第18章全自动DNA测序仪和蛋白质自动测序仪习题讲解
DNA测序原理和方法.
DNA测序原理和方法DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。
自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。
美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。
本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。
【原理】ABI PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。
由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。
分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。
它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。
PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。
这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。
它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。
电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。
2021年高中生物 专题检测 专题5 DNA和蛋白质技术(含解析)新人教版选修1
2021年高中生物专题检测专题5 DNA和蛋白质技术（含解析）新人教版选修1A．聚合酶链式反应，是用DNA聚合酶在体外扩增DNA片段的技术B．在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似C．PCR反应需在一定的缓冲溶液中进行，只需提供：DNA模板以及四种脱氧核苷酸D．PCR一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸解析PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
答案 C4．PCR利用了DNA热变性的原理，PCR仪实际上也是一种能自动调控温度的仪器，对PCR 过程中“温度的控制”的说法错误的是( )。
A．酶促反应需要高的温度，是为了确保模板是单链B．延伸的温度必须大于退火温度，而小于变性温度C．DNA聚合酶不能热变性，要用耐高温的聚合酶D．DNA解旋酶不能热变性，为了确保模板是单链解析PCR是体外DNA扩增，DNA双链的解开不需要解旋酶，靠高温使其变性，双螺旋结构解体，双链分开。
在复性后，在耐高温的DNA聚合酶的作用下根据碱基互补配对原则合成新的DNA，因此延伸的温度要大于复性温度小于变性温度。
答案 D5．下图表示DNA变性和复性过程，相关说法正确的是( )。
A．向右的过程为加热(80～100 ℃)变性的过程B．向左的过程是DNA双链迅速致冷复性C．变性与在生物体内解旋过程的条件、实质都相同D．图中DNA片段共有4个游离的磷酸基、4个3′端解析变性后的DNA在缓慢降温后才会复性；变性与在生物体内解旋过程的条件不同、实质相同；任一DNA片段都有两个游离的磷酸基(5′端)和两个3′端。
答案 A6．下列关于DNA和蛋白质提取与分离实验的叙述，正确的有( )。
A．提取细胞中的DNA和蛋白质都需用蒸馏水胀破细胞B．用不同浓度NaCl溶液反复溶解与析出DNA可去除蛋白质C．蛋白质提取和分离过程中进行透析可去除溶液中的DNAD．蛋白质可以用电泳的方法进行分离纯化，但DNA不可用该方法纯化解析DNA也可用电泳法分离纯化；透析只能除去小分子杂质。
第18章 全自动DNA测序仪和蛋白质自动测序仪习题
第十八章全自动DNA测序仪和蛋白质自动测序仪首页习题习题参考答案习题名词解释选择题简答题一、名词解释1．荧光标记引物法2．荧光标记终止底物法3．多色荧光标记引物法4．多色荧光标记终止底物法5．Edman降解法6．Sanger双脱氧链末端终止法7．平板电泳型DNA测序仪8．毛细管电泳型DNA测序仪9．缩微生物处理器二、选择题【A型题】在五个选项中选出一个最符合题意的答案（最佳答案）。
1. DNA的一级结构是指（）；A．DNA空间构象B．核苷酸序列C．碱基序列D．氨基酸序列E．DNA双螺旋结构2. 下列有关测序反应体系反应原理的叙述中，错误的是（）A．加入的核苷酸单体为2 -脱氧核苷三磷酸B．低温退火时，引物与模板形成双链区C．沿着3'-5'的方向形成新链D．DNA聚合酶结合到DNA双链区上启动DNA的合成E．形成的新生链与模板完全互补配对3. 双脱氧链末端终止法测序反应与普通体外合成DNA反应的主要区别是（）A．DNA聚合酶不同B．dNTP的种类不同C．dNTP的浓度不同D．引物不同E．双脱氧链末端终止法测序反应体系中还需加入ddNTP4. 下列荧光标记方法中，可以将A、C、G、T四个测序反应在同一管中完成而不影响测序结果的是（）A．单色荧光标记引物法B．单色荧光标记终止底物法C．多色荧光标记引物法D．多色荧光标记终止底物法E．多色荧光标记法5. 下列哪一荧光标记法，必需将A、T、C、G四个测序反应分管进行，但可以合并在一个泳道内电泳（）A．单色荧光标记引物法B．单色荧光标记终止底物法C．多色荧光标记引物法D．多色荧光标记终止底物法E．多色荧光标记法6. 毛细管电泳型测序仪电泳时仪器显示无电流，最常见的原因是由于（）A．电极弯曲B．电泳缓冲液蒸发使液面降低C．毛细管未浸入缓冲液中D．毛细管内有气泡E．测序样本未注入毛细管中7. 毛细管电泳型测序仪电泳时产生电弧，主要原因是（）A．电泳缓冲液漏出B．电泳缓冲液配有误C．电极、加热板或自动进样器上有灰尘沉积D．测序样本纯化不完全，含有盐性成份E．加热板温度过高8. 全自动DNA测序仪的主要应用范围，不包括（）A．人类遗传病、传染病和癌症的基因诊断B．法医的亲子鉴定和个体识别C．生物工程药物的筛选D．动植物杂交育种E．新蛋白质的鉴定9. 蛋白质测序仪的基本工作原理，主要是利用（）A．Edman降解法B．双脱氧链末端终止法C．化学降解法D．氧化－还原法E．水解法10. 蛋白质测序仪主要检测（）A．核苷酸序列B．核糖核酸序列C．碱基序列D．氨基酸序列E．脱氧核糖核酸序列11. 下列有关双脱氧链末端终止法测序原理的叙述中，不正确的是（）A．其基本原理是利用DNA的体外合成过程B．反应体系中需加入dNTP和ddNTPC．ddNTP可以形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中D．dNTP掺入后可导致新合成链在不同的位置终止E．生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段12. 下列有关多色荧光标记终止底物法的叙述中，不正确的是（）A．需将4种ddNTP分别用4种不同的荧光染料标记B．标记和终止过程在同一时间完成C．A、T、C、G四种反应可以在同一管中完成D．可在一个泳道内完成电泳测序E．荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同一DNA片段的两端13. 下列有关荧光标记DNA的检测原理的叙述中，不正确的是（）A．用于测序的产物绝大多数应为单链B．DNA片段上的荧光基团可吸收激光束提供的能量而发射出特征波长的荧光C．两极间的电势差推动DNA片段从正极向负级泳动并达到相互分离D．不同颜色的荧光与不同的碱基信息相对应E．测序结果中，纵轴表示荧光波长种类和强度14. 下列有关Edman降解法基本原理的叙述中，错误的是（）A．PTC－多肽的生成是在弱碱性条件下B．PTC－多肽的生成反应需用过量的试剂使有机反应完全C．在无水强碱的作用下，可使靠近PTC基的氨基酸环化，形成ATZ衍生物和一个失去末端氨基酸的剩余多肽D．剩余多肽链可以进行下一次以及后续的降解循环E．ATZ衍生物经水溶酸处理转化为PTH氨基酸15. 毛细管电泳型DNA测序仪电泳时仪器显示无电流，最常见的原因为（）A．缓冲液配制错误B．毛细管内有气泡C．电泳缓冲液蒸发使液面降低，而未能接触到毛细管的两端D．电极弯曲而无法浸入缓冲液中E．加热板温度过高16. 在单纯以测定DNA序列为目的的全自动DNA测序仪中，广泛应用的原理是（）A．Edman降解法B．双脱氧链末端终止法C．化学降解法D．氧化－还原法E．水解法17. 双脱氧链末端终止法测序的基本原理是利用（）A．RT-PCRB．PCRC．Western BlotD．Southern BlotE．水解法18. 测序反应体系中加入的酶为（）A．限制性内切酶B．RNA聚合酶C．DNA聚合酶D．DNA水解酶E．反转录酶19. 在普通的体外合成DNA反应体系中，加入的核苷酸单体为（）A．dAMP，dCMP，dGMP，dTMPB．dADP，dCDP，dGDP，dTDPC．dATP，dCTP，dGTP，dTTPD．ddATP，ddCTP，ddGTP，ddTTPE．ddADP，ddCDP，ddGDP，ddTDP20. 双脱氧链末端终止法测序反应中除PCR反应体系成份外，还加入了（）A．DNA聚合酶B．dNTPC．dNDPD．ddNTPE．ddNDP21. 在DNA自动测序中广泛应用的示踪物是（）A．色素染料B．同位素C．电化学发光物质D．酶E．荧光素22. 下列有关多色荧光标记引物法标记引物的特性的叙述中，正确的是（）A．四种标记引物的序列相同，但5'端标记的荧光染料颜色不同B．四种标记引物的序列相同，但3'端标记的荧光染料颜色不同C．四种标记引物的序列不同，其5'端标记的荧光染料颜色也不同D．四种标记引物的序列不同，其3'端标记的荧光染料颜色也不同E．四种标记引物的序列不同，其2'端标记的荧光染料颜色也不同23. 下列有关多色荧光标记引物法的叙述中，不正确的是（）A．需将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的5'端B．四种引物的序列相同，但标记的荧光染料颜色不同C．A、T、C、G四个测序反应必需分管进行D．上样时需分别在不同泳道内电泳E．特定颜色荧光标记的引物则与特定的双脱氧核苷酸底物保持对应关系24. 一般来说，DNA测序图中，其横坐标和纵坐标的意义是（）A．横坐标代表荧光波长种类，纵坐标代表时间B．横坐标代表荧光波长种类和强度，纵坐标代表时间C．横坐标代表时间，纵坐标代表荧光波长种类D．横坐标代表时间，纵坐标代表荧光波长种类和强度E．横坐标代表荧光波长种类，纵坐标代表荧光波长强度25. 下列有关DNA自动测序仪自动进样器区功能的叙述中，不正确的是（）A．毛细管进入样品盘标本孔中进样依靠自动进样器的移动完成B．电极和毛细管一般均固定不动C．两级间极高的电势差可促进DNA分子在毛细管中很快泳动D．电极为电泳的正性电极E．样品盘有48孔和96孔两种，可一次性连续测试48或96个样本26. 下列有关DNA自动测序仪凝胶块区功能的叙述中，不正确的是（）A．电泳时缓冲液阀关闭B．电极为电泳的正性电极C．在分析每一个样品前，泵自动冲掉上一次分析用过的胶，灌入新胶D．注射器驱动杆可给注射器提供正压力，将注射器内的凝胶注入毛细管中E．玻璃注射器可储存凝胶高分子聚合物以及在填充毛细管时提供必要的压力27. 平板电泳型DNA测序仪的测序长度一般为（）A．600bp～900bpB．400bp～600bpC．200bp～400bpD．900bp～1000bpE．300bp～500bp28. 毛细管电泳型DNA测序仪的测序长度一般为（）A．600bp～900bpB．400bp～600bpC．200bp～400bpD．900bp～1000bpE．300bp～500bp【X型题】每题的备选答案中有两个或者两个以上正确答案。
全自动dna测序仪的原理和应用
全自动DNA测序仪的原理和应用1. 前言DNA测序技术是现代生物学、医学研究中的重要工具之一。
随着技术的不断进步，全自动DNA测序仪在DNA测序领域占据重要地位。
本文将介绍全自动DNA测序仪的原理和应用。
2. 原理全自动DNA测序仪基于Sanger测序技术，通过离心分离、扩增和合成等步骤来获取DNA序列信息。
其原理主要包括以下几个步骤：2.1 模板制备全自动DNA测序仪需要将待测的DNA样品进行模板制备。
一般采用PCR（聚合酶链式反应）技术来扩增目标DNA片段，以增加其浓度和复制数目。
2.2 扩增产物净化PCR扩增产生的扩增产物中会包含引物和杂质，需要进行净化处理。
常用的方法是利用凝胶电泳分离扩增产物，并使用各类商业化学试剂盒进行提取和净化操作。
2.3 DNA片段测序将净化后的DNA片段进行测序。
全自动DNA测序仪采用Dye-termination测序方法，使用一系列特殊的引物，通过DNA链延伸过程中的不同颜色发光来标记每个碱基。
之后，仪器会通过激光扫描读取每个碱基的发光信号。
2.4 数据分析与测序结果全自动DNA测序仪会生成一系列的发光数据，这些数据需要进行分析和处理。
通常会使用相关软件进行碱基识别、序列拼接和测序结果的校正等步骤，从而获得准确的DNA序列信息。
3. 应用全自动DNA测序仪广泛应用于各个领域，例如：3.1 生物学研究在生物学研究中，全自动DNA测序仪可以用于基因组测序、转录组测序、蛋白质相互作用的研究等。
通过测序获得的DNA序列信息可以帮助研究者了解生物体的遗传信息、功能和相互关系。
3.2 医学领域在医学领域，全自动DNA测序仪可以用于诊断遗传性疾病、癌症等疾病的基因突变。
通过测序可以快速准确地分析患者的基因组信息，从而为临床医生提供准确的诊断和治疗方案。
3.3 农业和食品安全全自动DNA测序仪在农业和食品安全领域也有广泛的应用。
它可以用于鉴定转基因作物、检测食品中的基因改造成分、追溯食品来源，保证食品安全和品质。
基因组测序仪MiSeqDx使用手册说明书
MiSeq TM Dx使用手册MiSeqDx 使用手册文件号1000000039320 v04 | 1 2020年12月Material # 20030132引言本文档及其内容是Illumina，Inc.及其附属公司（“Illumina”）所有，并且仅供与所述产品相关的合同约定的客户使用，无其他用途。
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MiSeqDx 使用手册文件号1000000039320 v04 | 2 2020年12月Material # 20030132修订历史MiSeqDx 使用手册文件号1000000039320 v04 | 3 2020年12月Material # 20030132目录引言 (2)修订历史 (3)目录 (4)第一章概述 (6)产品名称 (6)预期用途 (6)产品结构及组成 (6)第二章设备安装及环境要求 (14)运输和储存 (14)运输和安装 (14)实验室要求 (15)电气要求 (17)环境要求 (18)网络要求 (18)用户自备耗材和设备 (19)第三章工作原理 (21)工作原理 (21)需要但不提供的设备和材料 (21)第四章性能指标 (22)仪器技术指标 (22)仪器使用期限 (23)产品合规性和监管声明 (23)第五章运行操作 (26)P ART וL OCAL R UN M ANAGER（本地运行管理） (26)本地运行管理 (26)登陆信息管理 (26)操作界面概述 (27)管理设置和任务 (31)工作流程概述 (37)P ART װM I S EQ O PERATING S OFTWARE (M I S EQ操作软件) (41)启动和开机 (41)MiSeqDx 使用手册文件号1000000039320 v04 | 42020年12月Material # 20030132测序运行 (43)结果分析 (54)质量控制 (55)文件夹管理 (55)MOS软件界面图标 (56)第六章局限性和注意事项 (58)使用局限性 (58)警告和注意事项 (58)第七章危害及标志 (60)安全考虑和标志 (60)通用标志 (62)第八章设备维护 (63)维护频率 (63)维护清洗 (63)待机清洗 (65)关机步骤 (67)重启步骤 (68)所需磁盘空间 (68)杀毒软件 (68)第九章故障排除 (69)附件 (78)MiSeqDx 使用手册文件号1000000039320 v04 | 52020年12月Material # 20030132第一章概述产品名称中文名称：基因测序仪英文名称：MiSeq TM Dx Instrument型号：MiSeq TM Dx预期用途用于体外诊断。
临床分子生物学检验智慧树知到期末考试章节课后题库2024年湖南师范大学
临床分子生物学检验智慧树知到期末考试答案章节题库2024年湖南师范大学1.人类基因计划的大部分测序工作是利用YAC实现的。
（）答案:错2.线粒体病主要累及大脑和肌肉组织。
（）答案:对3.HER2可作为早期诊断乳腺癌的参考依据。
（）答案:对4.荧光原位杂交可同时检测多种靶序列。
（）答案:对5.TPMT与嘧啶类药物的疗效和毒副作用密切相关。
（）答案:错6.Northerm 杂交检测靶序列是RNA。
（）答案:对7.高通量表面增强激光解吸电离飞行时间质谱可获得“癌症指纹”信息。
（）答案:对8.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症呈X染色体连锁不完全隐性遗传。
（）答案:错9.PCR是已知突变检测的“金标准”。
（）答案:错10.结核杆菌分子生物学检测包括特异性基因检测和耐药基因检测。
（）答案:对11.电喷雾质谱技术是一种软电离技术。
（）答案:对12.核糖体蛋白是基于MALDI-TOF-MS进行细菌鉴定的主要标志物。
（）答案:对13.实时荧光定量PCR引物的最适长度为15～30nt。
（）答案:错14.肺癌的诊断主要依靠分子生物学检验。
（）答案:错15.逆转录病毒的基因组是单倍体。
（）答案:错16.染色体的形态最典型和清晰的阶段是有丝分裂间期。
（）答案:错17.PCR 技术的本质是核酸重组技术。
（）答案:错18.双脱氧链终止法测序需要加入双脱氧核苷酸。
（）答案:对19.Tm 主要与 A-T 含量有关。
（）答案:错20.产前诊断的金标准是对羊水或脐带血细胞进行染色体核型分析。
（）答案:对21.16SrRNA基因作为细菌分类鉴定的靶基因的优点有（）答案:多信息###长度适中###多拷贝22.关于沙眼衣原体的分子生物学检验，正确的是（）答案:RAPD技术不适用于血清学分型###PCR扩增靶基因序列主要有外膜蛋白基因、隐蔽性质粒DNA和16S rRNA基因序列###PCR-RFLP可用于CT分型###LCR技术适合于高危人群普查时大批量标本的检测23.SELDI-TOF-MS中蛋白质芯片系统的组成主要包括（）答案:芯片###芯片阅读器###分析软件24.CYP450基因分型检测的分子生物学方法有（）答案:实时荧光定量PCR###等位基因特异性PCR###基因芯片###PCR-RFLP25.临床分子生物学实验室检测方法的选择原则包括（）答案:根据本地区患者的承受能力选择###根据实验室的技术特点选择###根据检测目的选择###根据实验室的实验条件选择26.PML-RARa融合基因常用的检测方法有（）答案:RT-PCR###荧光原位杂交###荧光定量PCR27.原癌基因激活的机制包括（）答案:易位激活###癌基因甲基化程度降低###原癌基因扩增###点突变28.法医物证学的主要内容有（）答案:种族和种属认定###性别鉴定###个体识别###亲子鉴定29.关于DHPLC技术的描述正确的是（）答案:灵敏度和特异性高###自动化程度高###是分析异质性突变的首选方法###可实现高通量检测30.理想的质控品应满足以下要求（）答案:稳定、价廉、同一批次可大量获得###无已知的生物传染危害性###基质与待测样本一致###阳性质控品所含待测物浓度接近试验的决定性水平###靶值或预期结果已知31.乙型肝炎病毒的核酸类型是（）答案:双股DNA32.TPMT是下列哪类药物在体内代谢的关键酶（）答案:嘌呤类33.采集用于PCR检测的血清样本时，不宜选择使用的抗凝剂是（）答案:肝素34.奥美拉唑在体内代谢主要受哪种药物代谢酶的影响？（）答案:CYP2C1935.PCR的退火温度通常比引物的Tm值（）答案:低约5℃36.HLAI类抗原的特异性取决于（）答案:α重链37.可以用来分辨16SrRNA基因不能鉴别的非常接近的菌种和种内菌株的是（）答案:16S-23S rRNA基因38.单细胞基因扩增一般采用下列哪项技术增加检测的敏感性和特异性（）答案:巢式PCR39.Southern 印迹杂交中常用的核酸变性剂是（）答案:氢氧化钠40.DNA指纹的分子遗传学基础是（）答案:DNA的多态性41.新一代测序技术最显著的特点是（）答案:高通量42.微卫星异常的检测方法有（）答案:DNA测序43.PCR的引物Tm值的计算公式为（）答案:Tm= 2(A+T)+4(G+C)44.PCR循环中的延伸时间取决于（）答案:扩增产物的长度45.线粒体基因组22个tRNA可转录几种tRNA （）答案:20种46.保证结果准确可靠的先决条件是（）答案:分析前质量控制47.肿瘤的分子诊断策略有（）答案:检测肿瘤相关基因48.在PGD中诊断单基因疾病的主要手段是（）答案:单细胞PCR技术49.焦磷酸测序法突出的优势是（）答案:较长的读长50.寡核苷酸探针的最大优势是（）答案:可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列51.非整倍体筛选的诊断方法主要借助于下列哪项技术（）答案:FISH52.乙型肝炎病毒可分为多少个基因型？（）答案:853.TaqMan 探针技术要求扩增片段应为（）答案:50～150bp54.目前对肺癌遗传易感性主要集中在如下哪几个领域（）答案:DNA修复能力55.临床分子生物学检验的核心技术是（）答案:核酸扩增技术56.临床分子生物学检验标准化的前提是（）答案:标准品57.临床基因扩增检验实验室设计的原则主要包括（）答案:分区设置###控制空气流向58.质量管理体系文件具有法规性、唯一性和时效性三大特性。
《临床检验仪器学》教学大纲
3.一般介绍全自动DNA测序仪、蛋白质测序仪的应用及研究进展
五、实验教学目标与内容
（一） 可见分光光度计的使用和调校
目标
1.掌握可见分光光度计常见故障产生的原因的分析及检修
2.熟悉各种分光光度计的原理与结构，学会分光光度计的正确使用方法和调校方法
3.一般介绍生物安全柜的安装注意事项
第十单元 培养箱及相关技术
目标
1.掌握电热恒温培养箱和二氧化碳培养箱的结构、原理及正确使用方法
2.熟悉厌氧培养箱的结构及工作方式
3.了解其他类型培养箱的结构及工作原理
内容
1.重点阐述电热恒温培养箱和二氧化碳培养箱的结构原理及使用方法
2.详细讲解厌氧培养箱的结构原理及使用
3.一般介绍流式细胞仪的临床应用实例
第十六单元 全自动DNA测序仪和蛋白质测序仪及相关技术
目标
1.掌握全自动DNA测序仪、蛋白质测序仪的工作原理、结构及功能
2.了解测序仪主要应用、常见故障及维护
3.了解全自动DNA测序仪、蛋白质测序仪研究进展
内容
1.重点阐述全自动DNA测序仪、蛋白质测序仪的工作原理
（二）基本技能
通过理论学习和实验，掌握临床常见检验仪器的基本原理和结构，从理论到实践的转换和结合，学会一般仪器的正确使用方法、日常保养维护和简单故障的排除。
（三）本素质
本课程为医学检验专业学生开设的一门应用性很强的专业课，通过理论课程的讲授，使学生掌握常见临床检验仪器的工作原理、仪器结构、性能指标的评价方法，学会正确地选择与使用仪器；通过实验，让学生了解构成仪器的基本元件、简单电路的识别，学会正确地调试仪器，能够正确地进行日常维护、保养，掌握常见故障的处理方法。使学生能够理论联系实际，增强动手、动脑能力。
全自动DNA测序仪的结构与功能
全自动DNA测序仪的结构与功能1.样品处理系统：这一系统负责从生物样品中提取和纯化DNA。
它包括样品输入设备、样品捕获设备以及相应的化学处理设备。
样品输入设备用于将待测样品注入到测序仪中，样品捕获设备则用于将样品中的DNA捕获或分离出来。
2.DNA扩增系统：在进行DNA测序前，需要对样品中的DNA进行扩增，使其能够得到足够的量来进行测序。
这一系统通常采用聚合酶链式反应（PCR）技术，通过在一系列温度变化的条件下，利用特异性引物和聚合酶进行多轮扩增，从而获得目标DNA片段的大量拷贝。
3. 测序反应系统：这是全自动DNA测序仪的核心部分。
该系统用于进行DNA测序反应，以确定DNA分子的碱基序列。
典型的测序反应系统采用Sanger测序方法，其中包括一个DNA模板，引物，荧光标记的末端标记核苷酸和聚合酶。
这些组分在特定条件下混合反应，产生DNA片段的合成和终止，最终得到包含不同长度的合成DNA片段。
4.电泳系统：电泳系统通过将反应结束的DNA片段分离开来，以便进行测序。
这一系统通常采用毛细管电泳方法，通过在电场作用下，将DNA片段根据其长度分离开来。
此外，电泳系统还包括高精度的电压控制系统和温度控制系统，以确保电泳条件的稳定性。
5.成像系统：成像系统用于检测和记录电泳过程中的荧光信号。
它通常配备有高分辨率的CCD相机和相关的成像软件，可以实时地监测DNA片段的移动和荧光信号的强度。
6.数据分析系统：全自动DNA测序仪还配备有相应的数据分析系统，用于将获得的原始数据转化为碱基序列。
这一系统通常包括数据处理软件、碱基识别算法和序列比对工具等，用于对测序结果进行分析和解读。
综上所述，全自动DNA测序仪具有一系列功能齐全的部件，能够高效地进行DNA测序。
它的结构和功能相互协调、密切配合，为科学研究提供了重要的实验手段。
随着技术的不断发展，全自动DNA测序仪不断进步和完善，使得DNA测序工作更加高效、准确和自动化。
蛋白质测序Edman
百泰派克生物科技
蛋白质测序Edman
Edman降解法是瑞典化学家于1967年发明的一种测序方法，用于蛋白质或多肽N
末端序列分析，基于Edman降解法的测序仪也是第一台蛋白质测序仪。
Edman降解法进行蛋白质或多肽N末端序列分析是一个循环式的化学反应过程，主
要包括3个主要步骤：第一步就是发生偶联反应，利用异硫氰酸苯酯（PITC）与蛋白质多肽的N末端氨基酸残基结合形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，即PTC-肽。
然后在三氟乙酸的作用下进行环化裂解，利用三氟乙酸处理PTC-肽，使N末端氨
基酸被选择性的切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺（ATZ）衍生物。
最后
利用该ATZ-衍生物的有机溶液从反应液中萃取出来，ATZ-衍生物不稳定，需通过
酸化处理将其转化为稳定的苯乙内酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH氨基酸，然后对
该氨基酸进行鉴定。
这一系列反应如此循环，每次循环鉴定一个切下的末端氨基酸，直到完成N末端氨基端的序列测定。
百泰派克生物科技提供基于Edman法的蛋白质N末端测序一站式科研技术服务，用于蛋白或活性多肽N端序列分析，还可用于确认重组蛋白表达情况，如是否完整表达、表达过程是否发生断裂以及N端序列是否发生修饰等。
百泰派克生物科技还可根据需求提供定制化技术服务，欢迎免费咨询。
DNA测序仪的测序原理和操作规程
DNA测序仪的测序原理和操作规程DNA测序仪DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括sanger双脱氧链终止法和maxam-gilbert化学降解法。
自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。
美国pe abi 公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。
本实验介绍的是abi prism 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。
原理abi prism 310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddntp(标记终止物法)，因此通过单引物pcr测序反应，生成的pcr产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序pcr产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。
由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的ccd(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在ccd摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。
分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。
它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。
pe公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA 测序胶(pop 6)和genescan胶(pop 4)。
这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。
它主要由毛细管电泳装置、macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。
《临床检验仪器学》教学大纲
《临床检验仪器学》教学大纲课程类别：专业核心课程课程性质：必修英文名称：Clinical Laboratory Instruments总学时：36 讲授学时：28 见习学时：8学分：2先修课程：临床生物化学检验、临床免疫学检验、临床基础检验、临床病原生物学检验、临床血液学检验适用专业：医学检验技术开课单位：医学院一、课程简介临床检验仪器学主要介绍临床检验常规仪器的基本构造、原理、功能和应用。
通过学习本课程，使学生掌握临床检验主要仪器的原理和应用，了解临床检验主要仪器的基本结构和性能及常见故障的排除。
二、教学内容及基本要求第一章概论（2学时）教学内容：1.1 学习临床检验仪器课程的目的1.2 临床检验仪器的特点、分类和常用性能指标1.3 临床检验仪器的主要部件、维护和选用标准1.4 临床检验仪器的进展和发展趋势教学要求：1.了解临床检验仪器的特点、分类和常用性能指标。
2.了解临床检验仪器的主要部件、维护和选用标准。
3.了解临床检验仪器的进展和发展趋势。
授课方式：讲授第二章显微镜技术和显微镜（2学时）教学内容：2.1光学显微镜2.2光学显微镜的分类及其应用2.3电子显微镜2.4显微镜的维护、常见故障及排除2.5 时间分辨荧光免疫分析仪显微摄影术教学要求：1.掌握显微镜的应用。
2.了解显微镜的基本结构和性能。
授课方式：讲授第三章微生物检测技术和相关仪器（2学时）教学内容：3.1自动血培养仪3.2 微生物自动鉴定及药敏分析系统教学要求：1.掌握微自动血培养仪和微生物自动鉴定及药敏分析系统的应用。
2.了解微自动血培养仪和微生物自动鉴定及药敏分析系统的基本结构和性能。
授课方式：讲授第四章生物安全柜（1学时）4.1生物安全柜的工作原理和分类4.2 生物安全柜的结构与功能4.3 生物安全柜的实际应用教学要求：1.掌握的生物安全柜的应用。
2.了解生物安全柜的基本结构和性能。
授课方式：讲授第五章细胞培养技术和培养箱（1学时）教学内容：5.1细胞培养技术5.2 培养箱的分类、结构和使用教学要求：1.掌握培养箱的应用。
基因测序-ppt课件
Flowcell实物图 8
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
第二部分
Flowcell表面微观示意图
每个泳道(LaP5接头)。这两种接头与泳道表面共价连接。
边合成边测序（来源：illumina官网）
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第二部分
Ion Torrent PGM半导体测序
芯片就是测序仪，4种dNTP依次流过半导体芯片PCRDNA聚合产生的氢离子直接检测，每 个碱基只需数秒
美国Illumina 公司的基因组测序仪（genome analyzer，GA）
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为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
第二部分
Flowcell
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
第二部分
SBS测序
特异荧光标记的4种dNTP，3’-OH叠氮基团被保护，每次只能添加一个dNTP，这就确保了在测序 过程中，一次只会被添加一个碱基，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。
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第三部分
Oxford Nanopore纳米孔单分子技术
PCR仪和测序仪
伯乐IQ5定量PCRiQ5实时PCR检测系统是BIO-RAD公司设计的新一代实时PCR检测仪器。
和以前的iCycler iQ 、MyiQ仪器一样，iQ5也是在带有96孔反应模块的iCycler 上升级。
新的iQ5检测系统功能强大，能够同时检测5个靶基因，软件也重新设计。
iQ5检测系统的软件整合了高效的数据采集和数据分析功能，包括无需标准曲线的相对定量功能，方便进行基因表达分析研究。
iQ5系统是一台具有很高性价比的仪器产品特点:iQ5由iCycler升级而成，其配备的高灵敏度CCD光学模块检测范围可以跨越9搁数量级。
五波长的设计使其更方便地检测多重PCR检测及其衍生的基因表达等其他分析模式。
iQ5适合于多种荧光方法的检测，能够保证在荧光定量PCR的应用中保证最大的灵活性。
其具体性能如下：1、继承了iCycler优良的温度控制性能和众多的高级设置（如梯度PCR功能等）2、直观、综合、全面的结果显示。
3、更完善的基因表达分析。
4、支持等位基因分析功能。
5、支持终点法分析模式。
技术参数1、样品容量：96×0.2ml PCR反应管2、样品体积：15-100μl3、外形尺寸：29×58×39cm（长×宽×高）4、重量：17.5kg5、荧光激发波长范围：通道1：475-495nm、通道2：515-545nm、通道3：530-560nm、通道4：560-590nm、通道5：615-645nm6、荧光检测波长范围：通道1：515-545nm、通道2：565-585nm、通道3：575-595nm、通道4：610-640nm、通道5：670-700nmABI7500性能参数7500型实时定量PCR仪是特异性靶基因检测与定量的一体化平台。
7500将PCR 热循环，荧光检测和各种应用分析软件结合在一起，可以动态观察PCR每一循环各反应管中PCR扩增产物逐渐增加的情况。
PCR实验结束后可以马上得到定量结果，无需凝胶电泳分析，无需纯化PCR产物，无需进行任何实验操作。
测序知识概述
序列结构困难模板
GC RICH
局部75％GC碱基富集
AT RICH
局部80％AT碱基富集
样品片段大于10KB
测序序列有峰值，但背景信号极高，导致 Nhomakorabea器无法判读， 用通用测序反应体系（5ul体系）无法得到结果
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Invitrogen Proprietary & Confidential
困难模板测序相关知识——困难样品的定义和鉴别
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Invitrogen Proprietary & Confidential
测序简单问题解答——术语讲解
摇菌 摇菌是指将客户提供的菌液、穿刺菌、平板菌接入液体培养基中， 37℃过夜培养，从而得到足够用于抽提出一定浓度质粒的过程。
划平板 平板是将用于细菌培养的固体培养基，倒于平皿 之上，待凝固后用于培养细菌。划平板是用接种 环在平板培养基表面通过分区划线而达到纯化分 离微生物的一种方法。是将微生物样品在固体培 养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的 目的。用于目的微生物的分离、克隆的活化。 （如图） 通知客户“划板失败”，是即使我们通过将客户 的菌液通过划平板处理，但是平板上没有菌落生 长，证明克隆可能已经没有活力，建议客户重新 提供样品。
困难模板测序相关知识——常规样品与困难样品的不同点
正常样品 困难样品
1、菌液样品颜色略微偏白 ，培养过夜后， 1、菌液样品清澈，二次摇菌培养，菌液仍清 淡如培养前，不足以抽提质粒 摇荡新鲜培养液呈漂絮状 2、菌液颜色泛黄，呈泥水状，两次抽提质粒 2、质粒2ul电泳鉴定无杂带，主条带亮 电泳鉴定无质粒条带或条带亮度很弱，不足 度达100ng/ul（与标准质粒带对比） 以进行测序反应 3、PCR产物2ul电泳鉴定无杂带或无弥散 状，主条带亮度达50ng/ul（与标准 Marker对比） 3、PCR产物在琼脂糖胶上看到多条扩增产物 带，目前1.5％琼脂糖凝胶无法分离 4、PCR产物电泳鉴定时，在琼脂糖胶上2ul 的上样量看不到扩增产物带 5、质粒样品已降解：电泳鉴定在琼脂糖胶上 看到火箭状拖尾 6、质粒样品含RNA带：在琼脂糖胶上，质粒 主带前看到较宽的RNA带 7、质粒含基因组DNA：在琼脂糖胶上，质粒 主带后靠近点样孔，看到基因组DNA带
第18章 全自动DNA测序仪和蛋白质自动测序仪习题讲解
第十八章全自动DNA测序仪和蛋白质自动测序仪首页习题习题参考答案习题名词解释选择题简答题一、名词解释1．荧光标记引物法2．荧光标记终止底物法3．多色荧光标记引物法4．多色荧光标记终止底物法5．Edman降解法6．Sanger双脱氧链末端终止法7．平板电泳型DNA测序仪8．毛细管电泳型DNA测序仪9．缩微生物处理器二、选择题【A型题】在五个选项中选出一个最符合题意的答案（最佳答案）。
1. DNA的一级结构是指（）；A．DNA空间构象B．核苷酸序列C．碱基序列D．氨基酸序列E．DNA双螺旋结构2. 下列有关测序反应体系反应原理的叙述中，错误的是（）A．加入的核苷酸单体为2 -脱氧核苷三磷酸B．低温退火时，引物与模板形成双链区C．沿着3'-5'的方向形成新链D．DNA聚合酶结合到DNA双链区上启动DNA的合成E．形成的新生链与模板完全互补配对3. 双脱氧链末端终止法测序反应与普通体外合成DNA反应的主要区别是（）A．DNA聚合酶不同B．dNTP的种类不同C．dNTP的浓度不同D．引物不同E．双脱氧链末端终止法测序反应体系中还需加入ddNTP4. 下列荧光标记方法中，可以将A、C、G、T四个测序反应在同一管中完成而不影响测序结果的是（）A．单色荧光标记引物法B．单色荧光标记终止底物法C．多色荧光标记引物法D．多色荧光标记终止底物法E．多色荧光标记法5. 下列哪一荧光标记法，必需将A、T、C、G四个测序反应分管进行，但可以合并在一个泳道内电泳（）A．单色荧光标记引物法B．单色荧光标记终止底物法C．多色荧光标记引物法D．多色荧光标记终止底物法E．多色荧光标记法6. 毛细管电泳型测序仪电泳时仪器显示无电流，最常见的原因是由于（）A．电极弯曲B．电泳缓冲液蒸发使液面降低C．毛细管未浸入缓冲液中D．毛细管内有气泡E．测序样本未注入毛细管中7. 毛细管电泳型测序仪电泳时产生电弧，主要原因是（）A．电泳缓冲液漏出B．电泳缓冲液配有误C．电极、加热板或自动进样器上有灰尘沉积D．测序样本纯化不完全，含有盐性成份E．加热板温度过高8. 全自动DNA测序仪的主要应用范围，不包括（）A．人类遗传病、传染病和癌症的基因诊断B．法医的亲子鉴定和个体识别C．生物工程药物的筛选D．动植物杂交育种E．新蛋白质的鉴定9. 蛋白质测序仪的基本工作原理，主要是利用（）A．Edman降解法B．双脱氧链末端终止法C．化学降解法D．氧化－还原法E．水解法10. 蛋白质测序仪主要检测（）A．核苷酸序列B．核糖核酸序列C．碱基序列D．氨基酸序列E．脱氧核糖核酸序列11. 下列有关双脱氧链末端终止法测序原理的叙述中，不正确的是（）A．其基本原理是利用DNA的体外合成过程B．反应体系中需加入dNTP和ddNTPC．ddNTP可以形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中D．dNTP掺入后可导致新合成链在不同的位置终止E．生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段12. 下列有关多色荧光标记终止底物法的叙述中，不正确的是（）A．需将4种ddNTP分别用4种不同的荧光染料标记B．标记和终止过程在同一时间完成C．A、T、C、G四种反应可以在同一管中完成D．可在一个泳道内完成电泳测序E．荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同一DNA片段的两端13. 下列有关荧光标记DNA的检测原理的叙述中，不正确的是（）A．用于测序的产物绝大多数应为单链B．DNA片段上的荧光基团可吸收激光束提供的能量而发射出特征波长的荧光C．两极间的电势差推动DNA片段从正极向负级泳动并达到相互分离D．不同颜色的荧光与不同的碱基信息相对应E．测序结果中，纵轴表示荧光波长种类和强度14. 下列有关Edman降解法基本原理的叙述中，错误的是（）A．PTC－多肽的生成是在弱碱性条件下B．PTC－多肽的生成反应需用过量的试剂使有机反应完全C．在无水强碱的作用下，可使靠近PTC基的氨基酸环化，形成ATZ衍生物和一个失去末端氨基酸的剩余多肽D．剩余多肽链可以进行下一次以及后续的降解循环E．ATZ衍生物经水溶酸处理转化为PTH氨基酸15. 毛细管电泳型DNA测序仪电泳时仪器显示无电流，最常见的原因为（）A．缓冲液配制错误B．毛细管内有气泡C．电泳缓冲液蒸发使液面降低，而未能接触到毛细管的两端D．电极弯曲而无法浸入缓冲液中E．加热板温度过高16. 在单纯以测定DNA序列为目的的全自动DNA测序仪中，广泛应用的原理是（）A．Edman降解法B．双脱氧链末端终止法C．化学降解法D．氧化－还原法E．水解法17. 双脱氧链末端终止法测序的基本原理是利用（）A．RT-PCRB．PCRC．Western BlotD．Southern BlotE．水解法18. 测序反应体系中加入的酶为（）A．限制性内切酶B．RNA聚合酶C．DNA聚合酶D．DNA水解酶E．反转录酶19. 在普通的体外合成DNA反应体系中，加入的核苷酸单体为（）A．dAMP，dCMP，dGMP，dTMPB．dADP，dCDP，dGDP，dTDPC．dATP，dCTP，dGTP，dTTPD．ddATP，ddCTP，ddGTP，ddTTPE．ddADP，ddCDP，ddGDP，ddTDP20. 双脱氧链末端终止法测序反应中除PCR反应体系成份外，还加入了（）A．DNA聚合酶B．dNTPC．dNDPD．ddNTPE．ddNDP21. 在DNA自动测序中广泛应用的示踪物是（）A．色素染料B．同位素C．电化学发光物质D．酶E．荧光素22. 下列有关多色荧光标记引物法标记引物的特性的叙述中，正确的是（）A．四种标记引物的序列相同，但5'端标记的荧光染料颜色不同B．四种标记引物的序列相同，但3'端标记的荧光染料颜色不同C．四种标记引物的序列不同，其5'端标记的荧光染料颜色也不同D．四种标记引物的序列不同，其3'端标记的荧光染料颜色也不同E．四种标记引物的序列不同，其2'端标记的荧光染料颜色也不同23. 下列有关多色荧光标记引物法的叙述中，不正确的是（）A．需将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的5'端B．四种引物的序列相同，但标记的荧光染料颜色不同C．A、T、C、G四个测序反应必需分管进行D．上样时需分别在不同泳道内电泳E．特定颜色荧光标记的引物则与特定的双脱氧核苷酸底物保持对应关系24. 一般来说，DNA测序图中，其横坐标和纵坐标的意义是（）A．横坐标代表荧光波长种类，纵坐标代表时间B．横坐标代表荧光波长种类和强度，纵坐标代表时间C．横坐标代表时间，纵坐标代表荧光波长种类D．横坐标代表时间，纵坐标代表荧光波长种类和强度E．横坐标代表荧光波长种类，纵坐标代表荧光波长强度25. 下列有关DNA自动测序仪自动进样器区功能的叙述中，不正确的是（）A．毛细管进入样品盘标本孔中进样依靠自动进样器的移动完成B．电极和毛细管一般均固定不动C．两级间极高的电势差可促进DNA分子在毛细管中很快泳动D．电极为电泳的正性电极E．样品盘有48孔和96孔两种，可一次性连续测试48或96个样本26. 下列有关DNA自动测序仪凝胶块区功能的叙述中，不正确的是（）A．电泳时缓冲液阀关闭B．电极为电泳的正性电极C．在分析每一个样品前，泵自动冲掉上一次分析用过的胶，灌入新胶D．注射器驱动杆可给注射器提供正压力，将注射器内的凝胶注入毛细管中E．玻璃注射器可储存凝胶高分子聚合物以及在填充毛细管时提供必要的压力27. 平板电泳型DNA测序仪的测序长度一般为（）A．600bp～900bpB．400bp～600bpC．200bp～400bpD．900bp～1000bpE．300bp～500bp28. 毛细管电泳型DNA测序仪的测序长度一般为（）A．600bp～900bpB．400bp～600bpC．200bp～400bpD．900bp～1000bpE．300bp～500bp【X型题】每题的备选答案中有两个或者两个以上正确答案。
一代测序相关总结
峰图与原因：.....16
Q-1.PCR 产物电泳检测条带单一，为什么测序结果说模板杂？ ......................................... 16 Q-2.什么是碱基缺失？ ............................................................................................................ 17 Q-3.什么是引物不纯？ ............................................................................................................ 17 Q-4.重复结构对测序有哪些影响？ ........................................................................................ 18 Q-5.什么是模板不单一？ ........................................................................................................ 18 Q-6.Poly 结构的测序结果是怎样的？ .................................................................................... 19 Q-7.含有回文结构的模板测序结果是怎样的？ .................................................................... 19 Q-8.测序峰图为前双峰的结果是什么样的？ ........................................................................ 20 Q-9.测序峰图为后双峰是什么样的？ .................................................................................... 20 Q-10.无信号的结果：信号值（ATGC 的平均值）皆小于 100 ............................................. 20 Q-11.飘峰：这是由于用 3.0 特殊试剂盒时碱基产生替代而出现碱基位移 ....................... 21 Q-12.没有任何干扰的结果 ...................................................................................................... 21
第14章全自动DNA测序仪与蛋白质自动测序仪教学指导
第十四章全自动DNA测序仪和蛋白质自动测序仪1．大体要求了解(1)全自动DNA测序仪的仪器结构(2)全自动DNA测序仪各组成部份的功能(3)全自动DNA测序仪的进展(4)蛋白质测序仪的结构及其各部件的功能(5)蛋白质测序仪的要紧应用熟悉(1)荧光标记DNA的检测原理(2)全自动DNA测序仪的常见故障及保护(3)全自动DNA测序仪的要紧应用掌握(1)双脱氧链结尾终止法测序原理(2)荧光标记引物法概念及特点(3)荧光标记终止底物法概念及特点(4)荧光标记引物法和荧光标记终止底物法的异同点(5)蛋白质测序仪的工作原理2．重点难点重点(1)双脱氧链结尾终止法测序原理(2)荧光标记引物法和荧光标记终止底物法的概念及二者的异同点(3)蛋白质测序仪的工作原理难点(1)荧光标记DNA的检测原理(2)全自动DNA测序仪的结构及仪器各组成部份的功能(3)全自动DNA测序仪的常见故障及保护3．教学学时建议2学时~4学时4．内容提要全自动DNA测序仪4.1.1 全自动DNA测序仪的工作原理DNA测序是指检测其一级结构--核苷酸的线性排列顺序。
目前DNA测序仪的工作原理要紧是利用Sanger双脱氧链结尾终止法或Maxam-Gilbert化学降解法。
双脱氧链结尾终止法测序原理：是利用DNA的体外合成进程－聚合酶链反映（PCR）。
反映体系中除加入4种dNTP外，还加入一种2'，3'-双脱氧核苷三磷酸（2',3'-ddNTP，N代表A、C、G、T任一碱基）。
与dNTP相较，ddNTP在脱氧核糖的3'位置上缺少一个羟基，反映进程中尽管能够与正在延伸的DNA链的结尾脱氧核糖3'-OH发生反映，形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中，但它们本身没有3'-OH，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的DNA链在此终止。
据此原理别离设计四个反映体系，每一反映体系中存在相同的DNA 模板、引物、四种dNTP和一种ddNTP(如ddATP)，那么新合成的DNA链在可能掺入正常dNTP的位置都有可能掺入ddNTP而致使新合成链在不同的位置终止。
蛋白质测序
ATZ-氨基酸转化成PTH-氨基酸的反应过程
在Edman 降解过程中，虽然在断裂和转化反应过程中都是
在TFA的条件下进行化学反应, 但这两步反应必须分别进
行。因为断裂反应是在无水三氟乙酸下进行的, 而转化反
应是在10%三氟乙酸水溶液中进行的。若两步合为一步反
应，使用无水三氟乙酸的反应条件，ATZ-氨基酸不会转化
去除n乙酰基封闭的氨基酸残基将吸附了蛋白质的pvdf膜条置于15ml离心管中用05pvp40封闭膜条防止其吸附蛋白酶pvp溶于100mmoll冰乙酸将膜用超纯水充分清洗后加入510g胰蛋白酶溶于100l01moll碳酸氢铵ph80内含10乙腈37酶解24小时离心管中的溶液移至另一个干净的离心管中用100l超纯水清洗膜条后将此清洗溶液与酶解后的溶液合并然后将此含有酶解多肽的溶液冷冻干燥
优点：试剂与溶剂都是通过氩气输送, 由阀门自动控制，可以避免 试剂之间的相互污染；反应在恒温器中进行, 保证了最佳反应条件, 重复性好；反应步骤分别在反应器或转化器中进行, 提高了反应效 率；样品用量少，回收率高
缺点：试剂纯度要求很高
3.4脉冲式液相蛋白质序列仪
脉冲式液相蛋白质序列仪是美国应用生物系统公司在
1.2蛋白质序列测定的重要意义 蛋白质序列测定主要可以提供以下几种参数: (1) 为DNA 序列分析找出探针，
(2) 作为蛋白质和肽类纯度鉴定
(3) 研究蛋白质的结构及功能之间的关系及蛋白质结构的
同源性。
(4) 确定蛋白质生物活性部位，酶与底物结合及催化位点
(5) 确定核酸密码中与蛋白质序列的起始位点及结束位点
2基本原理
2.1. Edman 降解法 蛋白质N—末端氨基酸序列测定核心是Edman 降解法。它 是将蛋白质一级结构中氨基酸从蛋白质的N—末端逐个地 降解下来, 并把它转化成为性质比较稳定的PTH氨基酸。 从蛋白质N—末端氨基酸降解下来到获得稳定的PTH氨基 酸的过程，称为Edman 降解。
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第十八章全自动DNA测序仪和蛋白质自动测序仪首页习题习题参考答案名词解释选择题简答题、名词解释1. 荧光标记引物法2 •荧光标记终止底物法3. 多色荧光标记引物法4. 多色荧光标记终止底物法5. Edman降解法6. San ger双脱氧链末端终止法7. 平板电泳型DNA测序仪&毛细管电泳型DNA测序仪9.缩微生物处理器二、选择题【A型题】在五个选项中选出一个最符合题意的答案（最佳答案）1. DNA的一级结构是指（）；A. DNA空间构象B. 核苷酸序列C. 碱基序列D. 氨基酸序列E. DNA双螺旋结构2. 下列有关测序反应体系反应原理的叙述中，错误的是（）A. 加入的核苷酸单体为2 '-脱氧核苷三磷酸B. 低温退火时，引物与模板形成双链区C. 沿着3 - 5的方向形成新链D. DNA聚合酶结合到DNA双链区上启动DNA的合成E. 形成的新生链与模板完全互补配对3. 双脱氧链末端终止法测序反应与普通体外合成DNA反应的主要区别是（）A. DNA聚合酶不同B. dNTP的种类不同C. dNTP的浓度不同D. 引物不同E. 双脱氧链末端终止法测序反应体系中还需加入d dNTP4. 下列荧光标记方法中，可以将A、C G T四个测序反应在同一管中完成而不影响测序结果的是（）A. 单色荧光标记引物法B. 单色荧光标记终止底物法C. 多色荧光标记引物法D. 多色荧光标记终止底物法E. 多色荧光标记法5•下列哪一荧光标记法，必需将A、T、C G四个测序反应分管进行，但可以合并在一个泳道内电泳（）A. 单色荧光标记引物法B. 单色荧光标记终止底物法C. 多色荧光标记引物法D. 多色荧光标记终止底物法E. 多色荧光标记法6. 毛细管电泳型测序仪电泳时仪器显示无电流，最常见的原因是由于（）A. 电极弯曲B. 电泳缓冲液蒸发使液面降低C. 毛细管未浸入缓冲液中D. 毛细管内有气泡E. 测序样本未注入毛细管中7. 毛细管电泳型测序仪电泳时产生电弧，主要原因是（）A. 电泳缓冲液漏出B. 电泳缓冲液配有误C. 电极、加热板或自动进样器上有灰尘沉积D. 测序样本纯化不完全，含有盐性成份E. 加热板温度过高8. 全自动DNA测序仪的主要应用范围，不包括（）A. 人类遗传病、传染病和癌症的基因诊断B. 法医的亲子鉴定和个体识别C. 生物工程药物的筛选D. 动植物杂交育种E. 新蛋白质的鉴定9. 蛋白质测序仪的基本工作原理，主要是利用（）A. Edman降解法B. 双脱氧链末端终止法C. 化学降解法D. 氧化—还原法E. 水解法10. 蛋白质测序仪主要检测（）A. 核苷酸序列B. 核糖核酸序列C. 碱基序列D. 氨基酸序列E. 脱氧核糖核酸序列11. 下列有关双脱氧链末端终止法测序原理的叙述中，不正确的是（）A. 其基本原理是利用DNA的体外合成过程B. 反应体系中需加入dNTP和ddNTPC. ddNTP可以形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中D. dNTP掺入后可导致新合成链在不同的位置终止E. 生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段12. 下列有关多色荧光标记终止底物法的叙述中，不正确的是（）A. 需将4种ddNTP分别用4种不同的荧光染料标记B. 标记和终止过程在同一时间完成C. A T、C、G四种反应可以在同一管中完成D. 可在一个泳道内完成电泳测序E. 荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同一DNA片段的两端13. 下列有关荧光标记DNA勺检测原理的叙述中，不正确的是（）A. 用于测序的产物绝大多数应为单链B. DNA片段上的荧光基团可吸收激光束提供的能量而发射出特征波长的荧光C. 两极间的电势差推动DNA片段从正极向负级泳动并达到相互分离D. 不同颜色的荧光与不同的碱基信息相对应E. 测序结果中，纵轴表示荧光波长种类和强度14. 下列有关Edman降解法基本原理的叙述中，错误的是（）A. PTC-多肽的生成是在弱碱性条件下B. PTC-多肽的生成反应需用过量的试剂使有机反应完全C. 在无水强碱的作用下，可使靠近PTC基的氨基酸环化，形成ATZ 衍生物和一个失去末端氨基酸的剩余多肽D. 剩余多肽链可以进行下一次以及后续的降解循环E. ATZ衍生物经水溶酸处理转化为PTH氨基酸15. 毛细管电泳型DNA测序仪电泳时仪器显示无电流，最常见的原因为（）A. 缓冲液配制错误B. 毛细管内有气泡C. 电泳缓冲液蒸发使液面降低，而未能接触到毛细管的两端D. 电极弯曲而无法浸入缓冲液中E. 加热板温度过高16. 在单纯以测定DNA序列为目的的全自动DNA测序仪中，广泛应用的原理是（）A. Edman降解法B. 双脱氧链末端终止法C. 化学降解法D. 氧化—还原法E. 水解法17. 双脱氧链末端终止法测序的基本原理是利用（）A．RT-PCRB．PCRC．Western BlotD．Southern BlotE.水解法18. 测序反应体系中加入的酶为（）A. 限制性内切酶B. RNA聚合酶C. DNA聚合酶D. DNA水解酶E. 反转录酶19. 在普通的体外合成DNA反应体系中，加入的核苷酸单体为（20.A.B.C.D.E.dAMP，dCMP，dADP，dCDP，dATP，dCTP，dGMP，dTMPdGDP，dTDPdGTP，dTTPddATP，ddCTP，ddGTP，ddTTPddADP，ddCDP，ddGDP，ddTDP双脱氧链末端终止法测序反应中除PCR反应体系成份外，还加入了（A. DNA聚合酶B. dNTPC. dNDPD. ddNTPE. ddNDP21.在DNA自动测序中广泛应用的示踪物是（）A.色素染料B. 同位素C. 电化学发光物质D.酶E.荧光素22. 下列有关多色荧光标记引物法标记引物的特性的叙述中，正确的是（）A. 四种标记引物的序列相同，但B. 四种标记引物的序列相同，但C. 四种标记引物的序列不同，其D. 四种标记引物的序列不同，其E. 四种标记引物的序列不同，其5端标记的荧光染料颜色不同3端标记的荧光染料颜色不同5端标记的荧光染料颜色也不同3端标记的荧光染料颜色也不同2端标记的荧光染料颜色也不同23. 下列有关多色荧光标记引物法的叙述中，不正确的是（）A. 需将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的5•端B. 四种引物的序列相同，但标记的荧光染料颜色不同C. A T、C、G四个测序反应必需分管进行D. 上样时需分别在不同泳道内电泳E. 特定颜色荧光标记的引物则与特定的双脱氧核苷酸底物保持对应关系24. 一般来说，DNA测序图中，其横坐标和纵坐标的意义是（）A. 横坐标代表荧光波长种类，纵坐标代表时间B. 横坐标代表荧光波长种类和强度，纵坐标代表时间C. 横坐标代表时间，纵坐标代表荧光波长种类D. 横坐标代表时间，纵坐标代表荧光波长种类和强度E. 横坐标代表荧光波长种类，纵坐标代表荧光波长强度25. 下列有关DNA自动测序仪自动进样器区功能的叙述中，不正确的是（）A. 毛细管进入样品盘标本孔中进样依靠自动进样器的移动完成B. 电极和毛细管一般均固定不动C. 两级间极高的电势差可促进DNA分子在毛细管中很快泳动D. 电极为电泳的正性电极E. 样品盘有48孔和96孔两种，可一次性连续测试48或96个样本26. 下列有关DNA自动测序仪凝胶块区功能的叙述中，不正确的是（）A. 电泳时缓冲液阀关闭B. 电极为电泳的正性电极C. 在分析每一个样品前，泵自动冲掉上一次分析用过的胶，灌入新胶D. 注射器驱动杆可给注射器提供正压力，将注射器内的凝胶注入毛细管中E. 玻璃注射器可储存凝胶高分子聚合物以及在填充毛细管时提供必要的压力27. 平板电泳型DNA测序仪的测序长度一般为（）A. 600bp〜900bpB. 400bp〜600bpC. 200bp〜400bpD. 900bp〜1000bpE. 300bp〜500bp28. 毛细管电泳型DNA测序仪的测序长度一般为（）A. 600bp〜900bpB. 400bp〜600bpC. 200bp〜400bpD. 900bp〜lOOObpE. 300bp〜500bp【X型题】每题的备选答案中有两个或者两个以上正确答案。
1. 目前DNA测序仪的工作原理，主要是利用（）A. Edman降解法B. 双脱氧链末端终止法C. 化学降解法D. 氧化—还原法E. 水解法2. 下列有关多色荧光标记引物法的叙述中，正确的是（）A. 需将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的3•端B. 四种引物的序列相同，但标记的荧光染料颜色不同C. A T、C、G四个测序反应必需分管进行D. 上样时需分别在不同泳道内电泳E. 特定颜色荧光标记的引物则与特定的双脱氧核苷酸底物保持对应关系3. 下列哪些荧光标记法必需将A T、C、G四个测序反应分管进行（）A. 单色荧光标记引物法B. 单色荧光标记终止底物法C. 多色荧光标记引物法D. 多色荧光标记终止底物法E. 多色荧光标记法4. 下列有关单色荧光标记法原理的叙述中，正确的是（）A. 需将A G C T四管反应分管进行B. 上样时需在不同泳道电泳C. 可用于标记ddNTP,也可用于标记引物D. 有可能因泳道间迁移率不同而影响测序精度E. 仅适用于标记ddNTP而不能标记引物5. 平板电泳型DNA测序仪电泳时仪器显示无电流，可能原因有（）A. 电极导线未接好或损坏B. 电泳缓冲液配制不正确C. 正极或负极铂金丝断裂D. 正极或负极的胶面未浸入缓冲液中E. 倒胶时有气泡形成6. 采用荧光标记终止底物法的测序反应体系中，包含（）A. DNA模板B. 引物C. dNTPD. ddNTPE. 水解酶7. 毛细管电泳型DNA测序仪电泳时仪器显示无电流，可能原因有（）A. 电泳缓冲液蒸发使液面降低，而未能接触到毛细管的两端B. 毛细管内有气泡C. 毛细管未浸入缓冲液中D. 电极弯曲而无法浸入缓冲液中E. 加热板温度过高8. 导致毛细管电泳型DNA测序仪电极弯曲的原因有（）A. 测序时未进行电极定标操作就直接执行电泳命令B. 自动进样器上有灰尘沉积C. 运行前未将样品盘归位D. 进行电极定标操作时X/Y轴归位尚未结束就运行Z轴归位E. 凝胶干燥而阻塞毛细管9. 平板电泳型DNA测序仪电泳时仪器显示无电流，可能原因有（）A. 电泳缓冲液配制不正确B. 电极导线未接好或损坏C. 正极或负极铂金丝断裂D. 正极或负极的胶面未浸入缓冲液中E. 电泳缓冲液蒸发使液面降低，而未能接触到毛细管的两端10. San ger双脱氧链末端终止法和Maxam-Gilbert化学降解法的共同点包括（）A. 反应体系中均有ddNTPB. 都是根据在某一固定的点开始核苷酸链的延伸，随机在某一个特定的碱基处终止C. 均产生A T、C G四组不同长度的一系列核苷酸链D. 均在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行片段的分离和检测E. 均可检测DNA的一级结构11. 在San ger双脱氧链末端终止法测序反应体系中，ddNTP与dNTP相比的异同点有（）A. ddNTP在脱氧核糖的5位置上缺少一个羟基B. ddNTP在脱氧核糖的3 •位置上缺少一个羟基C. DNA链在掺入dNTP的位置终止链的延伸D. 均可与正在延伸的DNA链的末端脱氧核糖3 -OH发生反应E. ddNTP不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键12. 下列有关Sanger双脱氧链末端终止法测序反应体系反应原理的叙述中，正确的是（）A. 加入的核苷酸单体包括dNTP和ddNTPB. 低温退火时，引物与模板形成双链区C. 沿着3 - 5的方向形成新链D. DNA聚合酶结合到DNA双链区上启动DNA的合成E. 形成的新生链与模板完全互补配对13. 下列有关DNA自动测序仪自动进样器区功能的叙述中，正确的是（）A. 毛细管进入样品盘标本孔中进样依靠自动进样器的移动完成B. 电极和毛细管一般均固定不动C. DNA分子在毛细管中泳动的动力来自于两级间极高的压力差D. 电极为电泳的正性电极E. 样品盘有48孔和96孔两种，可一次性连续测试48或96个样本14. 下列有关DNA自动测序仪凝胶块区功能的叙述中，正确的是（）A. 电泳时缓冲液阀打开B. 电极为电泳的负性电极C. 在分析每一个样品前，泵自动冲掉上一次分析用过的胶，灌入新胶D. 注射器驱动杆可给注射器提供正压力，将注射器内的凝胶注入毛细管中E. 玻璃注射器可储存凝胶高分子聚合物以及在填充毛细管时提供必要的压力15. 下列有关缩微生物处理器结构和功能特点的叙述中，正确的是（）A. 基本结构为2层玻璃薄片和2层聚二甲基硅氧烷薄片B. 其形状为圆盘状，直径仅10厘米C. 可完成纳升级标本的Sa nger DNA测序D. 微瓣膜的功能包括在热循环反应时封闭反应小室，为反应提供封闭的空间E. 毛细管电泳通道由上下来回迂回的U型管道构成，总长度为30cm三、问答题1 .简述双脱氧链末端终止法测序原理。