｈｏｉｉｇ方法，ｏｔｒｔｔｅｂｒｏｎｔｐｅｇＪｎ重复５０次０
一
步研究它们在甘蓝逆境响应过程中的功能提供
参考。
遗传进化分析（２图）表明，ｏＢ１和ＢＣＬＢＣＬｏＢ２与拟南芥的ＣＬＢ１和ＣＬＢ９关系较近，分布在一个同源群中。序列分析表明，ｏＢ１与ＢＣＬ
山东农业科学２１。：０１３８一ｌＯ
ＳａｄｎｇｉｌｒｌｃｎｅｈｎｏｇＡｒｕｔａＳｉｃｓｃｕｅ
两个甘蓝ＣＬ基因的基因组解析Ｂ
陈伟范华，贤娴。李利斌王淑芬ｈ，刘，，
（．山东省农业科学院蔬菜研究所／１山东省设施蔬菜生物学重点实验室／国家蔬菜改良中心山东分中心，
关键词：甘蓝；ＢＣＬ基因；因结构；基进化；顺式元件
中图分类号：７４Ｑ５文献标识号：Ａ文章编号：０１４４（０１０ — ０８０１０ — ９２２１）３００ — ３
ＧｅｏｉｎｍｃＡｎａｙｉｆＴｗｏＣＢＬｎｓｏａｓｃｌｔｃ口ｌｓｓｏＧｅｅｆＢｒｓｉａ０ｅＩｅ口
ＣＬ基因序列，对鉴定出的ＣＬ基因进行进化Ｂ并Ｂ分析，启动子序列中的顺式元件进行预测。遗对
蛋白的氨基酸序列一致性为８％；ＢＣＬ９而ｏＢ２与ＡＣＬｔＢ９的核苷酸序列一致性为９％，二者编码０
物应答干旱、碱、温逆境胁迫中具有重要功盐低能。但在十字花科蔬菜甘蓝中关于ＣＬ的研究Ｂ
还未见报道。而甘蓝是我国乃至世界性的重要蔬
明，种逆境胁迫作用于植物细胞，各首先引发细胞内钙离子浓度的改变。钙离子浓度在时空上的变
运算。蛋白结构分析通过ＰａｔｅｔｅＳａｌｓＦａｒｃｎｎＰｕ
（ｔ／ｐａｔ．ｅｏｉ．ｕｄｅｅｕ／ｔｌｅ— ｈｔ／ｌｓｇｎｍｃｐｒｕ．ｄｈｍ／ｆａｐ：ｎｐｓ
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蛋白的氨基酸序列一致性为８％。这说明９
收稿日期：００－１０２１１－１基金项日：山东省农业重大应用技术创新课题（０Ｏ —— “ 白菜、、２ｌ）大萝甘监春夏设施栽培技术研究” 资助。作者简介：伟（９２－，在职硕士研究生，究实习员，陈１８）女，研主要从事蔬菜生理研究。Ｅ—ｍｉ：ｈｎｅ０＠１３ｃｍａｃｅｗｉ９６．ｏｌ５
化，表了某种特定胁迫信息，为钙信代称号 ¨７引。钙信号通过与其作用的蛋白传导信．ＪＪ
号，调控下游早期响应基因的表达。在植物应答逆境胁迫过程中，ａＣ “感受器一作用蛋白一靶基因是关键的调控途径，制着胁迫响应基因的开控
具有负向作用；ＣＬ而Ｂ９可以调节对ＡＢＡ响应的敏感性和ＡＡ的合成Ｂ ¨。另外，两个基因可这
ＣＲＡＥ软件进行在线分析。亚细胞定位预测在
ＷｏＦＰＯＴ（ｔ：／ｏｆｓｒｏｓ）中进行。ＬＳＲｈｐ／ｗｌｏｔｒ／ｔｐ．
ＣＨＥＮｅ，ＦＡＮａＷｉＨｕ，ＬＩＸｉｎ—ｘａ．ＬＩＬＵａｉｎｉ—ｂｎｉ。ＷＡＮＧｈＳｕ—ｆｎｅ ”
（．ｎｔｕｅｆＶｇｔｌ，ｈｎｏｇＡａｅｙｏＡｒｕｕａｃｎｅＫｙＬｂｏｉｏｙｏＧｅｎｏｓｅｅｂｓｏ１ＩｉｔｏｅｂＳａｄｎｃｄｍｇｉｌｒｌｉｃ￣ｅａｆｒｏｇｒｅｈｕｅＶｇｔｌｓｔｅａｅｆｃｔＳｅｓＢｌｆａｅｆ
山东济南摘２００；．青州市农业局蔬菜站，５１０２山东青州２２０６５１）
要：利用比较基因组学的方法从甘蓝基因组中鉴定出两个ＣＬ基因，Ｂ并对其结构、遗传进化、顺式元
件进行了分析，以期为进一步研究这两个基因的功能和利用它们进行甘蓝抗逆分子育种提供有益借鉴。
程中具有重要功能。
利用比较基因组学的方法从甘蓝基因组中鉴
定出两个ＣＬ基因，别命名为ＢＣＬＢ分ｏＢ１和
ＢＣＬ。它们所在的ＢＣ克隆及位置、含子ｏＢ２Ａ内
数目、序列大小如表１所示，基因内含子一外显子结构如图１所示。它们均含有８个外显子，相且应的外显子排列顺序和大小一致；码区均为编
ＢＣＬｏＢ１在进化上与ＡＣＬｔＢ１关系最近，ＢＣＬ而ｏＢ２
与ＡＣＬ在进化上关系最近，ｔＢ９它们分别为直系
同源基因，具有相似的功能。
ｓａ．ｔ来进行，ｃｎｈｎａ）顺式元件预测采用Ｐａｔｌ — ｎ
现有研究表明，拟南芥的ＣＬＢ１基因在盐和干旱响应过程中具有正向作用，而对冷胁迫响应
ＳａｄｎｒｖｅＳａｄｎｒｎｈｏＮｔｎｌＶｅｂｐｏｅｅｔＣｎｒＪａ５１０Ｃｉ；ｈｎｏｇＰｏｉ／ｈｎｏｇＢａｃａｉａｅｔｌＩｒｍｎｅｔ，ｉｎ２００，ｈｎｃｎｆｏｇａｅｍｖｅｎａ
２ｅｅｌＳｔｎｏＡｒｕｕａｕｅｕｏＱ，ｈｕＣ，Ｑｎｚｏ６５１Ｃｉ）．ＶｇｔｅｔｉｇｉｌｒＢｒｉｏｂａａｏｆｃｔｌａｆ￣ｉｈｕ２２０，ｈｎｇａ
６２ｂ，应的基因组序列相近。蛋白结构域分４ｐ相析表明，ｏＢ１和ＢＣＬＢＣＬｏＢ２编码的蛋白都含有３
个能结合钙离子的ＥＦ手型结构，而且这三个ＥＦ
土壤盐渍化、旱、温等逆境是植物生长、干低发育的主要限制因素。为了生存，植物演化形成
一
ＣＰＩＫ信号系统来调节响应钙信号并调节下游基因的表达臼］目前研究表明，双子叶模。在
—
套感知逆境胁迫、导逆境信号并在分子、传细胞
ＡｂｔａｔＴｏＣＬｇｎｓｗｒｄｎｉｅｒｍｒｓｉｌａｅｙｃｍｐｒｔｅｇｎｍｉｔｏ．ＴｅｓｒｃｗＢｅｅｅｅｉｅｔｄｆｏＢａｓｃｏｅｃａｂｏａａｉｅｏｃｍｅｈｄｈｎｉｆａｒｖｈｉｅｅｓｒｔｒ．ｐｙｏｅｙａｄｃｓ—ｅｅｎｓｗｅｅａａｙｅ．ｔｅｒｇｎｔｃｕｅｈｌｇｎｎｉｕｌｍｅｔｒｌｚｄｎｆｎｔｎｌｄｓｅｔｎａｄｓｅｓｏｅａｃｌｃｌｒｂｅｄｎ．ｕｃｉａｉｃｉｎｔｓ —ｔｌｒｅｍｏｅｕａｒｅｉｇｏｓｏｒｎＫｅｒｓＢａｓａｏｅａｅｙｗｏｄｒｓｉｌｒｃａ；ＣＬｇｎｃＢｅｅ；Ｇｅｅｓｒｃｕｅｈｌｇｎ；Ｃｉ —ｅｅｎｎｔｔｒ；Ｐｙｏｅｙｕｓｌｍｅｔｉｐｏｉｅａｕｂｅｉｆｒｔｎｆｒｔｅｒｓｒｖｄｄｖｌａｌｎｏｍａｏｉｉｏｈ