高效液相色谱法同时测定发酵调味料中六种尼泊金酯类防腐剂方法研究_李佳峻

取不同基质的空白 样 品 各 ３ 份，分 别 加 入 ６ 种 标 准 品 的 混 合 溶 液，使 其 含 量 分 别 为 ０．１，０．５， １．０ｍｇ／ｋｇ，按上 述 方 法 进 行 样 品 前 处 理。 每 个 处 理 重复６次，按１．２节 的 色 谱 条 件 对 加 标 样 品 提 取 液 中 的 ６ 种 目 标 化 合 物 定 量 ，考 察 方 法 的 回 收 率 和 精 密 度 。
总 第 ３８ 卷
ＣＨＩＮＡ ＣＯＮＤＩＭＥＮＴ
分析检测
ｅｓｔｅｒｓ）是国际上公 认 的 广 谱、高 效、低 毒 类 防 腐 剂，在 食品、化妆 品 和 医 药 等 领 域 中 广 泛 使 用 。 ［４－６］ 尼 泊 金 酯具有酚羟 基 结 构，抗 细 菌 性 能 比 苯 甲 酸、山 梨 酸 都 强 ，其 抑 菌 活 性 主 要 是 由 分 子 态 起 作 用 ，且 其 分 子 内 的 羧 基 已 被 酯 化 ，不 再 电 离 ，所 以 它 在 酸 性 和 碱 性 条 件 下 均有很好的抑菌效果 。 ［７］ 目前食品添加剂的超范 围 使 用现象严重，超量或 不 当 使 用 防 腐 剂 会 对 人 体 造 成 一 定 损 害 ，因 此 ，中 国 、加 拿 大 、日 本 和 欧 盟 等 许 多 国 家 和 国际组织对食品中尼泊金酯类防腐剂的使用制定了添 加 限 量 。 目 前 ，尼 泊 金 酯 类 化 合 物 的 测 定 方 法 主 要 有 高效 液 相 色 谱 法［８，９］、薄 层 色 谱 法［１０］、毛 细 管 电 泳 法［１１，１２］、气相色谱法 等 ［１３］ 。已报道的 文 献 方 法 大 多 针 对基质较单一的样品，且 只 测 定 其 中 少 数 几 种 尼 泊 金 酯，同时测定基质复 杂 食 品 中 多 种 尼 泊 金 酯 的 报 道 较 少。周建科等用液相色谱法检测食醋中的尼泊金甲、 乙 、丙 、丁 酯 ，取 得 不 错 的 效 果 ；曹 淑 瑞 等 建 立 了 同 时 测 定 蔬 菜 、水 果 、饮 料 等 食 品 中 ６ 种 尼 泊 金 酯 的 高 效 液 相 色谱法，该 方 法 以 固 相 萃 取 对 样 品 进 行 净 化，成 本 较 高 。 有 关 同 时 测 定 酱 油 、豆 瓣 、腐 乳 等 基 质 发 酵 调 味 料 中６种 尼 泊 金 酯 的 高 效 液 相 色 谱 测 定 方 法 鲜 见 报 道。 本 文 建 立 了 同 时 测 定 酱 油 、豆 瓣 、腐 乳 等 基 质 复 杂 的 发 酵 调 味 料 中 ６ 种 尼 泊 金 酯 的 高 效 液 相 色 谱 （ＨＰＬＣ）方 法，与已经报道的方 法 相 比，本 方 法 具 有 分 析 速 度 快， 灵 敏 度 高 且 前 处 理 简 单 、快 捷 等 优 点 。
甲醇、乙腈（色 谱 纯 ） 美 国 Ｔｅｄｉａ公 司；标 准 品： 尼泊金 甲 酯、尼 泊 金 乙 酯、尼 泊 金 丙 酯 德 国 Ｄｒ．Ｅｈ－ ｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ公 司 ；尼 泊 金 异 丙 酯 、尼 泊 金 丁 酯 、尼 泊 金 异 丁酯 美国 Ａｃｃｕｓｔａｎｄａｒｄ公司；其他试剂如未 特 殊 说 明 ，则 为 国 产 分 析 纯 。 １．２ 色 谱 分 析 条 件
准确 称 取 尼 泊 金 甲 酯、尼 泊 金 乙 酯、尼 泊 金 丙 酯、 尼泊金异丙 酯、尼 泊 金 丁 酯、尼 泊 金 异 丁 酯 标 准 品 各 １００ｍｇ（精确至０．０１ ｍｇ），用 色 谱 纯 的 甲 醇 溶 解 并 定 容至浓度为１０００ｍｇ／Ｌ 的标准储备液。 １．３．２ 标 准 曲 线 的 建 立
豆 瓣 、腐 乳 、酱 油 等 传 统 发 酵 调 味 品 因 其 独 特 的 风 味：丰富的营养以及 易 于 消 化 吸 收 等 特 点 深 受 消 费 者 的喜爱 。 ［１］ 国家标准［２］把调味品总共分为１７ 大 类，食
品添加剂使用卫生标准 规 ［３］ 定调味品中允许使用 的 防 腐 剂 和 抗 氧 化 剂 包 括 苯 甲 酸 及 其 钠 盐 、丙 酸 及 其 钠 盐 、 钙 盐 、尼 泊 金 酯 类 及 其 钠 盐 。尼 泊 金 酯 （ｎｉｐａｇｉｎ
收 稿 日 期 ：２０１３－０５－０３ ＊ 通 讯 作 者 作 者 简 介 ：杨 春 林 （１９８２－ ），男 ，工 程 师 ，硕 士 ，研 究 方 向 ：为 食 品 安 全 与 质 量 控 制 。
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２０１３年第１０期 中 国 调 味 品
取 标 准 储 备 液 适 量 ，用 流 动 相 （甲 醇 ∶ 乙 酸 铵 缓 冲 液为４０∶６０）稀 释 定 容 至 浓 度 为 ０．０１，１．００，１０．００， ５０．００，１００．００，３００．００，５００．００ ｍｇ／Ｌ 的 标 准 工 作 溶 液，取１０μＬ 进样测定峰面积，以质量浓度对峰面积做 标准曲线。 １．３．３ 样 品 的 提 取
１ 材料与方法
１．１ 仪 器 与 试 剂 高效液相色谱 仪 １２６０ｉｎｆｉｎｉｔｙ（配 自 动 进 样 系 统、
二极管阵列检 测 器 ） 美 国 Ａｇｉｌｅｎｔ公 司；Ｍｉｌｌｉ－Ｑ 超 纯水系统 美国 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司；氮吹仪 Ｎ－ＥＶＡＰ 美 国 Ｏｒｇａｎｏｍａｔｉｏｎ公 司；电 子 天 平 ＤＶ２１５ＣＤ（精 确 至 ０．００００１ｇ） 美国 Ｏｈａｕｓ公 司；超 声 波 清 洗 器 上 海 冠特超声仪器 有 限 公 司；冷 冻 离 心 机 ＣＲ ２２Ｇ 日 本 日立公司。
称取５．０ｇ样品于１５０ｍＬ三角瓶中，加入２ｍＬ 饱 和 ＮａＣｌ溶液充分润湿，再加１０ｍＬ 乙腈于４０ ℃条件下 超声提取１５ｍｉｎ，再涡旋振荡２ｍｉｎ，重复提取２次，合并 上层清液，放 置 于 冰 箱 内 急 冻 ３０ ｍｉｎ 后，１００００ｒ／ｍｉｎ 离 心１０ｍｉｎ，上清液转移至鸡心瓶中用氮气吹至近干，加入 ５００μＬ 甲醇溶解 残 渣，用 流 动 相 定 容 至 ２．０ ｍＬ，经 ０．２２ μｍ 微孔滤膜过滤，供 ＨＰＬＣ分析。 １．４ 回 收 率 与 精 密 度 实 验
中 图 分 类 号 ：ＴＳ２６４．２ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１０００－９９７３（２０１３）１０－００８４－０４
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－９９７３．２０１３．１０．０２１
Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｘ Ｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｅｓｔｅｒｓ ｉｎ
２０１３年第１０期 中 国 调 味 品
总 第 ３８ 卷
ＣＨＩＮＡ ＣＯＮＤＩＭＥＮＴ
分析检测
高效液相色谱法同时测定发酵调味料中 六种尼泊金酯类防腐剂方法研究
李佳峻，杨春林＊ ，胡强，吴蔚
（乐山市产品质量监督检验所，四川 乐山 ６１４０００）
摘要：建 立 了 同 时 测 定 发 酵 调 味 料 中 ６ 种 尼 泊 金 酯 类 防 腐 剂 的 高 效 液 相 色 谱－二 极 管 阵 列 检 测 器 （ＨＰＬＣ－ＤＡＤ）定量分析方法。样品用乙腈 超 声 提 取，采 用 ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８色 谱 柱 （４．６ ｍｍ ×１００ｍｍ，３．５μｍ）分离，甲 醇／乙 酸铵 水 溶 液梯度 洗脱，二 极管阵列 检测 器于 波 长 ２５６ｎｍ 处 检 测，外 标法定量。结果表明：６种尼泊金酯 在 ０．０１～５００．００ ｍｇ／Ｌ 浓 度 范 围 内，与 峰 面 积 呈 良 好 的 线 性 关 系 （ｒ≥０．９９９８）；检出限为０．０００６～０．００１８ｍｇ／ｋｇ（Ｓ／Ｎ＝３）；６ 种 尼 泊 金 酯 各 添 加 水 平 在 酱 油、腐 乳 及 酱 腌菜中的回收率为８２．５％～１０３．２％，ＲＳＤ 为１．２％～８．４％。 关 键 词 ：高 效 液 相 色 谱 法 ；发 酵 调 味 料 ；尼 泊 金 酯
色谱 柱：ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８ （４．６ ｍｍ× １００ｍｍ，３．５μｍ）；流动相：Ａ 为甲醇，Ｂ 为乙酸铵缓冲
溶液（ｐＨ 值为６．５），使 用 前 过 ０．２２μｍ 滤 膜；梯 度 洗 脱程序：０～６ ｍｉｎ，Ｂ 从 ４０％ 线 性 上 升 至 ５８％；６～ １５ｍｉｎ，Ｂ 为５８％；１５～１８ ｍｉｎ，Ｂ 从 ５８％ 线 性 下 降 至 ４０％。柱温４０ ℃，流 速 ０．８ ｍＬ／ｍｉｎ，进 样 量 １０μＬ； 检 测 波 长 ２５６ｎｍ。 １．３ 试 验 方 法 １．３．１ 标 准 储 备 液 配 制
ｄｉｍｅｎｔ ｂｙ ＨＰＬＣ－ＤＡＤ ｉｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒｓ ａｒｅ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｌｌｙ ｅｘｔｒａｃ－
ｔｅｄ ｂｙ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ．Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ａｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｏｎ ａ ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８ｃｏｌｕｍｎ （４．６ ｍｍ×１００ ｍｍ，３．５μｍ），ｅｌｕｔｅｄ ｂｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｄｅ－ ｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ａｔ ｔｈｅ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ２５６ｎｍ，ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｅｔｈ－ ｏｄ．Ｔｈｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｉｓ ｌｉｎｅａｒ ｏｖｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒａｎｇｅ ｏｆ ０．０１～５００．００ ｍｇ／Ｌ（ｒ≥０．９９９８） ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ ｓｉｘ ｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒｓ ａｒｅ ０．０００６～０．００１８ｍｇ／ｋｇ（Ｓ／Ｎ＝３）．Ｔｈｅ ｒｅ－ ｃｏｖｅｒｉｅｓ ｏｆ ｓｉｘ ｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒｓ ｆｒｏｍ ｓｏｙ ｓａｕｃｅ，ｓｕｆｕ ａｎｄ ｐｉｃｋｌｅｓ ａｒｅ ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ８２．５％ ａｎｄ １０３．２％ ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ ａｒｅ １．２％ ～８．４％ ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｃｏｎｄｉｍｅｎｔ；ｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ