REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化
红曲霉的研究进展_侯敏
42 卷 11 期
侯 敏等 红曲霉的研究进展
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提高［9 － 10］。 1． 2 红曲霉及桔霉素 1995 年，法国学者 Blanc 发现某些 红曲霉菌株代谢会产生对人畜有害的真菌毒素———桔霉素， 从而引起了人们对红曲霉中桔霉素问题的关注。桔霉素有 显著的肾脏毒性，毒性较明显，能引起试验动物的肾脏肿大、 尿量增多、肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等症状，并有致 癌性而且还能引发基因突变［11］。但是，并非所有的红曲菌 都会产生桔霉素，例如日本用红色红曲霉、毛红曲霉、紫色红 曲霉可以生产出不含桔霉素的产品，而且桔霉素的生产与否 和生产方法有关，生产工艺条件决定桔霉素的含量。我国有 关红曲 色 素 产 品 的 国 家 标 准 有 3 个，即 2005 年 颁 布 的 GB15961 － 2005《红曲红色素》、2008 年颁布的 GB4926 － 2008 《红曲米（ 粉） 》和 2009 年 3 月 1 日正式实施的 GB T5009． 222 － 2008《红曲类产品中桔青霉素的测定》，另外还有一个功能 性红曲的轻工行业标准 QB / T2847 － 2007。但是现有的 2 个 红曲色素产品的国家标准中，均没有提及色素产品中桔霉素 的限量指标［12］。对于桔霉素的检测，因为在红曲产品中含 量较低，而且受其他物质干扰严重，测定的难度较大。目前， 桔霉素的检测方法有： 高效液相色谱法、酶联免疫法、抑菌圈 法、薄层层析法。其中，HPLC 测定桔霉素含量具有灵敏度 高、检测时间快速、定性定量准确可靠的特点。李志强等应 用 HPLC 方法在桔霉素浓度为 0． 005 mg / L 时仍可检出，而在 0． 002 mg / L 时检测不到桔霉素，因此确定 HPLC 方法对桔霉 素的最低检出限为 0． 005 mg / L［13］。 1． 3 红曲霉及洛伐他汀 洛伐他汀是最初从红曲霉菌中发 现的生理活性物质，用于治疗高胆固醇症，能阻止动脉硬化 发展，减少心肌梗塞等的发病危险［14］。因为其可以针对病 因，且具有疗效显著、毒副作用少、耐受性好等优点而受到广 泛重视和好评。临床证明，该物质有明显的降低血清总胆固 醇（ TC） 及血清中甘油三脂（ TG） 和升高血清高密度脂蛋白胆 固醇（ HDL-C） 的作用，该物质的特征为抗阻碍胆固醇合成系 统中的限速酶 HMG-CoA （ 3-羟基-3-甲基 － 戊二酰 CoA） 、还 原酶（ 羟戊二酰辅酶 A） ，且抑制作用最高［15］。虽然红曲霉 洛伐他汀的产量较低，但由于红曲菌在食品方面的安全性， 所以研究如何提高红曲菌洛伐他汀的发酵水平具有现实意 义。一般可以通过选育高产洛伐他汀菌株和改善发酵工艺 条件 2 种途径来实现。在菌种选育方面，刘月等利用种间双 亲灭活原生质体融合选育的融合株，以甘油为原料液，洛伐 他汀产量达到 1 752． 46 mg / L［16］； 张良利用紫外-LiCl 复合诱 变方法得到的菌株洛伐他汀的产量为 250． 54 μg / g［17］。目 前，发酵生产洛伐他汀多采用液体深层发酵工艺，红曲霉为 丝状真菌专性好氧，由于菌丝发达其游离细胞在搅拌罐中进 行深层发酵时，在罐中易形成菌丝团，引起氧气及其他营养 物质的传递困难，或由于菌丝缠绕于搅拌叶上，使搅拌阻力 增加，从而使产品产率低于传统固态发酵。王克明等采用聚 乙烯醇和海藻酸钠双载体固定红曲菌细胞，采用气升式生物 反应器发酵洛伐他汀，产量高达 2． 59 ～ 2． 68 mg / ml［18］。BoBo Zhang 等利用 4 mm × 4 mm × 4 mm 的琼脂块作为固体发
红曲霉高产菌株筛选及固态发酵研究
红曲霉高产菌株筛选及固态发酵研究红曲霉（Monascus）是一种重要的食品、药用真菌，具有制作红曹和红曲色素的能力。
红曲霉色素是一种天然的食品着色剂，被广泛应用于食品加工和制药工业。
而红曲霉也是一种可以用于生物转化生产脂质和多糖等重要化合物的微生物。
红曲霉高产菌株的筛选及固态发酵研究对于提高红曲霉发酵产物的产量和质量具有重要意义。
一、红曲霉高产菌株筛选1. 优良菌株的选择红曲霉菌株的筛选是红曲生物技术研究的关键之一。
目前，常用的筛选方法是通过对菌株的培养条件、生理生化特性以及代谢产物等进行评价，从中选取表现出高产、高效、高稳定性的优良菌株。
在筛选过程中，需要考虑到不同菌株之间的遗传变异、发酵产物的生产能力等因素，综合评价后确定优良菌株。
2. 根据菌株代谢产物进行筛选红曲霉菌株具备多样的代谢产物，包括红曲素、黄酮素、黄酮甾醇和多糖等。
在筛选优良菌株时，可以通过检测这些代谢产物的合成能力，选择产量高、纯度高、质量好的优良菌株。
还可以采用高通量筛选技术，如基因组学、代谢组学和蛋白质组学等方法，加快筛选速度，提高筛选效率，为选取优良菌株提供科学依据。
3. 利用基因工程技术筛选优良菌株利用基因工程技术，可以对红曲霉的代谢途径进行调控和优化，从而提高其生产产物的能力。
通过转录组分析和基因功能鉴定，可以筛选出与产物合成相关的关键基因，并通过基因工程技术对这些基因进行改造、调控，从而提高产物的产量和质量。
二、红曲霉固态发酵研究1. 固态发酵的基本原理固态发酵是指微生物在不同有机物基质中进行生长和代谢过程。
相比于液态发酵，固态发酵具有体系复杂、生物多样性丰富、营养物质丰富等优点。
对于红曲霉来说，固态发酵可以有效提高产物的产量和质量，加快生长速度，促进代谢物的生成，增强抗胁迫能力。
2. 固态发酵的工艺优化固态发酵的工艺优化是红曲霉生物技术研究的重中之重。
优化工艺可以从发酵基质的选择、培养基成分、发酵条件等方面入手，通过对各项参数进行调控和优化，提高红曲霉的产物产量和质量。
红曲霉色素及代谢物研究进展
红曲霉色素及代谢物研究进展林凤; 李慧敏; 王玉梅; 毛瑞丰【期刊名称】《《中国调味品》》【年(卷),期】2019(044)012【总页数】4页(P188-191)【关键词】红曲霉; 红曲色素; 代谢产物【作者】林凤; 李慧敏; 王玉梅; 毛瑞丰【作者单位】广西大学轻工与食品工程学院南宁 530004【正文语种】中文【中图分类】TS264.4红曲霉属于子囊菌，能产生耐热的子囊孢子，且红曲霉能在缺氧、高酸和高盐浓度下生存[1]。
红曲霉可用于酿酒(黄酒、果酒和药酒)、制作发酵食品(腐乳、酱菜)、食品着色及保健品等。
红曲产品在亚洲地区广为流传，常见的为由大米发酵制成的红曲米，简称红曲，其被当做功能性食品已有数千年历史[2]。
红曲最初被记载于《饮膳正要》，别名为赤曲、丹曲、红米、福曲、红大米、红槽等。
《本草纲目》中对其评价为“此乃人窥造化之巧者也”，“奇药也”。
此外，在《本草衍义补遗》、《医林纂要》等中药典籍中也均对红曲有记载。
为研究红曲米中真菌多样性，采用以宏基因高通量测序技术为导向的真菌鉴定和检测方法对广西不同地区的红曲米进行检测，探究红曲米中真菌的群落种类、数量，获取其多样性信息。
1 材料和方法1.1 样品来源红曲米：采集于广西大瑶山不同地区。
1.2 试剂和仪器E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit试剂盒：OMEGA公司；Qubit 3.0 DNA检测试剂盒：Life公司；2×Taq Master Mix：Vazyme公司；MagicPure Size Selection DNA Beads：TransGen公司。
台式离心机 Thermo Fisher公司；漩涡混合器海门市其林贝尔仪器制造有限公司；混匀型干式恒温器深圳拓能达科技有限公司；电泳仪电源、电泳槽北京市六一仪器厂；凝胶成像系统美国UVP公司；Qubit® 3.0荧光计 Invitrogen公司；PCR 仪 BIO-RAD公司；移液器 Eppendorf公司。
红曲霉T_DNA插入转化库中桔霉素突变子的筛选
红曲霉T2DNA插入转化库中桔霉素突变子的筛选3丁月娣 邵彦春 许一平 陈福生33(华中农业大学食品科技学院农业部食品安全评价重点开放实验室 武汉 430070)摘要:以农杆菌介导法建立的红曲霉T2DNA转化库为实验材料,采用抑菌圈法从50000多个转化子中筛选出200株桔霉素突变子的候选菌株,用高效液相色谱法进一步筛选得到53株与出发菌株相比产桔霉素能力发生显著变化的突变子,其红曲中桔霉素含量介于0104～154157μg/g之间。
进一步分析了突变子的红曲色价,发现突变子产桔霉素能力与产色素能力之间有一定的相关性。
这些研究结果为进一步从分子水平上探讨红曲霉产桔霉素和色素等次生代谢产物之间的关系提供了材料和基础。
关键词:红曲霉,桔霉素,高效液相色谱,农杆菌介导的DNA转化中图分类号:TS20213 文献标识码:A 文章编号:025322654(2006)0420052206Screen i n g C itr i n i n M utan ts from the Tran sforman ts L ibrary of M onascus ruberM27by Agrobacterium2m ed i a ted D NA tran sfer3D I N G Yue2D i SHAO Yan2Chun XU Yi2Ping CHEN Fu2Sheng(College of Food Science and Technology,Huazhong A gricultural U niversity,Key L ab Food SecurityEstinate of M inistry of Agriculture,W uhan430070)Abstracts:200citrinin mutants were screened with the inhibiti on zone method fr om the transfor mants library ofM onascus ruber M27by Agrobacterium2mediate DNA transfer,which contains more than5,000transf or ma2nts1Then53mutants,whose citrinin contents ranged fr om0104μg/g t o154157μg/g in the red fer mented rice(RFR),were achieved by high perfor mance liquid chr omat ography(HP LC)1Col or values of RFR p repared bythese mutants were als o detected1The results showed that there was a positive correlati on bet w een the citrinin con2tent and the col or value a mong the mutants1These results p r ovide materials and research bases for ferrther studyingthe relati onshi p bet w een the p r oducti on of citrinin and p ig ment of M onascus ruber at molecular level1Key words:M onascus ruber,Citrinin,HP LC,A grobacterium2mediated DNA transfer红曲霉(M onascus s pp1)是制备红曲的微生物菌种[1]。
红曲霉的研究进展_侯敏
方面红曲霉中的洛伐他汀具有降胆固醇、降血脂的作用； 在 工业上，红曲霉产生的莫纳斯叮 A（ Monascidin A） 、安卡内酯 （ Ankalactone） 、几丁质酶和糖肽类物质等可以开发应用为安 全的食品防腐剂［6］。 1． 1 红曲霉及红曲色素 红曲色素以粮食为原料，是红曲 菌培养过程的代谢产物，一般情况下，以大米为原料，生产红 曲米的回收率可达 50% ～ 60% ，红曲米的色素含量可达 5% ～ 10% ，而其他天然色素在原料中的含量则大多在 3% 以 下［7］。红曲色素结构有 10 种，其中 6 种为醇溶性的色素，另 外 4 种为水溶性色素［8］。红曲霉发酵所产生红曲色素有 20% ～ 30% 分泌到发酵液中（ 即胞外色素） ，70% ～ 80% 在菌 体内（ 胞内色素） 。胞内色素多为醇溶性色素，而胞外色素多 为水溶性色素。对红曲霉发酵液中红曲色素的提取可以采 用活性炭（ 粉状） 吸附法、等电点共沉淀法等。活性炭吸附法 是先用活性炭吸附发酵液中的色素，然后用乙醇进行洗脱。 研究发现，以粉状活性炭吸附后，以 95% 的乙醇在 50 ℃ 洗脱 30 min 效果较好，但活性炭吸附的色素不易洗脱，色素回收 率较低。等电点共沉淀法是通过调节发酵液的 pH 到豆蛋 白的等电点，从而使与豆蛋白结合的水溶性色素一起沉淀下 来，然后将发酵液离心沉淀，浓缩后获水溶性红曲色素。该 方法在 pH 3． 1 ～ 3． 5 范围内沉淀效果较好，对色素的提取率 较活性炭 吸 附 法 较 高。菌 体 内 红 色 素 提 取 主 要 是 浸 提 法。 但湿菌体直接用有机溶剂浸提的效果不够理想，浸提液中色 素含量很低，且对浸提液进行浓缩时，因水含量过高，有机溶 剂蒸发慢。对菌体进行烘干处理后进行色素提取的效果更 好，菌体烘干后有机溶剂对色素的浸提速度明显高于湿菌 体，浸提液色价高，且缩短了浓缩时间，避免了红曲色素发生 部分聚合反应，以及提取液的沉淀变性。菌体内色素大多为 醇溶性色素，乙醇和丙酮提取率较高 ，但从经济和毒性方面 考虑 ，乙醇较为适宜 ，且易回收，便于色素的干燥浓缩，其中 以 60% 的乙醇于 60 ℃ 恒温处理 1 h 获得了最大的菌体色素 提取率。在用 乙 醇 提 取 菌 体 色 素 的 同 时，加 入 一 定 量 的 钠 盐、钙盐或其混合物，均可以提高提取效果，可能是由于 2 种 金属离子的存在改变了细胞膜的通透性，从而使色素提取率
红曲霉原生质体的制备、再生及其遗传转化系统
收稿日期 ! 修回日期 ! ! & & $ & ’ ! %" ! & & $ & ( ! $ 作者简介 ! 周礼红 ! $ 女$ 贵州人 $ 江南大学在读博士 $ 研究方向 # 真菌分子生物学 &+ # ) * " ’%" , . / 0 0 1 2 1 3 4 # #"5 . 1 3 3 6 7 3 -6 7 8 通讯作者 ! 诸葛 ! 健 &9 # # : 0 % ( , ’ ) & , ’ % % ( ( $ !’ + , . / 0 / . 8 2 1 4 3 = . / 0 6 7 3 : "1 ; <
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红曲霉代谢产物的研究进展_李雪梅
红曲霉是目前世界上能产食用色素的重要微生 物之一。在我国已有 1 000 多年药食两用的历史。 法国学者 van Tieghem 在 1884 年建立了红曲霉属的 分类。在分类上，红曲霉属真菌界、子囊菌门、子 囊菌纲、 散囊菌目、 红曲菌科、 红曲霉属 （Monascus van Tieghem ） 。目前，美国培养物物种保藏中心 （ ATCC ） 已 有 58 个 红 曲 菌 株 。 根 据 1983 年 Hawksworth 和 Pit 的分类系统，大部分红曲菌株属 于 3 种：丛毛红曲霉 M. pilosus K. Satô ex D. Hawksw. & Pitt、紫色红曲霉 M. purpureus Went 及 安卡红曲霉 M. anka Nakazawa et Satô[1]。 20 世纪 70 年代，日本 Endo 首次从红色红曲 霉 M. rubber van Tieghem 中分离出活性物质红曲可 林（monacolin K）以来， 日本、 美国、 韩国、中国 等众多专家学者对红曲进行了广泛而深入的研究， 取得了令人瞩目的成果。尤其是通过红曲霉代谢产 不断挖掘出生物活 物的成分分析及其活性研究[3-4]， 性物质及新化合物。红曲霉的代谢产物主要有红曲 色素、monacolins 类化合物、桔霉素及其他代谢产
收稿日期：2010-11-11
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物等。关于红曲化学成分及活性研究的报道较多， 本文对其研究进展进行综述。 1 红曲色素 红曲色素是红曲霉在生长代谢过程中产生的天 然色素。红曲色素是多种色素成分的混合物，以颜 色的不同可分为黄色素、橘黄色素及红色素 3 类； 以溶解性不同可分为水溶性色素和脂溶性色素两 类。红曲色素作为一种天然色素，安全性高，经急 慢性毒性实验及致畸、突变实验都证明其无毒，故 红曲色素已广泛应用于各种食品和化妆品中[5-7]。 1932 年，Nishikawa 首次从紫色红曲霉等培养 物中分离了黄色和橘黄色晶体。随后将红曲色素用 有机溶剂提取分离，经元素定性、熔点测定，紫外、 红外和可见光吸收光谱以及核磁共振谱分析，认为 红曲色素是由化学结构不同、性质相近的红、黄、 红曲色素属 橘黄 3 类不同色素组成的混合色素[5-6]。 于聚酮类（polyketide）色素，主要由 6 种结构相近 的成分组成，其中，monascin（1）与 ankaflavin（2） 为黄色素，rubropunctatin（3）与 monascorubrin（4）
纳米材料介导植物遗传转化的研究进展
纳米材料介导植物遗传转化的研究进展作者：杨得民曹婷婷吕敏陈楠来源：《上海师范大学学报·自然科学版》2024年第01期DOI：10.3969/J.ISSN.1000-5137.2024.01.016收稿日期：2023-11-01基金项目：国家自然科学基金（21974089）作者简介：杨得民（1999—），男，硕士研究生，主要从事纳米材料用于植物基因表达调控等方面的研究. E-mail：156***************** 通信作者：陈楠（1979—），女，研究员，主要从事纳米生物效应、纳米荧光探针及纳米药物等方面的研究. E-mail：**************.cn引用格式：杨得民，曹婷婷，吕敏，等. 纳米材料介导植物遗传转化的研究进展［J］. 上海师范大学学报（自然科学版中英文），2024，53（1）：120‒128.Citation format：YANG D M，CAO T T，LYU M，et al. Research progress of nanomaterials in plant genetic transformation ［J］. Journal of Shanghai Normal University （Natural Sciences），2024，53（1）：120‒128.摘要：植物遗传转化对于改善农作物的性状，培育高产、优质、多抗性的新品种，从而降低农药和肥料的使用量等至关重要. 传统的遗传转化方法存在着诸多局限性，如物种的不普适性，植物组织易被破坏，成本高、耗时长和转化效率低等. 近几年，纳米材料介导的植物遗传转化策略逐渐被研究和尝试，并显示出了不受物种限制、生物相容性良好和操作简单等一系列优势. 文章对常用的传统遗传转化方法进行了总结，重点介绍了近年来多种纳米材料在植物遗传转化中的研究和应用进展，并讨论和展望了纳米材料在植物遗传转化应用领域的挑战和发展前景.关键词：纳米材料；纳米基因载体；植物遗传转化；基因表达调控中图分类号：Q 943.2 文献标志码：A 文章编号：1000-5137（2024）01-0120-09Abstract：Plant genetic transformation is crucial for improving quality of crop straits，cultivating new varieties with high yield，improved quality，and multi-resistance，thereby reducing the use of pesticides and fertilizers. Traditional genetic transformation approaches have great limitations，including the non-universality of species，susceptibility to plant tissue destruction，high cost，long time consumption，and low transformation efficiency. In recent years，strategies for plant genetic transformation mediated by nanomaterials have been developed and attempted，and have shown a series of advantages such as no species limitation，good biocompatibility，and simple operation. This review introduces the commonly used traditional genetic transformation methods and focuses on the recent research and application progress of various nanomaterials in plant genetic transformation. Finally，the challenges and prospects in the field of plant genetic transformation are discussed.Key words：nanomaterials；nano-gene vetors；plant genetic transformation；regulation of gene expression0 引言植物遺传转化指利用物理、化学方法或借助载体，将外源遗传物质导入植物受体细胞，并整合到受体细胞的染色体中，从而调控目的基因在受体植物中的表达水平，达到改变植物性状以及培育植物新品种的目的. 植物遗传转化技术是植物基因工程的关键，传统的植物遗传转化方法主要包括农杆菌介导法、聚乙二醇（PEG）介导法、脂质体介导法、基因枪法、花粉管通道法和超声波法等.尽管植物遗传转化技术取得了许多突破，但仍远落后于动物基因工程的发展. 植物细胞的细胞壁由纤维素、半纤维素、果糖和少量结构蛋白构成［1］，参与调节细胞的形状和扩张、控制组织凝聚以及抵御微生物或病原体等生理功能［2］，细胞壁的存在使外源物质难以进入细胞内部，仅允许小粒径的生物分子通过，极大程度地阻碍了外源基因载体进入植物细胞内部发挥功能. 因此，许多现有的基因转导技术很难被应用于植物遗传转化［3］.20世纪末，随着纳米技术的迅速发展，纳米材料因其尺寸小、比表面积大、生物兼容性较好等优点被广泛用作基因载体应用于生物医学领域［4］. 近年来，研究者们尝试将纳米材料应用于植物遗传转化领域，并展示出了巨大的潛力. 目前，纳米材料已经被作为核酸载体应用于烟草、棉花、水稻等植物［5］. 本文介绍了两种最常用的传统遗传转化方法以及纳米材料介导的基因传递系统的研究现状，并且讨论了不同种类纳米材料在介导植物基因传递方面的特点和优势.1 常用的植物遗传转化手段1.1 农杆菌介导法农杆菌侵染植物后，借助毒力蛋白将T-DNA插入植物细胞中. 毒力蛋白协助T-DNA从农杆菌转运至植物细胞壁和质膜，并促进T-DNA整合到植物核基因组中，从而实现遗传转化. 1977年，CHILTON等［6］首次利用农杆菌介导法实现了质粒DNA（plasmids DNA，pDNA）向植物细胞中的有效递送. 自此以后，农杆菌介导的植物遗传转化得到了迅速发展，目前已广泛应用于多种双子叶植物，如大豆［7］、棉花［8］、番茄［9］和烟草［10］等. 农杆菌介导的遗传转化依赖于化学物质诱导，如植物受伤后释放的酚类物质乙酰丁香酮和α酰羟基乙酰丁香酮［11］，能够诱导农杆菌吸附在植物伤口处，从而使农杆菌T-DNA发生转移，实现基因转化. 由于这些酚类物质通常不存在于单子叶植物，导致农杆菌介导的遗传转化应用范围受到限制，遗传转化效率很低. 1984年，HERNALSTEENS等［12］首次利用农杆菌成功实现了单子叶植物石刁柏的遗传转化，为实现农杆菌介导的单子叶植物遗传转化提供了可能性. 近年来，农杆菌介导的转化已经被成功应用于少部分农作物，如水稻［13］、小麦［14］和玉米［15］.农杆菌介导法是目前研究最为成熟、应用最为广泛的植物遗传转化方法. 其优势在于操作相对简单，重复性高且成本较低. 然而，该方法也存在一些明显的缺陷：（1）由于农杆菌的侵染特点，大多数单子叶植物都不会自然地被农杆菌所侵染；（2）单子叶植物的转化效率远低于双子叶植物；（3）由于农杆菌侵染后，外源DNA被随机整合到植物基因组中，很可能导致植物出现不理想的农艺性状.1.2 基因枪法1987年，KILEIN等［16］首次开发了biolistic技术，即基因枪技术，也称为粒子轰击技术，并首次使用该技术将携带DNA的钨颗粒轰击进入洋葱表皮细胞，成功转化了洋葱表皮细胞［17］. 随着研究人员对物理参数、环境和生物条件的优化，改进后的基因枪法能够转化不同的受体材料，包括原生质体［18］、愈伤组织［19］、花粉［20］等. 与农杆菌介导法相比，基因枪法较少受到植物种属的限制，适用范围更广，如CAIMI等［21］成功将解淀粉芽孢杆菌的SacB基因转入单子叶植物玉米，促进了具有较高经济价值的果聚糖合成，显示出了该方法在农作物育种改良中的应用潜力. 基于其受体植物物种的多样性，操作简便以及可以转化高达150 kb分子量的DNA等优点，基因枪法在植物基因工程中得到了广泛的发展. 然而基因枪法也存在局限性：一方面粒子轰击系统所使用的设备及材料（如金颗粒和基因枪等）较为昂贵，增加了遗传转化的成本；另一方面，粒子轰击容易对植物造成损伤，导致其转化效率降低，以及转化后的DNA片段容易发生断裂，进一步限制了转化的成功率.2 纳米材料介导的植物遗传转化与传统的植物遗传转化方法相比，纳米材料介导的基因递送策略具有多种优势，例如细胞毒性较低、操作简单和不受物种限制且能同时递送多种生物分子等. 此外，纳米材料还具有易于设计和改性的独特优势，例如，纳米材料可经过表面修饰后，实现针对特定植物细胞器（叶绿体［22］和线粒体［23］）的靶向递送. 目前，已有多种纳米材料被报道应用于植物体内的基因表达调控，主要包括碳基、纳米金、层状双氢氧化物（LDH）和肽载体等纳米材料.2.1 碳基纳米材料在植物中遗传转化的应用碳基纳米材料因具有出色的光学性能、良好的生物相容性、丰富的表面官能团等优点，被广泛应用于电子、传感、纳米医学等各个领域. 碳纳米管、碳点、石墨烯和氧化石墨烯等是碳基纳米材料家族的主要成员. 已有大量研究聚焦于碳基纳米材料与哺乳动物之间的相互作用，然而将其应用于植物基因递送的研究目前仍处于起步阶段，其作为植物遗传转化中的基因递送载体的效率和相关机制仍在探索中.2.1.1 碳点碳点是直径小于10 nm的零维碳纳米材料，因其优异的光学性能，良好的生物相容性而被广泛应用于生物医学、光催化等领域. 近年来，碳点在植物方面的研究主要聚焦于其对于植物生长、发育［24］、光合作用［25］和抵抗生物胁迫［26］的影响等. 碳点的小粒径和表面丰富的官能团为其负载核酸，穿过细胞壁提供了可能性，因此研究人员尝试将碳点应用于植物核酸递送中. 碳点通常因表面带羟基或羧基而呈负电荷，WANG等［27］将聚乙烯亚胺（PEI）引入碳点表面，使其带正电荷，并通过静电吸附携带pDNA，在水稻、小麦、绿豆等多种植物中实现了基因递送和功能的表达，成功诱导水稻叶片组织产生了潮霉素抗性，如图1（a）所示. SCHWARTZ等［28］使用PEI作为碳源，通过溶剂热反应合成了用于吸附siRNA（小干扰RNA，small interfering RNA）的水溶性碳点，该纳米复合物进一步与非离子型表面活性剂混合制备成制剂，使用低压喷雾方法喷洒至烟草和番茄叶片上，沉默了绿色荧光蛋白（GFP）和内源性基因镁螯合酶H亚基（Magnesium Chelatase H，CHLH，一种叶绿素合成关键酶），如图1（b）所示，成功观察到叶片白化，并通过定量聚合酶链反应证明了相关基因mRNA转录水平的降低，如图1（c）所示.尽管植物遗传转化技术取得了许多突破，但仍远落后于动物基因工程的发展. 植物细胞的细胞壁由纤维素、半纤维素、果糖和少量结构蛋白构成［1］，参与调节细胞的形状和扩张、控制组织凝聚以及抵御微生物或病原体等生理功能［2］，细胞壁的存在使外源物质难以进入细胞内部，仅允许小粒径的生物分子通过，极大程度地阻碍了外源基因载体进入植物细胞内部发挥功能. 因此，许多现有的基因转导技术很难被应用于植物遗传转化［3］.20世纪末，随着纳米技术的迅速发展，纳米材料因其尺寸小、比表面积大、生物兼容性较好等优点被广泛用作基因载体应用于生物医学领域［4］. 近年来，研究者们尝试将纳米材料应用于植物遗传转化领域，并展示出了巨大的潜力. 目前，纳米材料已经被作为核酸载体应用于烟草、棉花、水稻等植物［5］. 本文介绍了两种最常用的传统遗传转化方法以及纳米材料介导的基因传递系统的研究现状，并且讨论了不同种类纳米材料在介导植物基因传递方面的特点和优势.1 常用的植物遗传转化手段1.1 农杆菌介导法农杆菌侵染植物后，借助毒力蛋白将T-DNA插入植物细胞中. 毒力蛋白协助T-DNA从农杆菌转运至植物细胞壁和质膜，并促进T-DNA整合到植物核基因组中，从而实现遗传转化. 1977年，CHILTON等［6］首次利用农杆菌介导法实现了质粒DNA（plasmids DNA，pDNA）向植物细胞中的有效递送. 自此以后，农杆菌介导的植物遗传转化得到了迅速发展，目前已广泛应用于多种双子叶植物，如大豆［7］、棉花［8］、番茄［9］和烟草［10］等. 农杆菌介导的遗传转化依赖于化学物质诱导，如植物受伤后释放的酚类物质乙酰丁香酮和α酰羟基乙酰丁香酮［11］，能够诱导农杆菌吸附在植物伤口处，从而使农杆菌T-DNA发生转移，实现基因转化. 由于这些酚类物质通常不存在于单子叶植物，导致农杆菌介导的遗传转化应用范围受到限制，遗传转化效率很低. 1984年，HERNALSTEENS等［12］首次利用农杆菌成功实现了单子叶植物石刁柏的遗传转化，为实现农杆菌介导的单子叶植物遗传转化提供了可能性. 近年来，农杆菌介导的转化已经被成功应用于少部分农作物，如水稻［13］、小麦［14］和玉米［15］.农杆菌介导法是目前研究最为成熟、应用最为广泛的植物遗传转化方法. 其优势在于操作相对简单，重复性高且成本较低. 然而，该方法也存在一些明显的缺陷：（1）由于农杆菌的侵染特点，大多数单子叶植物都不会自然地被农杆菌所侵染；（2）单子叶植物的转化效率远低于双子叶植物；（3）由于农杆菌侵染后，外源DNA被随机整合到植物基因组中，很可能导致植物出现不理想的农艺性状.1.2 基因枪法1987年，KILEIN等［16］首次开发了biolistic技术，即基因枪技术，也称为粒子轰击技术，并首次使用该技术将携带DNA的钨颗粒轰击进入洋葱表皮细胞，成功转化了洋葱表皮细胞［17］. 随着研究人员对物理参数、环境和生物条件的优化，改进后的基因枪法能够转化不同的受体材料，包括原生质体［18］、愈伤组织［19］、花粉［20］等. 与农杆菌介导法相比，基因枪法较少受到植物种属的限制，适用范围更广，如CAIMI等［21］成功将解淀粉芽孢杆菌的SacB基因转入单子叶植物玉米，促进了具有较高经济价值的果聚糖合成，显示出了该方法在农作物育种改良中的应用潜力. 基于其受体植物物种的多样性，操作简便以及可以转化高达150 kb分子量的DNA等优点，基因枪法在植物基因工程中得到了广泛的发展. 然而基因枪法也存在局限性：一方面粒子轰击系统所使用的设备及材料（如金颗粒和基因枪等）较为昂贵，增加了遗传转化的成本；另一方面，粒子轰击容易对植物造成损伤，导致其转化效率降低，以及转化后的DNA片段容易发生断裂，进一步限制了转化的成功率.2 纳米材料介导的植物遗传转化与传统的植物遗传转化方法相比，纳米材料介导的基因递送策略具有多种优势，例如细胞毒性较低、操作简单和不受物种限制且能同时递送多种生物分子等. 此外，纳米材料还具有易于设计和改性的独特优势，例如，纳米材料可经过表面修饰后，实现针对特定植物细胞器（叶绿体［22］和线粒体［23］）的靶向递送. 目前，已有多种纳米材料被报道应用于植物体内的基因表达调控，主要包括碳基、纳米金、层状双氢氧化物（LDH）和肽载体等纳米材料.2.1 碳基纳米材料在植物中遗传转化的应用碳基纳米材料因具有出色的光学性能、良好的生物相容性、丰富的表面官能团等优点，被广泛应用于电子、传感、纳米医学等各个领域. 碳纳米管、碳点、石墨烯和氧化石墨烯等是碳基纳米材料家族的主要成员. 已有大量研究聚焦于碳基纳米材料与哺乳动物之间的相互作用，然而将其应用于植物基因递送的研究目前仍处于起步阶段，其作为植物遗传转化中的基因递送载体的效率和相关机制仍在探索中.2.1.1 碳点碳点是直径小于10 nm的零维碳纳米材料，因其优异的光学性能，良好的生物相容性而被广泛应用于生物医学、光催化等领域. 近年来，碳点在植物方面的研究主要聚焦于其对于植物生长、发育［24］、光合作用［25］和抵抗生物胁迫［26］的影响等. 碳点的小粒径和表面丰富的官能团为其负载核酸，穿过细胞壁提供了可能性，因此研究人员尝试将碳点应用于植物核酸递送中. 碳点通常因表面帶羟基或羧基而呈负电荷，WANG等［27］将聚乙烯亚胺（PEI）引入碳点表面，使其带正电荷，并通过静电吸附携带pDNA，在水稻、小麦、绿豆等多种植物中实现了基因递送和功能的表达，成功诱导水稻叶片组织产生了潮霉素抗性，如图1（a）所示. SCHWARTZ等［28］使用PEI作为碳源，通过溶剂热反应合成了用于吸附siRNA（小干扰RNA，small interfering RNA）的水溶性碳点，该纳米复合物进一步与非离子型表面活性剂混合制备成制剂，使用低压喷雾方法喷洒至烟草和番茄叶片上，沉默了绿色荧光蛋白（GFP）和内源性基因镁螯合酶H亚基（Magnesium Chelatase H，CHLH，一种叶绿素合成关键酶），如图1（b）所示，成功观察到叶片白化，并通过定量聚合酶链反应证明了相关基因mRNA转录水平的降低，如图1（c）所示.尽管植物遗传转化技术取得了许多突破，但仍远落后于动物基因工程的发展. 植物细胞的细胞壁由纤维素、半纤维素、果糖和少量结构蛋白构成［1］，参与调节细胞的形状和扩张、控制组织凝聚以及抵御微生物或病原体等生理功能［2］，细胞壁的存在使外源物质难以进入细胞内部，仅允许小粒径的生物分子通过，极大程度地阻碍了外源基因载体进入植物细胞内部发挥功能. 因此，许多现有的基因转导技术很难被应用于植物遗传转化［3］.20世纪末，随着纳米技术的迅速发展，纳米材料因其尺寸小、比表面积大、生物兼容性较好等优点被广泛用作基因载体应用于生物医学领域［4］. 近年来，研究者们尝试将纳米材料应用于植物遗传转化领域，并展示出了巨大的潜力. 目前，纳米材料已经被作为核酸载体应用于烟草、棉花、水稻等植物［5］. 本文介绍了两种最常用的传统遗传转化方法以及纳米材料介导的基因传递系统的研究现状，并且讨论了不同种类纳米材料在介导植物基因传递方面的特点和优势.1 常用的植物遗传转化手段1.1 农杆菌介导法农杆菌侵染植物后，借助毒力蛋白将T-DNA插入植物细胞中. 毒力蛋白协助T-DNA从农杆菌转运至植物细胞壁和质膜，并促进T-DNA整合到植物核基因组中，从而实现遗传转化. 1977年，CHILTON等［6］首次利用农杆菌介导法实现了质粒DNA（plasmids DNA，pDNA）向植物细胞中的有效递送. 自此以后，农杆菌介导的植物遗传转化得到了迅速发展，目前已广泛应用于多种双子叶植物，如大豆［7］、棉花［8］、番茄［9］和烟草［10］等. 农杆菌介导的遗传转化依赖于化学物质诱导，如植物受伤后释放的酚类物质乙酰丁香酮和α酰羟基乙酰丁香酮［11］，能够诱导农杆菌吸附在植物伤口处，从而使农杆菌T-DNA发生转移，实现基因转化. 由于这些酚类物质通常不存在于单子叶植物，导致农杆菌介导的遗传转化应用范围受到限制，遗传转化效率很低. 1984年，HERNALSTEENS等［12］首次利用农杆菌成功实现了单子叶植物石刁柏的遗传转化，为实现农杆菌介导的单子叶植物遗传转化提供了可能性. 近年来，农杆菌介导的转化已经被成功应用于少部分农作物，如水稻［13］、小麦［14］和玉米［15］.农杆菌介导法是目前研究最为成熟、应用最为广泛的植物遗传转化方法. 其优势在于操作相对简单，重复性高且成本较低. 然而，该方法也存在一些明显的缺陷：（1）由于农杆菌的侵染特点，大多数单子叶植物都不会自然地被农杆菌所侵染；（2）单子叶植物的转化效率远低于双子叶植物；（3）由于农杆菌侵染后，外源DNA被随机整合到植物基因组中，很可能导致植物出现不理想的农艺性状.1.2 基因枪法1987年，KILEIN等［16］首次开发了biolistic技术，即基因枪技术，也称为粒子轰击技术，并首次使用该技术将携带DNA的钨颗粒轰击进入洋葱表皮细胞，成功转化了洋葱表皮细胞［17］. 随着研究人员对物理参数、环境和生物条件的优化，改进后的基因枪法能够转化不同的受体材料，包括原生质体［18］、愈伤组织［19］、花粉［20］等. 与农杆菌介导法相比，基因枪法较少受到植物种属的限制，适用范围更广，如CAIMI等［21］成功将解淀粉芽孢杆菌的SacB基因转入单子叶植物玉米，促进了具有较高经济价值的果聚糖合成，显示出了该方法在农作物育种改良中的应用潜力. 基于其受体植物物种的多样性，操作简便以及可以转化高达150 kb分子量的DNA等优点，基因枪法在植物基因工程中得到了广泛的发展. 然而基因枪法也存在局限性：一方面粒子轰击系统所使用的设备及材料（如金颗粒和基因枪等）较为昂贵，增加了遗传转化的成本；另一方面，粒子轰击容易对植物造成损伤，导致其转化效率降低，以及转化后的DNA片段容易发生断裂，进一步限制了转化的成功率.2 纳米材料介导的植物遗传转化与传统的植物遗传转化方法相比，纳米材料介导的基因递送策略具有多种优势，例如细胞毒性较低、操作简单和不受物种限制且能同时递送多种生物分子等. 此外，纳米材料还具有易于设计和改性的独特优势，例如，纳米材料可经过表面修饰后，实现针对特定植物细胞器（叶绿体［22］和线粒体［23］）的靶向递送. 目前，已有多种纳米材料被报道应用于植物体内的基因表达调控，主要包括碳基、纳米金、层状双氢氧化物（LDH）和肽载体等纳米材料.2.1 碳基纳米材料在植物中遗传转化的应用碳基纳米材料因具有出色的光学性能、良好的生物相容性、丰富的表面官能团等优点，被广泛应用于电子、传感、纳米医学等各个领域. 碳纳米管、碳点、石墨烯和氧化石墨烯等是碳基纳米材料家族的主要成员. 已有大量研究聚焦于碳基纳米材料与哺乳动物之间的相互作用，然而将其应用于植物基因递送的研究目前仍处于起步阶段，其作为植物遗传转化中的基因遞送载体的效率和相关机制仍在探索中.2.1.1 碳点碳点是直径小于10 nm的零维碳纳米材料，因其优异的光学性能，良好的生物相容性而被广泛应用于生物医学、光催化等领域. 近年来，碳点在植物方面的研究主要聚焦于其对于植物生长、发育［24］、光合作用［25］和抵抗生物胁迫［26］的影响等. 碳点的小粒径和表面丰富的官能团为其负载核酸，穿过细胞壁提供了可能性，因此研究人员尝试将碳点应用于植物核酸递送中. 碳点通常因表面带羟基或羧基而呈负电荷，WANG等［27］将聚乙烯亚胺（PEI）引入碳点表面，使其带正电荷，并通过静电吸附携带pDNA，在水稻、小麦、绿豆等多种植物中实现了基因递送和功能的表达，成功诱导水稻叶片组织产生了潮霉素抗性，如图1（a）所示. SCHWARTZ等［28］使用PEI作为碳源，通过溶剂热反应合成了用于吸附siRNA（小干扰RNA，small interfering RNA）的水溶性碳点，该纳米复合物进一步与非离子型表面活性剂混合制备成制剂，使用低压喷雾方法喷洒至烟草和番茄叶片上，沉默了绿色荧光蛋白（GFP）和内源性基因镁螯合酶H亚基（Magnesium Chelatase H，CHLH，一种叶绿素合成关键酶），如图1（b）所示，成功观察到叶片白化，并通过定量聚合酶链反应证明了相关基因mRNA转录水平的降低，如图1（c）所示.尽管植物遗传转化技术取得了许多突破，但仍远落后于动物基因工程的发展. 植物细胞的细胞壁由纤维素、半纤维素、果糖和少量结构蛋白构成［1］，参与调节细胞的形状和扩张、控制组织凝聚以及抵御微生物或病原体等生理功能［2］，细胞壁的存在使外源物质难以进入细胞内部，仅允许小粒径的生物分子通过，极大程度地阻碍了外源基因载体进入植物细胞内部发挥功能. 因此，许多现有的基因转导技术很难被应用于植物遗传转化［3］.20世纪末，随着纳米技术的迅速发展，纳米材料因其尺寸小、比表面积大、生物兼容性较好等优点被广泛用作基因载体应用于生物医学领域［4］. 近年来，研究者们尝试将纳米材料应用于植物遗传转化领域，并展示出了巨大的潜力. 目前，纳米材料已经被作为核酸载体应用于烟草、棉花、水稻等植物［5］. 本文介绍了两种最常用的传统遗传转化方法以及纳米材料介导的基因传递系统的研究现状，并且讨论了不同种类纳米材料在介导植物基因传递方面的特点和优势.1 常用的植物遗传转化手段1.1 農杆菌介导法农杆菌侵染植物后，借助毒力蛋白将T-DNA插入植物细胞中. 毒力蛋白协助T-DNA从农杆菌转运至植物细胞壁和质膜，并促进T-DNA整合到植物核基因组中，从而实现遗传转化. 1977年，CHILTON等［6］首次利用农杆菌介导法实现了质粒DNA（plasmids DNA，。
农杆菌介导的紫色红曲霉遗传转化体系的建立和优化
性检 测 ， 明 ＴＤ Ａ成 功插 入 红 曲 霉基 因组 Ｄ Ａ 中 ， 证 —Ｎ Ｎ 开能 稳 定 遗 传 。最 后 ， 过 形 态观 察 筛选 出 ８株 变 异 较 通
ｔｒ ｕ ｈ ｏ ｔｍｉｉｇ ｖ ｒｏ ｓｔａ ｓｅ ｒｎ ａ ｔｒ ｎ ｔ ｓｓｕ ｙ． Ｓ ｏ ｅ ｆＭ ｏ ａ ｃ ｓ ｃ ｌｕ ｅ ｎ ＰＤＡ ｒ ｏｌ ｃｅ ｈ ｏ ｇ ｐｉ ｚｎ ａ ｉｕ ｒｎ ｆ ｒｉ ｇ ｆｃｏ ｓｉ ｈｉ ｔｄ ｐ ｒ ｓｏ ｎ ｓ ｕ ｕｔ ｒ ｄ ｏ ｗｅ ｅｃ ｌｅ ｔ ｄ２１ ｄ
６ ８
微 生物 学 杂 志 ２ １ 年 ９月第 ３ ００ ｏ卷 第 ５期 Ｊ Ｕ Ｎ ＬＯ Ｃ Ｏ Ｉ Ｌ Ｇ ｅｔ ２ １ ｏ．０Ｎ ． Ｏ Ｒ Ａ ＦＭＩＲ ＢＯ Ｏ ＹＳ ｐ． ０ ０Ｖ １ ｏ５ ３
农 杆 菌 介 导 的紫 色 红 曲霉 遗 传 转 化 体 系 的建 立 和 优 化
蔡 琪敏 ，蒋冬 花 ，嵇 豪 ， 丽精 蓝
（ 浙江 师 范大 学 化 学 与 生命 科 学 学 院 ， 江 金 华 浙 ３ １０ ） ２０ ４
摘
要
通 过优 化 各 种 转 化 因 素 ， 立 了根 癌 农 杆 茵 （ ｇｏ ａ ｔ ｉｍ ｔｍ ｆ ｃ ｎ ） 导 红 曲 霉 （ ｎ ｓｕ ） 高 建 Ａ ｒｂ ｃ ｒ ｕ ｅ ｉ ｓ 介 ｅｕ ａｅ Ｍｏ ａｃｓ 的
Ａｂ ｔａ ｔ Ａ ｈｇ —ｆ ｃｉｅＡ ｒｂ ｃ ｒ ｍ ｕ ｆ ｃ ｎ Ａ ）ｍｅ ｉｔｄＭｏ ａｃｓｔ ｎ ｆｒ ｔ ｎｓｓｅ ａ ｓ ｂｉ ｅ ｓｒｃ ｉｈｅ ｅ ｔ ｇ ｏａ ｔ ｉ ｔｍｅａｉ ｓ（ ｔ 一 ｄａｅ ｎ ｓｕ ａ ｓ ｍａｉ ｙｔｍ ｗ ｓｅｔ ｌ ｈ ｄ ｖ ｅｕ ｅ ｒ ｏ ｏ ａ ｓ
红曲菌转化子性状分析及分子验证
关键词 ： 红曲菌 ； 突变体 库 ； 转化子 ； 曲色素 ； 氨基丁酸 红 一
中 图分 类 号 ：９ Ｑ３ 文 献 标 识 码 ： Ａ
Ｃｈａ ａ ｔｒｓｉ ｎａｙ ｉ ｎｄ ｍ ｏ ｅ ｕ ａ ｅ ｉ ｃ ｔｏ ｆ ｒ ｃｅ ｉｔｃ ａ ｌ ｓｓａ ｌｃ ｌ ｒ ｖ ｒｆ ａ ｉ ｎ ｏ ｉ
ｍｅ ｃ ｎ ｅｅ ｕｅ ｓ ｍ ｔ ｉ ｓ ｅｐｅｅ ｔ ｉｅ ｔ ｎｆｒ ｎｓ ｗｔ ｉｎｆ ａ ｔｃ ａ ｇｓ ｗ ｒ ｓｌ ｔ ｆ ｉ ｓｗ ｒ ｓｄ ａ ａｅ ａ ，９ ｒｓｒｓｎａ ｖ ｒ ｓ ｍａｔ ｉ ｓ ｉｃｎ ｈ ｎｅ ｅｅ ｅ ｃ ｄ ａｅ ｒｌ ｔ ａ ｏ ｈ ｇｉ ｅｅ
对其进行 了分 子验 证和遗传稳定性检测 ， 证明转化子基 因组 Ｄ Ａ中含有 ＴＤ Ａ插入 片段 ， Ｎ —Ｎ 并能稳定 遗传 ． 在
此基础上 ， 采用 乙醇提取法和 改 良的ห้องสมุดไป่ตู้色谱法分别对转化 子的主要代 谢产物 红 曲色 素和 一 氨基 丁酸 （ Ａ ｉ － ｍ —
ｎｂ ｔ ｉ Ａ ｉ， Ａ Ａ） ｏ ｕ ｒ ｃ Ｇ Ｂ 进行 了分析 ， 现突变株产生次级代谢产 物的能力有不 同程度 的变化． ｙｃ ｄ 发
文章编号 ：０ １５ ５ （０ ２ 叭－ ０ －６ １０ －０ １ ２ １ ） ０１４０
红 曲菌 转 化 子 性 状 分 析及 分 子 验 证
蔡 琪敏 ， 庄 静 娜 ， 魏 银 文 ， 吴 寒 华 ， 崔 宇辉 ， 曹丽凌 ， 蒋冬花
（ 江师 范 大学 化 学与 生命科 学学 院 ， 江 金 华 浙 浙
ｓ ｏ ｄ ｔ ａ ｈ ｒ ｒ ＤＮＡ ｎ ｅ ｔｏ ｎ ｔａ ｓｏ ｍａ ｔ ｅ ｏ ．Ｔｈ ｏ ｇ ｔ ｂ ｌｔ ｘ ｍｉ ａ ｉｎ，ａｌ９ ｒ ｓ ｒ — ｈ ｗｅ ｈ ｔｔ ｅ ｅｗｅ ｅ Ｔ－ ｉ ｓ ｒｉｎｓｉ ｒ ｎ ｆｒ ｎ ｓｇ ｎ ｍｅ ｒ ｕ ｈ ｓａ ｉｉ ｅ ａ ｎ ｔ ｙ ｏ ｌ ｅ ｐ ｅ ｓ ｎｔｔｖ ｒ ｎ ｆ ｒ ｎ ｓ ｃ ｕ ｄ ｂ ｔ ａ ｉｙ ｉ ｈ ｒｔｄ． Ｂａ ｅ ｎ ｔ ｉ ｅ ａ ｉｅ ｔａ ｓｏ ｍａ ｔ ｏ ｌ ｅ ｓｅ ｄ ｌ ｎ ｅ ｉｅ ｓ ｄ ｏ ｈ ｓ，ｔ ｉ ｔｂ ｌｔｓ ｏ ｅ ｐ ｅ ｅ ｔ ｔ ｅ ｗｏ ｍａｎ ｍｅ ａ ｏ ｉｅ ｆ９ ｒ ｓ ｒ ｓ ｎ ａ ｉ ｖ
核盘菌通过类似整联蛋白SSITL...
核盘菌通过类似整联蛋白（SSITL）抑制寄主的抗病反应目 录摘 要 (I)ABSTRACT (IV)缩略词表 (VIII)1. 前言综述 (1)1.1 核盘菌的危害及其防治 (1)1.1.1 核盘菌的危害及其生物学特性 (1)1.1.2 作物菌核病的防治研究 (1)1.2 植物病原菌与寄主植物的互作 (5)1.2.1 植物天然的的物理及生理生化防卫屏障 (5)1.2.2 植物的先天免疫系统 (6)1.2.3 植物的后天免疫系统 (10)1.2.4 植物的非寄主抗性 (13)1.2.5 不同类型植物病原菌的侵染策略以及互作方式 (14)1.2.6 核盘菌的侵染策略 (16)1.3基因功能研究的策略 (19)1.3.1丝状真菌的遗传转化的研究进展 (19)1.3.2基因的超标达、敲除和沉默 (20)1.3.3 蛋白质的定位 (24)1.4 Integrin以及Integrin–like基因的研究进展 (26)1.4.1 整联蛋白的结构 (27)1.4.2 整联蛋白的信号传导 (29)1.4.3整联蛋白在微生物中的生物学功能 (30)1.5 本项研究的目的和意义 (32)2. 材料与方法 (33)2.1 菌株及植物材料 (33)2.2 基因的生物信息学分析 (33)2.3 核酸的实验操作 (34)2.3.1 DNA的提取 (34)2.3.2 质粒的提取 (34)2.3.3 总RNA的提取 (35)2.3.4 RT和Real–Time PCR (35)2.3.5 Northern blot (36)2.4 蛋白质的实验操作 (37)2.4.1 SSITL的原核表达 (37)2.4.2 抗体血清的制备、效价（ELISA）以及特异性（Western blot）的检测 (37)2.4.3 SSITL的免疫胶体金亚细胞定位 (39)2.4.4 核盘菌侵染洋葱表皮过程中SSITL的免疫荧光定位 (40)2.5 相关载体的构建 (40)2.6 ATMT介导的真菌和植物转化 (41)2.7 生物学特性的实验研究 (43)2.7.1 生长速度、致病力、菌丝顶端分支以及菌落形态的观察 (43)华中农业大学2012届博士研究生学位论文2.7.2 菌核的培养、大小及重量的测定和菌核萌发的研究 (43)2.7.3 核盘菌产草酸能力的测定 (44)2.7.4 核盘菌侵染拟南芥叶片过程的观察 (45)2.8 SSITL与植物诱导抗性的关系 (45)2.8.1 核盘菌侵染拟南芥过程中SSITL基因的表达情况 (45)2.8.2 核盘菌侵侵染拟南芥过程中拟南芥局部抗性的动态变化 (45)2.8.3 核盘菌侵侵染拟南芥过程中拟南芥系统抗性的动态变化 (46)2.8.4 SSITL在植物中表达对植物的抗病性的影响 (46)3. 结果与分析 (47)3.1 SSITL的生物信息学分析 (47)3.1.1 SSITL的序列分析 (47)3.1.2 SSITL蛋白的同源比对分析及高级结构预测 (49)3.2 SSITL对核盘菌生物学特性的影响 (53)3.2.1 SSITL基因在核盘菌不同生长时期的表达 (53)3.2.2 SSITL基因沉默对核盘菌生物学特性的影响 (53)3.3 SSITL抗体的制备以及免疫胶体金亚细胞定位 (61)3.3.1 SSITL的原核诱导表达 (61)3.3.2 抗血清效价以及特异性测定 (63)3.3.3 SSITL蛋白的亚细胞定位 (63)3.4 SSITL基因在核盘菌与植物互作过程中的作用 (67)3.4.1 核盘菌侵染拟南芥时，SSITL基因的表达情况 (67)3.4.2 核盘菌SSITL对拟南芥局部防卫反应的影响 (68)3.4.3 核盘菌SSITL对拟南芥系统防卫反应的影响 (70)3.4.4 SSITL在寄主植物中瞬时表达对植物抗病性的影响 (74)3.4.5 SSITL在寄主植物中组成型表达对植物抗病性的影响 (79)3.4.6 SSITL的表达对烟草的影响 (81)4. 讨论 (83)4.1 SSITL基因生物学功能的深入探讨 (83)4.1.1 SSITL基因的序列分析 (83)4.1.2 SSITL基因的功能分析 (85)4.2 SSITL参与抑制植物诱导抗性 (87)4.2.1 SSITL基因在核盘菌侵染过程中被诱导表达 (88)4.2.2 SSITL参与抑制植物的局部抗性 (88)4.2.3 SSITL参与抑制植物的系统抗性 (89)4.2.4 SSITL基因在植物中表达后，植物的抗性受到抑制 (90)4.3 研究SSITL的互作蛋白以及作用机理 (90)4.4 结论与展望 (92)5. 参考文献 (94)附录： (116)博士期间发表的论文 (121)致 谢 (122)核盘菌通过类似整联蛋白（SSITL）抑制寄主的抗病反应摘 要核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）属于子囊菌门，是一种世界性分布的典型的死体营养型病原真菌。
基因工程在食品行业中的应用
作业11：RNA干涉(RMAi)基因沉默(gene silencing) 是指转基因植物中特定基因由于种种原因不表达或表达量很低的遗传现象，是近十多年来在转基因植物中发现的一种后生遗传现象.基因沉默大体可以分为两类:位置效应引起的基因沉默和同源依赖的基因沉默。
其中，同源依赖的基因沉默又可以分为转录水平的基因沉默(transeript ional genesilencing, TCS)和转录后水平的基因沉默(post transcriptional gene silencing,PTCS). 前者通常与DN甲基化有关，表现为anRVI不能正常合成，造成基因失活。
后者虽能合成aRV,但随后被降解而不能积累，并同时诱导与外源基因同源的内源性基因沉默。
许多研究表明，转录后水平的基因沉默是引起基因沉默的主要方式。
近年来,随着转录后基因沉默机制的深入探讨,人们能够利用它有目的使特定基因降低表达或不表达。
马铃薯(Solanum tuberosum L. )淀粉是一种重要的食品和工业原料。
尤其是马铃薯直链淀粉，因其特殊的理化性质而被广泛应用。
然而，目前生产上推广的马铃薯栽培品种的直链淀粉含量仅为总淀粉含量的17%，因此，培育高直链淀粉品种对于扩大马铃薯的应用范围和提高其经济价值将具有重要的意义。
用RNA干扰技术(RNA interfence, RMAI) ，以淀粉分支酶(StarchBranching Enzyme, SBE) 基因sbe A和sbe B为靶标进行同时干扰，以期待选有出马铃薯高直链淀粉的新品系，在生产上有其积极的生态意义和经济意义。
2：实验技术路线1:克隆到淀粉分支酶(SBE) 基因: sbe A和sbe B的部分片段。
测序结果表明克隆的sbe A 序列大小为1510该序列与GnBank中已公布的序列的同源性为99%.克隆的she B序列大小为3020,该序列与GnBank中已公布的序列的同源性为9%。
红曲霉产红曲色素工艺优化
红曲霉产红曲色素工艺优化作者：郑春明梅璐来源：《安徽农业科学》2017年第17期摘要[目的]优化红曲米生产工艺，提高红曲米红曲色素含量。
[方法]以加水量（A）、灭菌温度（B）、灭菌时间（C）、浸泡时间（D）作为试验因素，设计4因素3水平正交试验，优化米饭制作方式。
[结果]4种因素均对红曲菌产红曲色素产量具有极显著影响，最优组合为A1B2C2D2，即加水量30 mL、灭菌温度121 ℃、灭菌时间23 min、浸泡时间24 h，在此条件下红曲色阶达2 884 U/g。
[结论]该研究对红曲米生产企业具有实践指导意义。
关键词红曲霉；红曲色素；正交试验中图分类号TS264.4文献标识码A文章编号0517-6611（2017）17-0062-02Abstract[Objective] To optimize rice making process and improve the content of monascus pigment. [Method] Selecting water addition （A）， sterilization temperature （B）， sterilization time（C），soaking time （D） as experimental factors， L9 （34） orthogonal test was used to optimize rice making process. [Result] Four factors all had very significant effect on the yield of monascus pigments ， the optimal combination was A1B2C2D2， namely water addition of 30 mL，sterilization temperature of 121 ℃， sterilization time of 23 min， immersion time of 24 h. The levels of monascus reached 2 884 U/g in this condition.[Conclusion] The study has great practical significance for monascus rice production enterprises.Key wordsMonascus；Monascus pigment；Orthogonal test基金项目浙江省大学生科技创新活动计划（新苗人才计划）项目（2014R461005）。
红曲多糖的提取与发酵工艺的优化
红曲多糖的提取与发酵工艺的优化
红曲多糖的提取与发酵工艺的优化
通过对3种常用红曲霉液体培养发酵产生多糖的比较分析,选出红曲霉高产茵3.470 1.用正交法研究不同条件对红曲霉生长的影响,从中选出红曲霉液体深层发酵的优化培养基;大米浆,NaNO3 0.15%,MgSO4·7H2O 0.15%,KH2PO4 0.25%.温度35 ℃,培养96 h,产生红曲多糖3.53 g/L,比初始条件高出1.89倍.
作者：李秀岩魏健孙振雷作者单位：长春师范学院生命科学学院,吉林长春,130032 刊名：安徽农业科学ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF ANHUI AGRICULTURAL SCIENCES 年，卷(期)：2006 34(21) 分类号：Q936 关键词：红曲霉多糖发酵工艺。
根瘤农杆菌介导的紫色红曲菌遗传转化体系的研究
根瘤农杆菌介导的紫色红曲菌遗传转化体系的研究
丁兴;嘉晓勤;周立平;张菲菲
【期刊名称】《中国酿造》
【年(卷),期】2009(000)008
【摘要】通过构建根瘤农杆菌介导的红曲菌遗传转化体系,将含有桔霉素生物合成基因同源片段的T-DNA导入紫色红曲菌Monascus purpureus SM005的子囊孢子中,以期对产桔霉素的关键酶基因pksCT进行定向敲除.优化得到的遗传转化系统为进一步对红曲菌进行分子生物学操作提供了一条高效可行的途径.
【总页数】4页(P66-69)
【作者】丁兴;嘉晓勤;周立平;张菲菲
【作者单位】浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州,310014;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州,310014;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州,310014;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州,310014
【正文语种】中文
【中图分类】Q933
【相关文献】
1.两株紫色红曲菌根癌农杆菌介导的T-DNA转化子的生物学特性 [J], 曹丽凌;齐育平;梁帅帅;施晓莉;蒋冬花
2.农杆菌介导的紫色红曲霉遗传转化体系的建立和优化 [J], 蔡琪敏;蒋冬花;嵇豪;蓝丽精
3.根癌农杆菌介导转化红曲菌及转化子发酵性能的研究 [J], 王璐;许赣荣;王武
4.根癌农杆菌介导的少孢节丛孢菌遗传转化体系研究 [J], 黄运福;贡莎莎;孟庆玲;乔军;张国武;王熙凤;才学鹏
5.根癌农杆菌介导的少孢节丛孢菌遗传转化体系研究 [J], 黄运福;贡莎莎;孟庆玲;乔军;张国武;王熙凤;才学鹏
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不同培养条件对红曲霉产红曲色素的研究
食品科学
２００８，ＶｏＬ ２９，Ｎｏ．０１ ２１５
不同培养条件对红曲霉产红曲色素的研究
郭红珍，王秋芬，马立芝 （廊坊师范学院生命科学学院，河北廊坊０６５０００）
摘 要：本研究主要针对发酵液培养基中不同碳源、氮源、ｐＨ以及装液量分别进行单因素五水甲的试验，确定 三个较好的水平，再进行四｜天ｌ素三水平正交试验以确定红曲霉产红曲色素的最佳条件。在单因素试验中，碳源以 玉米粉、淀粉、麦芽糖较好；氮源以硝酸钠、大豆粉、氯化铵较好；ＰＨ值以ＰＨ３．８、５．４、７．０较好；装液 量以２５０ｍｌ三角瓶装１００、１２５、１５０ｍｌ较好。通过四因素三水平正交试验，确定出红曲霉产红曲色素的最佳培养 条件为Ａ３ＢｔＣ－Ｄ。，即麦芽糖、大豆粉、ｐＨ３．８、装液量１５０ｍｌ／２５０ｍｌ组合最佳。 关键词：液态发酵；红曲霉；红曲色素
后，用适量水稀释，摇匀，以水做空白对照，用分 光光度计分别测定５１０ｎｍ和４１０ｎｍ的ＯＤ值［３］。
醇溶性红睦色素的色价：发酵液过滤后的菌丝体 １０５℃烘干５ｍｉｎ、充分研磨，用与发酵液相同体积７５％ （体积分数）乙醇萃取２４ｈ，离心，用适量７５％（体积分数） 乙醇稀释，以７５％（体积分数）乙醇做空白对照，用分光 光度计分别测定５１０ｎｍ和４１０ｎｍ的ＯＤ值［４１。
１．２．１ 种子培养 ＮａＮ０３ ２９、麦芽糖３０９、ＫＣｌ ０．５９、Ｋ２ＨＰ０４ ｌｇ、
ＭｇＳ０４ Ｏ。５９、ＦｅＳ０４ ０．０１９、琼脂１５～２０９、蒸馏水 １０００ｍｌ，ｐＨ５．８，２５０ｍｌ三角瓶装１００ｍｌ，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ， 分别接种活化好的菌种，置摇床中３０℃，２００ｒ／ｍｉｎ，振 荡培养３ ｄ。
一
Ｏ．７８０
０．６２０
０．４６０
００９４ ０２１０ ００１７
红曲霉及红曲色素的研究进展
红曲霉及红曲色素的研究进展
陈丽颖;戴国君
【期刊名称】《中国保健营养（下旬刊）》
【年(卷),期】2013(023)003
【摘要】红曲作为传统的药食两用品,已在世界范围得到广泛应用.本文综述了红曲霉及红曲色素在降血压、降血脂及对抗癌症等多种药理活性的研究和应用,并对红曲色素的生产工艺进行探讨,为红曲产品的进一步开发指明了研究方向.
【总页数】2页(P1590-1591)
【作者】陈丽颖;戴国君
【作者单位】吉林省梅河口市中小企业服务中心,吉林,梅河口,135000;吉林省梅河口市中小企业服务中心,吉林,梅河口,135000
【正文语种】中文
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1.红曲霉固态发酵产红曲色素研究进展
2.紫色红曲霉固态发酵豆渣产红曲色素的工艺研究
3.红曲霉及红曲色素的研究进展
4.紫色红曲霉的微波诱变及其产红曲色素发酵条件的优化
5.氯化铵对紫色红曲霉固态发酵红曲色素和桔霉素合成的双向调控作用
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质粒拯救
REMI 转化体的质粒拯救一、原理限制性内切酶介导的整合（Restriction Enzyme Mediated Integration ，REMI ）技术是一种将待转化的DNA 通过限制性内切酶介导整合到真核生物细胞染色体中的方法，在真菌中已经发展成为有效的转化和标记突变的方法。
用REMI 技术已经标记和分离出几种植物病原真菌的致病性相关基因。
如玉米小斑病菌Cochliobolus heterostrophus T 小种的产毒素基因Tox1和T 毒素生物合成所需要的直线聚乙酮醇(1inear polyketide)合成酶基因PKS1（Lu et al.1994; Y ang et al . 1996）；梨黑斑病菌Alternaria alternata 日本梨致病型菌株中与AK 毒素产生和致病性必需的2个基因Akt1和Akt2（Tanaka et al . 1999）等。
在稻瘟菌中，利用REMI 技术已克隆了10多个致病相关基因，如Pth11、CUT1、MPG1、CPKA 等（DeZwaan et al ., 1999; Sweigard et al ., 1998; Lau and Hamer, 1998; Xu et al., 1997; Balhadere et al., 1999）。
在稻瘟菌的REMI 转化以获得突变体中，转化用的质粒以随机的方式插入到稻瘟菌的基因组中，这个质粒除了带有一个真核选择标记如潮霉素抗性基因外，仍然具有细菌质粒的复制位点和抗性基因。
拯救就是将此质粒及它所插入位置的侧端序列从基因组中拿出来的过程。
其原理图如下：选用合适的限制性内切酶完全消解基因组DNA ，进行DNA 片段的自身环化后，再转化大肠杆菌，包含有细菌质粒的复制位点和抗性基因的环化的DNA 片段就能在抗性平板上长出。
根据所选用的限制性内切酶的不同可分为两种不同的策略，一种是选用REMI 转化所用的质粒中有一个酶切位点，且不破坏细菌质粒的复制位点和抗性基因的限制性内切酶，在这种策略中被拯救的质粒中带有插入位置一侧的稻瘟菌基因组DNA 序列，如上图中向左的箭头所指；另一种策略是选用REMI 转化所用的质粒中没有酶切位点的限制性内切酶，在这种策略中被拯救的质粒中同时带有插或入位置两侧的稻瘟菌基因组DNA序列如上图中向右的箭头所指。
高产γ-氨基丁酸红曲霉菌株的筛选及发酵条件优化的开题报告
高产γ-氨基丁酸红曲霉菌株的筛选及发酵条件优化的开题报告一、研究背景与意义γ-氨基丁酸是一种重要的生物活性物质，具有降血压、改善睡眠、抗疲劳、保护神经细胞等多种生理功能。
因此，γ-氨基丁酸在食品、医药、保健品等领域具有广泛的应用前景。
红曲菌是一种生产黄曲霉素的真菌，同时也具有产生γ-氨基丁酸的能力。
因此，筛选高产γ-氨基丁酸的红曲霉菌株，优化发酵条件，具有重要的研究价值和应用前景。
二、研究目的本课题旨在筛选高产γ-氨基丁酸的红曲霉菌株，并优化其发酵条件，为γ-氨基丁酸的生产提供理论和技术支撑。
三、研究内容1. 筛选高产γ-氨基丁酸的红曲霉菌株。
在常规培养基上，通过对不同红曲菌株进行发酵，筛选出γ-氨基丁酸产量较高的菌株，并进行初步鉴定和评价。
2. 优化红曲霉菌的培养条件。
（1）不同培养基配方的优化。
通过调整不同培养基中碳源、氮源、微量元素等配比，获得γ-氨基丁酸产量较高的培养基。
（2）发酵条件的优化。
通过调整不同的发酵温度、发酵时间、初始pH值等条件，优化γ-氨基丁酸的产量和品质。
四、研究方法和技术路线1. 筛选高产γ-氨基丁酸的红曲霉菌株。
选择常见的红曲菌菌株，在常规培养基上进行培养，测定各菌株产γ-氨基丁酸的能力，筛选出γ-氨基丁酸产量较高的菌株，同时对菌株进行初步的形态学和生理生化特性鉴定。
2. 优化红曲霉菌的培养条件。
（1）不同培养基配方的优化。
选择较高产γ-氨基丁酸的红曲霉菌株，在不同培养基上进行培养，测定γ-氨基丁酸的产量和品质，优化培养基配方。
（2）发酵条件的优化。
采用响应面法对不同条件进行试验设计，得到γ-氨基丁酸产量与发酵条件之间的关系，优化发酵条件。
五、预期成果和意义1. 筛选出高产γ-氨基丁酸的红曲霉菌株，并初步鉴定其形态学和生理生化特性。
2. 优化γ-氨基丁酸的生产工艺，提高其产量和品质。
3. 为γ-氨基丁酸的生产提供理论和技术支撑，具有广泛的应用前景。
六、可行性分析本研究拟采用常规的菌株筛选和优化工艺的方法，技术路线清晰，研究方法可靠。
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REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化摘要：为了构建限制性内切酶介导的整合（ｒｅｍｉ）技术介导的红曲霉（ｍｏｎａｓｃｕｓ anka）遗传转化系统，以潮霉素b作为抗性筛选标记，ｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ、ｐｃｂ１００３、ｐａｎ７－１作为转化质粒，采用ｒｅｍｉ技术转化红曲霉。
结果表明，用ｒｅｍｉ技术介导红曲霉转化时，质粒ｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ和ｐｃｂ１００３适合于红曲霉的转化。
环状质粒与线性质粒的转化率无显著差别；在用ｒｅｍｉ技术介导转化时添加酶切缓冲液不利于转化；原生质体浓度为１×１０７～１×１０８个／ｍｌ时，每微克质粒可获得的潮霉素ｂ抗性转化子为２８００～３２００个；ｈｉｎｄⅲ介导转化时的最佳酶用量为１０5～１２０ｕ；在质粒用量为８μｇ／１００μｌ时转化率最高。
关键词：红曲霉（ｍｏｎａｓｃｕｓ anka）；遗传转化；限制性内切酶介导的整合（remi）ａｂｓｔｒａｃｔ：ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆｍｏｎａｓｃｕｓ anka ｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ（ｒｅｍｉ），ｕｓｉｎｇｔｈｅｈｐｈｇｅｎｅａｓｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒａｎｄｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ，ｐｃｂ１００３ａｎｄｐａｎ７－１ａｓｖｅｃｔｏｒ，ｔｈｅｆｕｎｇｕｓｍ．ａｎｋａｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｔｏｂｅｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｂ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｙｒｅｍｉ．ａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓｔｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｍｉｘｔｕｒｅｓｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｅｗｈｅｎｕｓｉｎｇｐｂｃ－ｈｙｇｒｏａｎｄｐｃｂ１００３ａｓｖｅｃｔｏｒｓ．ｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｅｈａｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｎｏｍａｔｔｅｒｉｆｖｅｃｔｏｒｓｗｅｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｏｒｎｏｔ．ａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｒｅｄｕｃｉｎｇｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓａｔ the ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ１×１０７～１×１０８ｍｌｗｅｒｅｆｉｔｆｏｒｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｍ．ａｎｋａ，ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｎｕｍｂｅｒｗａｓ２８００～３２００ｉｎｄ．／μｇｖｅｃｔｏｒｄｎａ．ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｈｉｎｄｉｉｉａｎｄｖｅｃｔｏｒｄｏｓｅｗａｓ１０5～１２０ｕａｎｄ８μｇ／１００μｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｏｎａｓｃｕｓｓｐ．；ｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ（ｒｅｍｉ）限制性内切酶介导的整合（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ eｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄｄｎａ iｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ｒｅｍｉ）技术是将ｄｎａ转化进入真核细胞，并产生非同源整合的一种方法。
ｒｅｍｉ的非同源整合机理与非同源末端连接（ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ，ｎｈｅｊ）相关［１－４］，整合的过程［５］可简单归结为三步：首先在转化过程中使线性化ｄｎａ的酶随线性化ｄｎａ进入核内；第二，限制性内切酶在特定识别位点酶切宿主染色体ｄｎａ；第三，染色体ｄｎａ和转化片段在体内互补末端连接产生非同源整合事件。
１９９１年ｓｃｈｉｅｓｔｌ等［６］首次将ｒｅｍｉ技术应用于极易同源整合的ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
ｋｕｓｐａ等［７］首先将ｒｅｍｉ技术应用于ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍｄｉｓｃｏｉｄｉｕｍ克隆发育基因，构建了ｒｅｍｉ－ｒｆｌｐ（限制性片段长度多态性）图谱［８，９］，并克隆了很多发育基因，使发育途径的研究变得更加容易。
应用该方法已分离到几个植物致病真菌的毒力因子［５］。
ｒｅｍｉ技术还成功应用于子囊菌ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ［１０］和玉米致病真菌ｕｓｔｉｌａｇｏｍａｙｄｉｓ［１１］、ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ［１２］的遗传互补分析，以及启动子捕获等。
研究探讨了不同限制性内切酶介导转化红曲霉的能力，以及酶切缓冲液和不同质粒对转化率的影响，同时优化了酶的用量、受体细胞浓度等条件。
１材料与方法１．１材料１．１．１菌株、质粒与培养基菌株ｍ７５７７是野生型红曲霉（ｍｏｎａｓｃｕｓａｎｋａ），由贵州大学真菌资源研究所分离、保存。
用于遗传转化的质粒ｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ由法国ｓｉｌａｒ教授惠赠，该质粒携带潮霉素ｂ抗性基因（ｈｐｈ）［１３］，是用限制性内切酶ｈｉｎｄⅲ酶切线性化的。
质粒ｐａｎ７－１［１４］带有来自ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ的ｇｐｄ基因的启动子和ｔｒｐｃ基因［１５］的终止子。
用ｈｐｈⅰ酶切质粒ｐａｎ５２－１，用ｔ４ｄｎａ聚合酶补平末端，再用ｂａｍｈⅰ酶切得到１．１ｋｂｈｐｈ基因片段（ｈｐｈ基因缺失了不影响酶功能的前３个密码子）［１６］，与ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ带有起始密码子ａｔｇ的ｇｐｄ基因５′端融合；ｈｐｈ基因下游密码子区域与ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓｔｒｐｃ基因末端区域的ｈｐｈⅰ－ｂａｍｈⅰ片段融合，克隆到质粒ｐａｎ５２－１（克隆前先用ｎｃｏⅰ酶切ｐａｎ５２－１，用ｔ４ｄｎａ聚合酶补平末端，再用ｂａｍｈｉ酶切）上构建得到ｐａｎ７－１。
质粒ｐｃｂ１００３带有来自ｐｃｓｎ４３［１７］的２．４ｋｂｓａｌⅰ片段（含有潮霉素ｂ抗性基因ｈｐｈ和来自ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ的ｔｒｐｃ启动子和终止子），通过单个碱基的改良消除了ｈｐｈ基因中的４个限制性内切酶位点：ｅｃｏｒⅰ（ｇａｇｔｔｃ）、ｐｓｔⅰ（ｃｔｇｇａｇ）、ｓｓｔⅱ（ｃｃｇｃｇｃ）和ｂａｍｈｉ（ｇｇｔｔｃｃ），但ｈｐｈ基因编码的氨基酸序列未变。
通过ｐｃｒ技术消除ｔｒｐｃ终止子，获得了１．４ｋｂ的片段，并在片段两端引入ｅｃｏｒⅰ、ｓａｌⅰ和ｈｐａⅰ位点，最后通过ｅｃｏｒⅰ位点亚克隆到ｐｕｃ１９构建得到ｐｃｂ１００３。
菌丝生长的ｃｍ培养基和产孢培养基按文献［１８］配制，原生质体再生液体和固体培养基是分别于ｃｍ液体和琼脂糖固体培养基中加入蔗糖，终浓度为０．６ｍｏｌ／ｌ；复苏液体培养基、马铃薯葡萄糖液体培养基中加蔗糖，终浓度为０．６ｍｏｌ／ｌ。
１．１．２药品与试剂各种限制性内切酶和ｐｆｕｄｎａ聚合酶为ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司产品，ｃｅｌｌｕｌａｓｅ、ｌｙｓｉｎｇｅｎｚｙｍｅ购于ｓｉｇｍａ公司，ｓｎａｉｌａｓｅ购于华美生物工程公司，琼脂糖购于ｂｉｏｗｅｓｔ公司，质粒中量制备试剂盒为德国ｑｉａｇｅｎ公司产品，其余试剂均为进口或国产分析纯。
电击转化缓冲液ⅰ含有１０ｍｍｏｌ／ｌｔｒｉｓ－ｈｃｌ（ｐｈ７．５）、６００ｍｍｏｌ／ｌ蔗糖、１ｍｍｏｌ／ｌｌｉａｃ，用于不含聚乙二醇４０００的原生质体电击转化；电击转化缓冲液ⅱ含有１０ｍｍｏｌ／ｌｔｒｉｓ－ｈｃｌ（ｐｈ７．５）、６００ｍｍｏｌ／ｌ蔗糖、１ｍｍｏｌ／ｌｌｉａｃ、３００ｇ／ｌ聚乙二醇４０００，用于含聚乙二醇４０００的原生质体电击转化；电击转化缓冲液ⅲ含有１０ｍｍｏｌ／ｌｔｒｉｓ－ｈｃｌ（ｐｈ７．５）、２７０ｍｍｏｌ／ｌ蔗糖、１ｍｍｏｌ／ｌｌｉａｃ，用于萌发孢子的电击转化。
ｓｔｃ溶液含有１ｍｏｌ／ｌ山梨醇、５０ｍｍｏｌ／ｌｔｒｉｓ－ｈｃｌ（ｐｈ８．０）、５０ｍｍｏｌ／ｌｃａｃｌ２，ｐｔｃ溶液含有４００ｇ／ｌ聚乙二醇４０００、５０ｍｍｏｌ／ｌｔｒｉｓ－ｈｃｌ（ｐｈ８．０）、５０ｍｍｏｌ／ｌｃａｃｌ２。
１．２方法１．２．１原生质体的制备参考文献［19］。
菌株ｍ７５７７在产孢培养基上于３０℃培养７～１０ｄ，收集孢子并制备成均一的浓度为１×１０８～１×１０９个／ｍｌ的孢子悬液。
取２００μｌ孢子悬液涂布于铺有玻璃纸的ｐｄａ平板上，于３０℃培养３０ｈ，收集菌丝体，用１ｍｏｌ／ｌｍｇｓｏ４溶液洗１次。
约３００ｍｇ菌丝体加３０ｍｌ裂解酶液，于３０℃以６０ｒ／ｍｉｎ酶解２～３ｈ，过滤，滤液于４℃、以３２００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。
弃上清，用１．２ｍｏｌ／ｌ预冷的山梨醇溶液洗原生质体沉淀２次，分为２份。
一份重悬于１．２ｍｏｌ／ｌ预冷的山梨醇溶液中，一份用预冷的ｓｔｃ溶液洗１次。
两份样品均置于冰浴备用。
１．２．２质粒的线性化用ｈｉｎｄⅲ酶切线性化质粒ｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ。
酶切反应体系：３６μｌ１０×ｅｎｚｙｍｅｂｕｆｆｅｒ，２０μｇｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ，１２μｌ１０ｕ／μｌｈｉｎｄⅲ，加ｄｄｈ２ｏ至３６０μｌ，置于３７℃水浴２～４ｈ，于６５℃水浴反应１５ｍｉｎ，停止反应，然后分为２份，一份备用，称为质粒ａ液；另一份用苯酚－氯仿抽提纯化，然后溶解于无菌去离子水，称为质粒ｂ液。
１．２．３ｒｅｍｉ技术的转化方法参考文献［20］。
用预冷的ｓｔｃ溶液洗原生质体并再重悬，浓度调整至５×１０７个／ｍｌ。
取１００μｌ转化用原生质体液，加入１μｇ环状质粒ｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ，轻轻吹吸混匀；分别加限制性内切酶ｈｉｎｄⅲ３０～１９０ｕ，冰浴３０ｍｉｎ，加１ｍｌｐｔｃ，于室温静置４０～６０ｍｉｎ，涂布于含有１２０μｇ／ｍｌ潮霉素ｂ的再生琼脂糖固体培养基平板上，每个平板涂布２００μｌ转化液。
于３０℃暗培养４～５ｄ，统计转化子数。
１．２．４最适质粒的选择采用３个启动子序列来源不同的环状质粒ｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ、ｐｃｂ１００３、ｐａｎ７－１，用量为７５或１０５ｕ的限制性内切酶ｈｉｎｄⅲ、ｓａｃⅰ、ｂａｍｈⅰ，将１μｇ不同质粒和限制性内切酶分别加到１００μｌ５×１０７个／ｍｌ原生质体中，对红曲霉进行转化试验，以潮霉素b抗性转化子数为指标评价和筛选适合转化红曲霉的质粒。
１．２．５最适限制性内切酶的选择选择７种不同的限制性内切酶为转化质粒，其中平末端酶有ｓｍａⅰ和ｈｐａⅰ，５′端突出末端酶有ｈｉｎｄⅲ、ｓａｌⅰ和ｅｃｏｒⅰ，３′端突出末端酶有ｋｐｎⅰ、ｓａｃⅰ，向１００μｌ５×１０６个／ｍｌ原生质体液中加入１μｇ线性或环状质粒ｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ和７５ｕ限制性内切酶进行转化试验，以不加酶处理的作对照，以潮霉素b抗性转化子数为指标评价和筛选合适的限制性内切酶。
１．２．６酶切缓冲液对转化的影响试验有７种试验方案，１００μｌ原生质体液中，①加质粒ａ液和１０５ｕｈｉｎｄⅲ，②加质粒ｂ液、１０５ｕｈｉｎｄⅲ和10×酶切缓冲液，③加质粒ｂ液和１０５ｕｈｉｎｄⅲ，④加环状质粒、１０５ｕｈｉｎｄⅲ和10×酶切缓冲液，⑤加环状质粒和１０５ｕｈｉｎｄⅲ，⑥加质粒ｂ液，⑦加环状质粒作为对照。