CRISPR-Cas概述
CRISPR-Cas系统：细菌的免疫武器和人类的基因工具
CRISPR-Cas系统：细菌的免疫武器和人类的基因工具文章内容：细菌是地球上最古老、最多样、最广泛的生命形式之一，它们在自然界中与各种生物和环境因素进行着复杂的相互作用。
其中，细菌与噬菌体（一种专门感染细菌的病毒）之间的斗争尤为激烈，噬菌体每年可以杀死约一半的海洋细菌。
为了抵抗噬菌体的入侵，细菌进化出了一套精妙的免疫系统，称为CRISPR-Cas系统，它可以识别和切割外来的DNA或RNA，从而保护细菌的基因组完整性。
CRISPR-Cas系统的发现可以追溯到1987年，当时日本的研究人员在大肠杆菌的基因组中发现了一些重复的DNA序列，它们之间由一些非重复的DNA序列隔开，这些非重复的DNA序列被称为间隔序列（spacer）。
后来，人们发现这些间隔序列其实是噬菌体或其他外源DNA的片段，它们被细菌捕获并插入到自己的基因组中，形成了一种遗传记忆，可以帮助细菌识别和清除同源的入侵者。
这些重复和间隔序列的组合被称为CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），即规律成簇的短回文重复序列。
CRISPR序列通常位于一些编码核酸酶的基因附近，这些基因被称为Cas（CRISPR-associated genes），即CRISPR相关基因。
CRISPR和Cas共同构成了CRISPR-Cas系统，它是细菌的一种适应性免疫系统，可以根据外来DNA的变化而调整自身的防御策略。
CRISPR-Cas系统的工作原理大致可以分为三个阶段：获取、表达和干扰。
在获取阶段，当细菌遭遇外来DNA时，Cas蛋白会将外来DNA的一小段片段切割下来，并将其插入到CRISPR序列的末端，形成新的间隔序列。
这样，细菌就获得了针对外来DNA的特异性信息。
在表达阶段，CRISPR序列会被转录成前CRISPR RNA （pre-crRNA），然后在Cas蛋白的作用下，被切割成多个成熟的CRISPR RNA （crRNA），每个crRNA包含一个间隔序列和一个重复序列。
基因编辑技术CRISPRCas的原理与应用
基因编辑技术CRISPRCas的原理与应用基因编辑技术CRISPR-Cas的原理与应用在该题目中，我们将探讨基因编辑技术CRISPR-Cas的原理和应用。
以下是对CRISPR-Cas的解释以及该技术在生物学和医学领域的广泛应用。
一、CRISPR-Cas的概述CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种存在于细菌和古菌中的宿主免疫系统。
CRISPR-Cas系统通过储存和利用外源DNA序列信息来识别和破坏入侵的病毒和噬菌体。
二、CRISPR-Cas的工作原理1. CRISPR-Cas9系统CRISPR-Cas9是其中最常用的一种CRISPR系统。
它基于Cas9酶与CRISPR RNA（crRNA）和转录单元的连接，使Cas9能够识别和切割目标DNA序列。
crRNA通过配对目标DNA上的特定序列，引导Cas9到目标位点。
Cas9酶通过其核酸酶活性切割DNA，引发细胞自然的DNA修复机制。
2. CRISPR-Cas12和CRISPR-Cas13系统除了Cas9，CRISPR-Cas系统中还有其他酶如Cas12和Cas13。
CRISPR-Cas12使用crRNA和转录单元来导向Cas12酶切割DNA，而CRISPR-Cas13则使用crRNA来导向Cas13酶切割RNA。
三、CRISPR-Cas的应用领域1. 基因组编辑CRISPR-Cas系统可以被用来编辑生物体的基因组。
通过设计合适的引导RNA序列，可以将Cas酶定点引导到目标基因组位点，并进行切割或修改特定的DNA序列。
这为基因功能研究和疾病相关基因的研究提供了高效率和精准性的工具。
2. 基因治疗CRISPR-Cas系统在基因治疗中具有巨大潜力。
通过将CRISPR-Cas 工具引导到有缺陷的基因区域，可以修复或替换不正常的基因序列。
这为一些遗传性疾病的治疗提供了新的可能性。
CRISPR-Cas 9
1 CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸 进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。
2 CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫, 而这种特异性是由间隔序 列（spacer）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群， 细菌进化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR 间隔序列的 动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的。
TypeⅡ系统的主要特征是包含一个标志性的Cas9 蛋白(分子质量很大的多功 能蛋白)参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA 或是外源质粒。
Cas9 蛋白包含两个功能结构域，一个在N端，有类似于Ruc 核酸酶的活性， 一个在中部有类似HNH 核酸酶的活性。
嗜热性链球菌具有典型的TypeⅡ CRISPR/Cas 系统，它的CRISPR/Cas 系统 编码tracrRNA(trans-activating crRNA)，其指导RNaseⅢ和Cas9 完成前 体crRNA 的成熟。随后tracrRNA 还能与成熟的crRNA 的重复序列配对形成 RNA 二聚体，进而和Cas9 蛋白结合成核糖核蛋白复合体，发挥识别和降解 入侵的外源DNA 功能[36]．
基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶 标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选 、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大， 耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传 统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。[2]
靶向基因操作技术
CRISPR Cas 基因编辑技术简介
1.CRISPR/Cas系统概述
1.2CRISPR系统获得：
CRISPR/Cas系统是很多细菌和大部分古细菌的天然免疫系 统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白 进行切割，从而达到对自身的免疫。
2.CRISPR/Cas系统结构
2.1CRISPR/Cas 主要由两部分组成：
2.CRISPR/Cas系统结构
4.CRISPR/Cas9系统
Type Ⅱ 因其简单性及可操作性，被改造成有力的基因工程工具--
CRISPR/Cas9。现在广泛使用的CRISPR/Cas9系统来源于酿脓链球菌。
Type II系统具有以下特点：
在CRISPR/Cas基因座 上游会表达tracrRNA;
tracrRNA会参与 crRNA的加工，这个 工程亦需要RNaseIII 的参与；
CRISPR基因座的表达（包括转 录和转录后的成熟加工）
当该噬菌体再次入侵细菌时， CRISPR簇首先转录为长的 crRNA前体，然后逐步加工成 小的成熟的crRNA.
CRISPR/Cas系统活性的发 挥或外源遗传物质的干 扰
crRNA结合相关的Cas蛋白后， 形成crRNA-Cas蛋白复合体， 通过碱基互补配对精确地 与目标DNA相结合，随后 Cas蛋白对目标DNA 进行断 裂和降解。
基因编辑技术CRISPR/Cas9
1.CRISPR/Cas系统概述
1987年，日本大阪大学（Osaka University） 在对一种细菌编 码的碱性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近 存在一小段不同寻常的DNA片段，但一直不清楚功能。后来的研究 发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。
Cas9蛋白不具特异性
CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处1012bp碱基的配对，而其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识 别影响不大。
了解基因编辑技术CRISPRCas的原理与应用
了解基因编辑技术CRISPRCas的原理与应用CRISPR-Cas基因编辑技术的原理与应用基因编辑技术CRISPR-Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR-associated protein）是一种革命性的遗传工程技术，它的出现为科学家们研究基因功能以及治疗遗传性疾病带来了革新性的突破。
本文将重点介绍CRISPR-Cas系统的原理及其在生物学和医学领域的应用。
一、CRISPR-Cas系统的原理CRISPR-Cas系统在原始形态下是一种原核生物自身的防御机制，它能够识别并摧毁外源DNA，以保护细菌免受病毒感染。
CRISPR-Cas 系统主要由两个关键组件组成，即CRISPR序列和Cas蛋白。
1. CRISPR序列CRISPR序列是一段由重复序列和间隔序列组成的DNA序列，它存在细菌和古菌的基因组中。
重复序列是由相同的短片段DNA组成，而间隔序列则是独特的DNA片段。
CRISPR序列的功能是存储与先前感染的病毒相关的信息，以便细菌在再次感染时能够快速识别并消灭病毒。
2. Cas蛋白Cas蛋白（CRISPR-associated protein）是CRISPR-Cas系统的核心组成部分，它能够与CRISPR序列相互作用并实现基因编辑功能。
Cas蛋白主要分为不同类型，其中Cas9是最常用的一种。
Cas9蛋白能够通过识别和结合CRISPR序列中的重复序列和间隔序列，定位到外源DNA的特定位置。
二、CRISPR-Cas系统的应用1. 基因组编辑CRISPR-Cas技术被广泛应用于基因组编辑领域，可用于不同生物体中的基因修饰。
通过将适当设计的RNA序列引导Cas9蛋白定位到目标基因组的特定位置，可以实现基因的删除、插入或修复，从而改变目标基因组的遗传信息。
这项技术使得研究人员能够深入探究基因的功能和相互作用，推动相关领域的前沿科学研究。
CRISPR-Cas技术
3 外源基因的切割
crRNA 和tracrRNA结合成sgRNA，指导Cas9对外源基因进行切割。Cas9识别 目的基因中的PAM片段，而crRNA识别ＰＡＭ 的５′端互补的20bp的DNA序列 片段（外源DNA），使基因组与Cas9稳定结合，从而对靶位点进行切割，基因 组双链发生断裂，形成双链缺口（DSB）。
2 CRISPR/Cas 的分类
系统
基于CRISPR-Cas基因保守型和位点构成的不同，可分为TypeⅠ、 TypeⅡ 、TypeⅢ三种类型。
TypeⅠ和Ⅲ 行较为复杂，Ⅰ类的特征蛋白是Cas3，在细菌和古生菌 中都有。 Ⅲ类的有Cas6和Cas10两种酶。
TypeⅡ系统较简单只存在与细菌，主要是Cas9酶介导降解外源基因 和crRNA的成熟。
Repeaeas两端序列是严格保守的分别为ＧＴＴＴ／Ｇ和ＧＡＡＡＣ／Ｇ，能使
转录岀的RNA二级结构保持稳定。 Spacers均为外源的DNA插入。前导序列可能
2
在插入新的Spacers时起到识别作用或者作为转录CRISPR的启动子。
Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA的引导下切割靶位点， Cas9 具有 HNH 和 Ruv C 两结构域，都可以切割 DNA，其中 HNH 结构域切割互补的 DNA 链，Ruv C 切割非互补的 DNA 链。Cas9切割双链时无特异性，可作用于任何基因。
1
CRISPR之间的间隔区转录成前体cr-RNA（pre-crRNA），经核酸酶切割成熟，与tracr RNA
2
结合成sgRNA，sgRNA具有特异性，作用于特定的基因序列。
实验时只需要改造CRISPR的部分序列，就可以得到针对特定基因的CRISPR/Cas系统。 3
基因编辑技术CRISPRCas的原理和应用
基因编辑技术CRISPRCas的原理和应用基因编辑技术CRISPR-Cas的原理和应用基因编辑技术CRISPR-Cas（簡稱CRISPR）是一项近年来备受关注的基因工程技术。
CRISPR-Cas系统是一种能够实现精确编辑基因组的革命性工具，可用于修改遗传疾病、改进作物和治疗人类疾病等领域。
本文将介绍CRISPR-Cas的原理和应用。
一、CRISPR-Cas的原理CRISPR是"Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats"（簡稱CRISPR）的缩写，意为“聚集间隔短回文重复序列”。
Cas则代表与CRISPR相关的蛋白质。
CRISPR-Cas系统是一种起源于细菌和古菌的防御机制，用于对抗病毒等入侵。
CRISPR-Cas系统由两个主要组成部分组成：CRISPR序列和Cas蛋白。
CRISPR序列包含一系列重复和间隔序列，而Cas蛋白则具有催化酶活性。
当CRISPR序列与Cas蛋白表达时，系统能够识别外来DNA，并通过将其剪接或修复来实现基因组的编辑。
二、CRISPR-Cas的应用1.基因组编辑CRISPR-Cas可以用于精确编辑基因组，具有非常广泛的应用潜力。
科学家们可以利用CRISPR-Cas系统来剪接、插入或修复特定的基因序列，以实现对遗传性疾病的治疗、改进农作物的品种和提高动物的抗性等。
这项技术的出现，为遗传学研究提供了前所未有的便利和效率。
2.遗传疾病治疗CRISPR-Cas可用于修复或删除携带遗传疾病的基因序列。
通过精确编辑患者基因组中存在问题的位点，科学家们可以更准确地治疗遗传疾病，比如囊肿纤维化等。
这为患者提供了一种全新且有效的治疗选择。
3.农作物改良利用CRISPR-Cas技术，植物科学家可以精确编辑农作物基因组中的特定位点，以提高农作物的产量、耐旱性、抗病性等。
这项技术为传统的育种方法注入了新的活力，加快了农作物改良的进程。
CRISPR-Cas技术：从细菌防御到基因定制的创新之路
CRISPR-Cas技术：从细菌防御到基因定制的创新之路CRISPR-Cas技术是一种利用细菌的免疫系统来对基因进行编辑的技术，它可以在基因组的特定位置进行增加、删除或替换的操作，从而改变基因的功能或表达。
CRISPR-Cas技术的核心是一种叫做Cas的蛋白，它可以根据一段叫做gRNA的RNA的指引，去寻找并切割目标DNA序列。
CRISPR-Cas技术的初期，主要是利用Cas蛋白切割目标DNA，造成双链断裂，也就是两条DNA链都被切断。
这样的切割会激活细胞的DNA修复机制，有两种可能的结果：•一种是非同源末端连接，也就是细胞随机地把断裂的两端粘合起来，但是这个过程可能会导致一些碱基的插入或缺失，从而使目标基因失去功能，这叫做基因敲除。
•另一种是同源重组修复，也就是细胞利用一个外源的DNA模板，来修复断裂的位置，从而在目标基因上引入新的序列，这叫做基因敲入。
这种依赖于双链断裂产生的CRISPR基因编辑技术，有两种策略可以实现：•一种是引入一套外源的CRISPR-Cas系统，也就是把Cas蛋白和gRNA都从外部导入到待编辑的细胞中，让它们在细胞内发挥作用。
这种策略的优点是可以适用于很多种类的细胞，缺点是可能会引起细胞的免疫反应或者毒性。
•另一种是利用细胞自身编码的CRISPR-Cas系统，也就是利用细胞本身就有的Cas蛋白，只需要导入人工设计的gRNA，让它们在细胞内发挥作用。
这种策略的优点是可以避免外源蛋白的毒性，缺点是只能用于已经有CRISPR-Cas系统的细胞，比如一些细菌或古菌。
随着CRISPR-Cas技术的发展，人们发现了一些新的CRISPR-Cas系统，它们可以在不引起双链DNA断裂的情况下，完成基因组的修饰。
这些系统有以下的优势：•它们可以减少细胞内易错的修复途径产生的突变，提高基因编辑的精确度和效率。
•它们可以实现更多的基因编辑功能，比如单碱基的编辑、大片段的插入或删除、基因的激活或抑制等。
cas基因分类
"CRISPR-Cas" 是一种基因编辑技术，其名称中的"Cas" 是指"CRISPR-associated"，即与CRISPR 相关联的蛋白质。
CRISPR-Cas 系统被广泛用于生物学和基因工程领域，用于修改基因组中的特定部分。
在CRISPR-Cas 系统中，"Cas" 蛋白质起着切割和修改DNA 的作用。
根据目前的科学研究，Cas 蛋白质被分为不同的类型和亚型，主要包括：1.Class 1 Cas 蛋白质：这类Cas 蛋白质通常较大，由多个蛋白子单位组成。
Class 1 Cas 蛋白质在CRISPR-Cas 系统中扮演复杂的调控和激活作用。
2.Class 2 Cas 蛋白质：这类Cas 蛋白质相对较小，通常只有一个单独的蛋白质。
Class 2 Cas 蛋白质在CRISPR-Cas 系统中具有直接的DNA 切割和修饰功能。
目前已经鉴定出许多不同类型和亚型的Cas 蛋白质，其中一些主要的类型包括：1.Type I Cas：这是一种复杂的CRISPR-Cas 系统，通常包括多个蛋白质子单位。
Type I Cas 蛋白质可切割DNA，用于去除有害的病毒DNA。
2.Type II Cas：这是最著名的CRISPR-Cas 系统，包括单个蛋白质。
Type II Cas 蛋白质通常是CRISPR-Cas9 系统的一部分，被广泛应用于基因编辑。
3.Type III Cas：这类系统也包括多个蛋白质，与RNA 互作，能够干预RNA 及其附近的DNA。
4.Type V Cas：这是相对较新的分类，包括单个蛋白质和RNA 互作，有潜力用于基因编辑。
随着科学研究的不断深入，CRISPR-Cas 系统的分类和了解也可能会发生变化。
基因编辑技术CRISPRCas的原理与应用
基因编辑技术CRISPRCas的原理与应用基因编辑技术CRISPR-Cas的原理与应用基因编辑技术CRISPR-Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated）是一项革命性的生物技术，它引发了医学、农业等领域的巨大变革。
本文将介绍CRISPR-Cas的原理以及它在各个领域的应用。
一、原理CRISPR-Cas系统是一种免疫系统，起源于细菌和古细菌。
它能够识别和摧毁细菌感染的病毒基因组片段，从而保护宿主细菌免受感染。
该系统包括两个核心组成部分：CRISPR序列和Cas蛋白。
1. CRISPR序列CRISPR序列是一段由多个重复序列和间隔序列组成的DNA片段。
这些重复序列和间隔序列是宿主细菌嵌入到基因组中的病毒基因组片段。
CRISPR序列的特点是高度保守，可以通过PCR扩增和测序分析。
2. Cas蛋白Cas蛋白是CRISPR-Cas系统的核心执行器。
Cas蛋白可以切割DNA，修复断裂的DNA链，并起到导向CRISPR序列的作用。
不同类型的Cas蛋白具有特异性，能够识别和结合特定的CRISPR序列。
基于CRISPR-Cas系统的基因编辑技术，主要利用Cas9蛋白。
Cas9蛋白能够与CRISPR序列结合，使得CRISPR序列能够识别和结合靶基因的DNA序列。
二、应用CRISPR-Cas技术的应用非常广泛，涵盖了农业、医学、环境等多个领域。
以下是其中的几个典型应用。
1. 基因治疗CRISPR-Cas技术可用于修复人类基因组中的异常基因，治疗一些遗传性疾病。
通过将CRISPR-Cas系统导入病人的细胞中，可针对性地编辑患者的异常基因，恢复正常的基因功能。
2. 农业改良CRISPR-Cas技术在农业领域具有巨大的潜力。
通过编辑植物、动物基因组，可以使作物具备抗病性、耐旱性和耐盐性等特征。
这将提高农作物的产量和品质，有助于解决全球粮食安全问题。
CRISPR Cas技术
CRISPR/Cas9系统是一特殊的DNA重复序列家族，又命名为成簇的、规
律间隔的、短回文、重复序列，是目前用于基因敲除、点突变、基因插入、 基因修复等基因编辑方面的新方法。
CRISPR/Cass系统是从细菌和古生菌内发现的，它参与细菌的免疫过程， 抵挡外源遗传物质的侵袭，是一种后天获得的防御系统。
CONTENTS
一、CRISPR-Cas系统的简介
1，CRISPR/Cas系统的由来 2，CRISPR/Cas系统的分类 3，CRISPR/Cas系统的结构
二、CRISPR-Cas系统的作用机理
1，CRISPR间隔区的获得 2，crRNA的表达和成熟 3，外源基因的切割
三、DSB的修复 四、CRISPR-Cas系统的应用 五、CRISPR技术的脱靶问题 六、实验设计
2 经核酸酶切割成熟，与tracr RNA结合成sgRNA，sgRNA具
有特异性，作用于特定的基因序列。
3
实验时只需要改造CRISPR的部分序列，就可以得到针对特 定基因的CRISPR/Cas系统。
crRNA与tracrRNA碱基互补配对结合成gRNA，此 复合物能引导核酸酶Cas9 蛋白切割与crRNA配对 的双链DNA。
基因组双链发生断裂，形成双链缺口 （DSB）。
在真核生物中DSB （DNA双链切口）可被两种不同的机体自身 修复机制修复DSB——非同源性末端连接（NHEJ）和同源重组 （ HDR）进行修复。NHEJ能够高效地引入不同长度的插入或 缺失突变（indel），产生由于移码突变而导致的基因功能受 损，多用于细胞或动物模型中的基因敲除、功能基因组的筛 查、转录调控和基因沉默的研究；HDR以DNA结构的同源性为 基础，修复会带入特定位点的突变或在外源DNA供体模板存在 下对靶点形成可预测的插入.此外还有一种微生物学介导的末 端连接，这种在实验中比较少应用。
CRISPR-Cas
2.3 干扰:干扰入侵核酸
复合物在 crRNA 的引导下，由 Cas9 蛋白的核酸结构
域对外源 DNA 分子进行切割。
首先RNA/Cas9 复合体沿外源入侵DNA进行扫描，当遇到 PAM序列且DNA序列可与crRNA互补配对形成一个R环时，Cas9 蛋白将分别利用HNH与RuvC结构域对DNA的互补链与非互补链 进行切割，而形成DNA的双链断裂。
2.2 表达：表达并加工CRISPR
CRISPR 区域首先转 录成前体 RNA(precrRNA)，之后被Cas蛋白 剪切成更小的crRNA，即 成熟的crRNA，包含1个 间隔序列和部分重复序 列。同时，tracrRNA 也 会被转录并和crRNA形成 一种双链的RNA结构，再 与Cas9 蛋白组成具有 DNA内切酶活性的复合物。
1.3 CRISPR-Cas系统的结构
CRISPR-CAS系统的组成主要包括:由不连续的重复序列 R(repeat)与长度相似的间区序列S( spacers)间隔排列而 成的CRISPR 簇，前导序列L(leader) 以及一系CRISPR相 关蛋白基因cas。
1.4 CRISPR-Cas系统的类型
crRNA/tracrRNA/Cas9
sgRNA/Cas9
• 目前(2014.10)报道的CRISPR/Cas系统中使用的gRNA有2种 结构，一种是M.Jinek等最先提出的，将一部分重复序列 和一部分tracrRNA的序列直接拼接到一起形成的嵌合RNA 结构。
• 另一种与第一种基本相同，只是3‘端更长，添加了完整 的tracrRNA 序列.
4.2 导入目的生物或细胞系
• 在人工培养的哺乳细胞中，可通过电穿孔(electroporation) 、核转染( nucleofection) 与脂质体介导转染等方法将非自 主复制的质粒DNA 导入细胞中，使Cas9 与sgＲNA 可进行瞬 时表达。 • 慢性病毒载体( lentiviral vectors) 也已用于在人类或小 鼠细胞中组成型表达Cas9 与sgＲNA。 • 体外转录的ＲNA 也可直接注射导入斑马鱼、果蝇或小鼠的胚 胎细胞中 • 质粒越大，成功率越低
原核生物的CRISPR-Cas系统：从免疫防御到基因工程
原核生物的CRISPR-Cas系统：从免疫防御到基因工程CRISPR-Cas系统是一种在原核生物中发现的适应性免疫系统，它可以识别和切割外来的DNA或RNA，从而防止病毒或其他遗传元件的感染。
CRISPR-Cas系统的核心是一种由RNA指导的核酸酶，它可以根据RNA的互补配对，精确地定位和剪切目标序列。
这种系统可以被人工改造，用于在不同的生物中进行基因编辑，即增加、删除或修改基因的功能。
CRISPR-Cas系统根据效应子模块的组织，分为两个大类和六个小类。
第一类CRISPR-Cas系统利用多蛋白效应复合物，而第二类CRISPR-Cas系统利用单一蛋白效应器。
第一类系统占CRISPR-Cas基因座的约90%，并且存在于不同的细菌和古菌门中。
第二类系统占CRISPR-Cas基因座的约10%，在不同的细菌被发现，但在古菌中几乎不存在。
在原核生物中，利用内源CRISPR-Cas系统代表了一种应对策略，这意味着，一些原核生物，如细菌和古菌，本身就具有CRISPR-Cas系统，可以用来进行基因编辑，而不需要引入外源的核酸酶。
这种策略可以避免上述的递送问题和毒性问题，但是也有一些局限性，如内源系统的切割特性和PAM偏好性可能与预期的目标不匹配，需要进行一定的筛选和改造。
PAM（原型相邻基序）是一种位于目标序列附近的短的核苷酸序列，它是CRISPR-Cas系统识别和切割目标的必要条件。
不同的CRISPR-Cas系统对PAM序列的要求不同，有些比较宽松，有些比较严格。
PAM序列的存在，限制了CRISPR-Cas系统的靶向范围和灵活性，因为并不是所有的目标序列都有合适的PAM序列。
为了解决这个问题，一些研究者尝试了以下几种方法：•利用多种不同的内源CRISPR-Cas系统，以覆盖更多的PAM序列。
例如，一些细菌同时具有I-A和I-E型的CRISPR-Cas系统，它们可以识别不同的PAM序列，从而扩大了基因编辑的范围。
基因组编辑技术CRISPRCas在疾病治疗中的应用前景
基因组编辑技术CRISPRCas在疾病治疗中的应用前景基因组编辑技术CRISPR-Cas在疾病治疗中的应用前景基因组编辑技术CRISPR-Cas具有巨大的潜力，在疾病治疗领域引起了广泛的关注和研究。
该技术可以精确地修改细胞或生物体的基因组，有望为人类战胜一系列遗传性疾病带来新的希望。
本文将探讨CRISPR-Cas在疾病治疗中的应用前景。
一、什么是CRISPR-Cas？CRISPR-Cas是一种基因组编辑技术，全称为“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated”，中文意为“成簇有序间隔短回文重复序列与CRISPR相关序列”。
它最初是从细菌免疫系统中发现，能够干扰病毒感染。
随着研究的深入，科学家们发现CRISPR-Cas系统可以被用于编辑并精确改变生物体的基因组。
二、CRISPR-Cas在疾病治疗中的应用前景1. 遗传性疾病的治疗通过CRISPR-Cas技术，科学家们可以精确地修复基因组中存在的突变引起的遗传性疾病。
以囊性纤维化为例，这是一种常见的遗传性疾病，由CFTR基因突变引起。
利用CRISPR-Cas技术，可以直接定点修复CFTR基因中的突变，从而治疗这一疾病。
2. 癌症治疗CRISPR-Cas技术还可以用于癌症的治疗。
通过编辑癌细胞中的关键基因，可以抑制肿瘤的生长和扩散。
此外，还可以通过增强免疫细胞的功能，提升人体对癌细胞的免疫力。
这为癌症治疗开辟了新的途径。
3. 传染病防治CRISPR-Cas技术还可以用于传染病的防治。
例如，针对艾滋病毒，科学家们已经利用CRISPR-Cas技术研发出“基因剪刀”，可以从感染者的细胞中剪切掉艾滋病毒基因组的相关片段，从而有效抑制病毒的复制和传播。
4. 器官移植器官移植是目前治疗许多疾病的最佳选择，但供体匮乏是一个严重的问题。
CRISPR-Cas技术可以通过编辑供体细胞的基因组，使其具有更好的适应性和免疫耐受性。
CRISPR-Cas系统基因修饰技术(最终版)
2012年Jennifer A. Doudna和 Emmanuelle Charpentier的这篇Science发现了一个 比较简单的CRISPR（TypeII）系统的机理。这一系 统就简单多了，一个巨大的160KD的蛋白Cas9利用 RNA, 就可以完成识别和切割靶向的DNA。
3 Type II CRISPR系统—Cas9
他们发现了 1） Type II CRISPR系统中的Cas9是个核酸酶，这个核酸酶 结合两个RNA(crRNA, tracrRNA)就可以切割双链DNA. 2） 同时，他们进一步阐明了RNA和目标DNA配对的原则， 同时将crRNA-tracrRNA连接成了chimera RNA，这样只需要 Cas9蛋白和一条定制的RNA就可以编辑特性的DNA。 3） 同时他们进一步分析了Cas9作为核酸酶的活性位点：连 个核酸酶活性分别切割靶DNA的两条链。
3 Type II CRISPR系统—Cas9
CRISPR/Cas9 介 导 DNA 双链断裂的过程如下：首 先 ， tracrRNA 和 pre-RNA array 被 转 录 ； 其 次 ， tracrRNA 杂 交 到 pre-RNA array直接重复序列DRs上 并与Cas9结合在一起形成 二聚体，进一步介导 preRNA 成熟到 crRNA；再次， 成熟的crRNA:tracrRNA二 聚 体 通 过 crRNA 上 的 spacers 与 DNA 靶 序 列 上 的 protospacers 形 成 异 源 二 聚 体 ； 最 后 ， 在 protospacers 中， Cas9 在 靶DNA的PAM上游介导产 生DSB。
4 Cas9的应用
1 真核系统的应用 1） 优化密码子，让Cas9蛋白可以在哺乳动物系统中很 好的表达。
【精】基因编辑方法CRISPRCas
• 选择的序列必须在全基因组中进行比对，原间隔序列必须唯一， 否则会对其他基因进行敲除而出现错误的实验结果。
• 优先选择 DSB 位点的侧翼存在重复序列（如果 DSB 的侧翼存在重 复序列，在进行非同源末端重组时能够精确的介导断裂位点碱基 的缺失）。
• PAM 的5‘端尽量存在酶切位点。（有利于后期的活性检测）
一般形式为2.NGG二，其是作用将是将g间RN隔序A与列定位Ca于s入9侵分的噬别菌连体或载质粒不的同DNA的序载列中体) 上，两个载体携带有不同 的荧光报告基因或抗性基因 Cell 157,1262-1278 Figure2A
优先选择 DSB 位点的侧翼存在重复序列（如果 DSB 的侧翼存在重复序列，在进行非同源末端重组时能够精确的介导断裂位点碱基的缺
基因组编辑技术
又称基因组定点修饰技术，通过在某些物种基因组中进行靶向特异 性的突变，从而解答并提出更多精确的生物学问题。
方法包括：
•锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN）技术 •转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技术 •Cas9/gRNA 系统(CRISPR-cas9技术)
•SSA 活性检测 CRISPR-Cas9技术的应用进展
Cas9 系统作为DNA特定位点标签
[1] Patrick D. 一个终止子插入 luciferase（GFP）的编码区中央，luciferase（GFP） 就会失去活性。为检测 Cas9/sgRNA 剪切活性，将一个 Cas9/sgRNA的靶 点位置序列插在终止子后。在Cas9/ sgRNA 的作用下，靶点位置产生 DSB，细胞通过同源重组方式修复 DNA，形成一个有活性的luciferase。 通过与对照组的比值变化就可反应 Cas9/sgRNA 剪切的活性水平。
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Result 7
利用CRISPRi基因敲除探寻一种内源调控网络
• 我们分别在IPTG（一种抑制LacZ阻遏物的化合 物）有或无两种情况下进行β -半乳糖苷酶实 验来测定敲除菌株中LacZ的表达。 • 结果显示一个LacZ特异性sgRNA能够强烈抑制 LacZ的表达（图6B）。 • 相反，一个定位lac I基因的sgRNA导致在没有 IPTG的情况下激活LacZ的表达，正如预期的沉 默了一个LacZ表达的直接抑制子。
一、CRISPRi高效并选择性抑制目的基因的转录 • CRISPRi不依赖于复杂的宿主因子，只需要dCas9蛋白 和引导RNAs，并且灵活性和可塑性高。 • 我们的结果证实在微生物中该系统能有效沉默基因。 这种沉默是十分特异性的；我们的观察没有发现脱靶 效应。另外，敲除效率能通过改变定位位点和sgRNA与 目的基因之间碱基配对程度加以改变。 • 该系统通过直接阻碍转录发挥功能，可以很容易的通 过设计sgRNAs来实现。 • 另外，这些dCas9：sgRNA复合物也能在任何启动子中 通过定位关键反式激活结构域调节转录，空间上阻碍 它们同源的顺式激活因子。
两端还存在一段不太长的特有的序列。
2013以后，研究者们在包括《science》和《nature
biotechnology》等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas
系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确 的基因修饰。
背景
CRISPR-Cas主要由两部分组成：
切割
识别
背景
CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，
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thanks
综述图解
实验结果
Result 1
一个最简化的CRISPRi系统包含一个蛋白和一个 RNA，它能有效沉默转录起始和延伸
• 与Cas9共表达的sgRNA分子都由三个片段组成： 一个20个核苷酸（nt）位点特异性互补区，一个 42nt Cas9结合发夹（Cas9 手柄），和一个40nt 来自生脓性链球菌的转录终止子
二、CRISPRi能够用于基因组范围的分析和调控 • CRISPRi方法基于sgRNA的使用，只需要根据目 的基因设计20bp的互补区。利用先进的大范围 DNA寡核苷酸合成技术，产生大量用于基因组定 位的含有特异20bp区域的寡核苷酸基因功能或者定位基因对来标 注基因互作。
Result 8
CRISPRi能够在人类细胞中敲除基因表达
将dCas9蛋白密码子最优化，融合到三个拷贝的核定位 序列（NLS），并利用小鼠干细胞逆转录载体表达。 sgRNA用RNA聚合酶ⅢU6启动子表达。 通过病毒侵染创建了一个在SV40启动子下表达EGFP的 HEK293报告细胞系。
讨论
讨论
• 进而，CRISPRi能够用于同时调节大范围基因的 表达，因为小sgRNAs能将多个元件连接到同一 个表达载体。
讨论
三、CRISPRi作为管理转录调控网络的平台
• 在CRISPRi系统中，也可能是将多个sgRNAs连接到一个 转录体系中，从而实现一个上游sgRNA调控不同下游 sgRNA的表达。
通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进
行切割，从而达到对自身的免疫。
背景
type II CRISPR system from Streptococcus pyogenes
综述
• 基因组范围的定向基因调控是一种探寻、扰乱和编 辑细胞系统的有效手段。
综述
• 在这项研究中，我们设计了一种依赖Cas9（一种来自于类型 ⅡCRISPR系统的RNA引导的DNA核酸内切酶）调控基因表达的方 法。我们发现一种催化作用导致失活的Cas9缺乏核酸内切酶活 性，当其余一个诱导RNA共表达时，产生了一个DNA识别复合物， 能够特异性干扰转录延伸、RNA聚合酶的结合或者转录因子的结 合。
• Growth of E. coli Cell Cultures Cotransformed with dCas9 and sgRNA
Result 2
Result 3
Result 4
Result 5
Result 6
position on silencing efficiency
综述
• 这个被我们称作CRISPR干扰的系统，在大肠杆菌中能够有效抑 制目的基因的表达，并且没有脱靶现象发生。CRISPRi能够用于 多个基因的同时沉默，而且该效应是可逆的。我们也找到了该 系统适用于哺乳动物细胞基因表达抑制的证据。
综述
• 该RNA诱导DNA识别的平台为基因组范围内有选择性的 干扰基因表达提供了一个简单的方法。
• 已知cAMP-CRP是LacZ表达的关键激活子，它结合于启动 子上游一个顺式调剂位点（A位点）。 • 同样，sgRNA定位于crp基因或LacZ启动子中的A位点导 致抑制，证明一种利用CRISPRi实验将一个调节子联系 到它的顺式作用序列的方法。 • 定位腺苷酸环化酶基因（cya）是产生cAMP使CRP在LacZ 启动子上更有效所必需的，这只导致部分抑制。添加 1mM cAMP 于培养基中补充了cya基因敲除的影响，而不 是为补充了crp敲除的影响，说明cya是LacZ非直接调节 因子。 • 另外，利用sgRNA定位LacI反式调节位点（O位点）引起 抑制，推测是由于Cas9复合物结合于这一位点空间阻碍 RNA聚合酶的结合，这模仿了LacI转录抑制子的行为。 • 定位已知RNAP结合位点（P位点）也阻碍表达。 • 总的来说，这些研究证明了基于CRISPRi的基因敲除方 法提供了一种快速有效的方法来探究基因和反式作用元 件在复杂调控网络中的功能（激活或抑制）。
• 规律成簇间隔短回文重复序列再利用， • 作为一种RNA引导的序列特异性调控基因表达的平台
背景
1、CRISPR-Cas概述
1987年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌 编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时， 发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA 片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的