黄颡鱼微卫星标记筛选及特征分析
【水产动态】市场接受度更高、品质更好，水产新品种——杂交黄颡鱼“黄优1号”
【水产动态】市场接受度更高、品质更好，水产新品种——杂交黄颡鱼“黄优1号”一、品种概况（一）育种过程1. 亲本来源长江流域梁子湖的黄颡鱼野生群体，长江流域岳阳段至武汉段的瓦氏黄颡鱼野生群体为选育亲本。
2. 技术路线以生长优势为主要选育指标，用经连续三代选育的黄颡鱼雌鱼与连续两代选育的瓦氏黄颡鱼雄鱼经杂交制种，培育出杂交黄颡鱼“黄优1号”。
技术路线见图1。
图1 黄颡鱼“黄优1号”技术路线图3. 培育过程（1）黄颡鱼群体选育过程黄颡鱼一年性成熟，经连续选育三代，培育出杂交黄颡鱼“黄优1号”的母本群体。
2015年育成杂交黄颡鱼“黄优1号”后，每年继续进行黄颡鱼选育，补充选育亲本。
2011年开始，为了获得优质的黄颡鱼选育基础群体，项目组从长江流域水系引进四个大型湖泊的黄颡鱼群体（梁子湖、洪湖、洞庭湖和鄱阳湖），选择有活力、体质健壮、体表无伤和寄生虫的个体，其中选择雌性体重在100g以上，雄性体重在150g以上的个体，经专池分别培育，群体内繁殖获得水花，每个群体水花单独养殖，夏花和成鱼分别以生长为主要指标进行强度筛选，通过生长性能对比实验，最终以生长速度明显较快的梁子湖群体作为下一代选育的群体。
之后以同样的方法对梁子湖黄颡鱼群体进行第二代和第三代选育，同样在夏花和成鱼阶段分别以生长为主要指标进行强度筛选。
最后获得杂交黄颡鱼“黄优1号”的母本群体。
（2）瓦氏黄颡鱼群体选育过程瓦氏黄颡鱼两年性成熟，经连续选育两代，培育出杂交黄颡鱼“黄优1号”的父本群体。
2015年育成杂交黄颡鱼“黄优1号”后，每两年继续进行瓦氏黄颡鱼选育，补充选育亲本。
2011年，引进长江流域岳阳段至武汉段的野生瓦氏黄颡鱼，选择个体大、体型体色符合要求、活力好、体表光滑有光泽、体表无伤无寄生虫的个体，选留作为瓦氏黄颡鱼选育的基础群体，其中选择雌性体重在400g以上，雄性体重在500g以上的个体，经专池培育，人工繁殖获得水花，在夏花和成鱼阶段分别以生长为主要指标进行强度筛选，选留足够数量的个体作为下一代选育的群体。
1株黄颡鱼肠道益生菌的筛选与鉴定
1株黄颡鱼肠道益生菌的筛选与鉴定1株黄颡鱼肠道益生菌的筛选与鉴定从正常养殖的黄颡鱼肠道中分离得到218株细菌,通过产酶能力测试,对常见病原菌体外拮抗作用以及对抗生素敏感性试验筛选出1株益生菌HS140菌株.通过测定HS140菌株对黄颡鱼的致病性,并结合形态观察、生理生化试验和16S rRNA部分序列分析,对HS140菌株进行了分类鉴定.结果显示:HS140菌株具有很强的分泌蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的能力,能够抑制温和气单胞菌、迟缓爱德华菌和鳗弧菌的生长.HS140菌株对氨苄青霉素、磺胺异恶唑、先锋霉素VI等3种抗生素产生耐药性,对另外13种抗生素均敏感或中度敏感.急性毒性试验表明,浓度为1.0×10~8 cfu/mL的HS140菌悬液对黄颡鱼没有致病性.HS140菌株为革兰氏阳性可动杆菌,16S rRNA的部分序列分析显示HS140菌株与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)具有99.3%的相似性,系统发育树上HS140菌株与地衣芽孢杆菌(FJ435674)聚为同一分支,结合形态观察和生理生化试验结果最终鉴定HS140菌株为B.licheniformis.作者：孟小亮陈昌福高宇贺中华田甜刘振兴 MENG Xiao-liang CHEN Chang-fu GAO Yu HE Zhong-hua TIAN Tian LIU Zhen-xing 作者单位：华中农业大学水产学院,武汉,430070 刊名：华中农业大学学报ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF HUAZHONG AGRICULTURAL UNIVERSITY 年，卷(期)：2010 29(2) 分类号：Q959.46 关键词：黄颡鱼地衣芽孢杆菌筛选鉴定 Pelteobagrus fulvidraco Bacillus licheniformis screening identification。
杂交黄颡鱼(黄颡鱼♀×瓦氏黄颡鱼♂)及其双亲遗传多样性的微卫星分析
杂交黄颡鱼(黄颡鱼♀×瓦氏黄颡鱼♂)及其双亲遗传多样性的微卫星分析张佳佳;李杰;张国松;王涛;尹绍武;唐忠林;茆健强;王若然【期刊名称】《水产科学》【年(卷),期】2018(037)005【摘要】先从瓦氏黄颡鱼转录组ES T序列筛选获得53个微卫星多态性位点,然后筛选出42对能在黄颡鱼和杂交黄颡鱼(黄颡鱼♀×瓦氏黄颡鱼♂)中稳定扩增的微卫星引物,最终选用9对多态性较高的微卫星引物对3个群体进行遗传多样性和亲缘关系分析.试验结果显示,3个群体(黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼、杂交黄颡鱼)的平均有效等位基因数分别为2.5300、3.7697、3.0640;平均观测杂合度分别为0.2970、0.7292、0.4492;3个群体多态信息含量分别为0.3803、0.6746、0.5696.杂交黄颡鱼群体具有较为丰富的遗传多样性,有一定的杂交优势和良种选育潜力.其中杂交子代与母本黄颡鱼、父本瓦氏黄颡鱼的遗传距离分别为0.9006和1.8195,表明杂交子代与两亲本的遗传差异不对等,偏向母本一方,这与系统进化树的分析结果一致.【总页数】10页(P612-621)【作者】张佳佳;李杰;张国松;王涛;尹绍武;唐忠林;茆健强;王若然【作者单位】南京师范大学生命科学学院,江苏省生物多样性与生物技术重点实验室,江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院,江苏省生物多样性与生物技术重点实验室,江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院,江苏省生物多样性与生物技术重点实验室,江苏南京210023;菏泽学院,生命科学系,山东菏泽274000;南京师范大学生命科学学院,江苏省生物多样性与生物技术重点实验室,江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院,江苏省生物多样性与生物技术重点实验室,江苏南京210023;南京市水产科学研究所,江苏南京210036;南京市水产科学研究所,江苏南京210036;南京师范大学生命科学学院,江苏省生物多样性与生物技术重点实验室,江苏南京210023【正文语种】中文【中图分类】S917【相关文献】1.普通黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂种一代遗传特征的微卫星分析 [J], 李景芬;采克俊;公翠萍;王曙;周志金2.黄颡鱼(♀)×瓦氏黄颡鱼(♂)双亲及其杂交子代核型和营养成分分析 [J], 张佳佳;张国松;张宏叶;王丹;朱文旭;尹绍武3.杂交黄颡鱼、雄性瓦氏黄颡鱼和黄颡鱼的形体指数及肌肉营养组成比较分析 [J], 陈建明;黄爱霞;沈斌乾;周志金;胡大雁;姜建湖;孙丽慧4.壳寡糖对杂交黄颡鱼"黄优1号"(黄颡鱼♀×瓦氏黄颡鱼♂)生长性能与免疫机能的影响 [J], 李明波;沈凡;崔庆奎;齐飘飘;王银海;张海龙;丁运敏;沈志刚5.4个瓦氏黄颡鱼群体遗传多样性的微卫星分析 [J], 郑翔;徐杰杰;张佳佳;王涛;尹绍武因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)全基因组微卫星分布特征分析
基因组学与应用生物学，2020年，第39卷，第12期，第5488-5498页研究报告Research Report黄颖鱼/uM draco)全基因组微卫星分布特征分析徐杰杰郑翔李杰尹绍武#王涛‘南京师范大学海洋科学与工程学院，南京，210023* 共同通信作者，*****************;******************摘要本研宄利用N C B I上已公布的黄颡鱼全基因组测序结果，使用M ISA软件对黄颡鱼全基因组的微 卫星进行筛选并分析；结合M ISA文件和基因组g ff注释文件通过编写脚本定位微卫星在基因组的位置，并 对外显子区含有微卫星的基因进行G O注释和KEGG富集。
在黄颡鱼基因组713 8丨0 725 bp序列中，共筛选 出418 550个完整型的微卫星，其长度为12974 321 bp，占基因组序列总长度的1.8%,相对丰度为586个/Mb。
在1〜6不同碱基重复类型微卫星中，二碱基重复数目最多，共173 177个，占微卫星总数的41.38%。
然后依 次是单碱基(40.26%)、四碱基(9.37%)、三碱基(7.63%)、五碱基(1.15%)和六碱基(0.21%)。
基因组中重复数目最 多的丨〇种微卫星类别依次为T、A、A C、TG、GT、C A、TC、TA、A G和AT。
同时通过对基因组微卫星进行定位，16 381个微卫星定位在基因外显子上，并分布在3 853个基因上。
G O注释结果显示注释到分子功能的基因 数目最多,富集前10的条目主要与电压门控钠通道复合物、电压门控钠通道活性和蛋白去憐酸化有关。
KEGG 富集分析显示共富集到21个通路，其中Hippo信号通路最为显著。
研究结果为今后黄颡鱼微卫星标记的开 发以及微卫星的定位功能等提供了一定的理论基础。
关键词黄颡鱼，基因组，微卫星，特征分析Distribution Characteristics of Whole Genome Micro s ate l lite of Pelteoba-grus fulvidracoXu Jiejie Zheng Xiang Li Jie Yin Shaowu*Wang Tao*College of Marine Science and Engineering, Nanjing Normal University, Nanjing, 210023*Co-correspondingauthors,*****************;******************DOI: 10.13417/j.gab.039.005488Abstract The study used the published genome-wide sequencing results of the P elteobagrus fu lv id r a c o on NCBI to screen and analyze the microsatellites of the whole genome using MISA software.The MISA file and the genomic gff annotation file were combined to map the position of the microsatellites in the genome,and the gene containing the microsatellites in the exon region was subjected to GO annotation and KEGG enrichment.In the713 810 725 bp long sequence of the P elteo b a g ru s fu lv id r a c o genome,418 550 perfect microsatellites were screened with a length of 12 974 321 bp,accounting for1.8% of the total length of the genome sequence,and the relative abundance is586 per Mb.Among the 1to6 different base repeat types of microsatellites,the number of two base repeats was the highest, reaching a total of173 177, accounting for41.38% of the total microsatellites.Then,it is followed by single base (40.26%), four bases(9.37%), three bases(7.63%), five bases(1.15%), and six bases(0.21%). T,A,AC,TG,GT,CA, TC,TA,AG and AT were the 10 microsatellite categories with the largest number of repeats in the genome.At the same time,by locating the genomic microsatellites, 16 381 microsatellites were localized on the gene exons and基金项目：本研究由江苏省重点研发计划(现代农业)重点项目(BE2017377)、江苏省农业重大新品种创制项目(PZCZ201742)和江苏省研究生科研与实践创新计划项目(SJCX18_0364)共同资助引用格式：Xu J.J., Zheng X.，Li J” Yin S_W., and Wang T., 2020，Distribution characteristics of whole genome microsatellite of Pe/- Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology), 39(12): 5488-5498 (徐杰杰，郑翔，李杰, 尹绍武,王涛，2020,黄颡鱼全基因组微卫星分布特征分析，基因组学与应用生物学，39(12): 5488-5498)黄颖鱼(Pp/feoAngnti/H/W rfraco)全基因组微卫星分布特征分析5489distributed on 3 853 genes.The GO annotation results showed that the number of genes annotated to molecular function was the highest,and the top 10 entries were mainly related to voltage-gated sodium channel complexes, voltage-gated sodium channel activity,and protein dephosphorylation.KEGG enrichment analysis showed a total of 21 pathways,of w hich Hippo signaling pathway was the most significant.The research results provide a theoretical basis for the development of microsatellite markers and the positioning function of microsatellites in the future. Keywords Pelteobagriis fulvidraco,Genome,Microsatellite,Characteristics微卫星(Microsatellite)又称为简单重复序列(Simple sequence repeats)，一般由1~6个碱基串联重复而 成(Li et al.，2010)，广泛分布于真核生物和原核生物 的基因组中(Tautz and Renz，丨984)。
利用微卫星标记分析东平湖黄颡鱼的遗传多样性
利用微卫星标记分析东平湖黄颡鱼的遗传多样性马洪雨;姜运良;郭金峰;岳永生【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2006(15)2【摘要】采用27对鲤微卫星引物对山东东平湖黄颡鱼进行全基因组扫描,结果有19对引物能获得稳定的扩增条带,其中有6个微卫星位点具有多态性.对这6个位点的扩增产物进行分析,结果显示:6个位点共检测到22个等位基因,每个位点的等位基因数从2个到6个不等;平均基因纯合率为41.67%,平均多态信息含量(PIC)为0.488,平均杂合度为0.5833.这表明东平湖黄颡鱼种群结构合理,群体遗传多样性较丰富,种质资源处于安全状态.【总页数】4页(P136-139)【作者】马洪雨;姜运良;郭金峰;岳永生【作者单位】山东农业大学动物分子遗传育种实验室,山东,泰安,271018;山东农业大学动物分子遗传育种实验室,山东,泰安,271018;山东农业大学动物分子遗传育种实验室,山东,泰安,271018;山东农业大学动物分子遗传育种实验室,山东,泰安,271018【正文语种】中文【中图分类】Q3-3;Q311【相关文献】1.应用微卫星标记分析4个黄颡鱼群体的遗传多样性 [J], 王婷婷;宋学宏;许爱国;张磊磊;孟祥雨;张红英2.利用微卫星标记分析军曹鱼养殖群体的遗传多样性 [J], 李伟强; 汤保贵; 陈刚; 马骞; 黄建盛; 施钢; 潘传豪; 周晖; 谢瑞涛; 张健东3.利用微卫星分子标记分析渤海湾的口虾蛄遗传多样性 [J], 谷德贤;王婷;许玉甫;吴宁;王娜;郝郁;王刚;李文雯;刘国山4.三个黄颡鱼群体遗传多样性及亲缘关系的微卫星标记分析 [J], 郭金峰;王玉;马洪雨;岳永生5.利用微卫星标记分析兰坪长毛山羊遗传多样性 [J], 朱兰;孙利民;袁跃云;洪琼花;马兴跃因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
应用微卫星标记分析4个黄颡鱼群体的遗传多样性
应用微卫星标记分析4个黄颡鱼群体的遗传多样性王婷婷;宋学宏;许爱国;张磊磊;孟祥雨;张红英【摘要】@@%利用微卫星标记技术对湖州(HZ)、澄湖(CH)、太湖(TH)和四川(SC)4个黄颡鱼群体的遗传多样性及其亲缘关系进行研究.通过筛选12对引物,获得7对有效引物,在4个群体中共检测到22个等位基因,平均等位基因数约为3.14个.统计结果显示:(1)4个黄颡鱼群体的多态性指标处于中等水平,HZ、CH、TH和SC 的平均多态性信息含量PIC分别为0.425、0.369、0.433、0.406.(2)群体间遗传分化不明显,各基因座遗传分化系数(Fst)均值为0.04,基因流(Nm)的均值为7.847;(3)4个群体的亲缘关系较近,其中HZ和TH两个群体的遗传相似系数最高(0.985),CH和SC群体的遗传相似系数最低(0.930).【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2012(040)004【总页数】5页(P41-45)【关键词】黄颡鱼;遗传多样性;微卫星【作者】王婷婷;宋学宏;许爱国;张磊磊;孟祥雨;张红英【作者单位】苏州大学医学部基础医学与生物科学学院,江苏苏州 215123;苏州大学医学部基础医学与生物科学学院,江苏苏州 215123;苏州市水产养殖场有限公司,江苏苏州 215127;苏州大学医学部基础医学与生物科学学院,江苏苏州 215123;苏州大学医学部基础医学与生物科学学院,江苏苏州 215123;苏州市水产养殖场有限公司,江苏苏州 215127【正文语种】中文【中图分类】Q953黄颡鱼(Pseudobagrus fulvidraco)属鲇形目鲿科黄颡鱼属，俗称嘎牙、黄姑子，是我国常见的一种中小型经济鱼类，广泛分布于长江、黄河、珠江及黑龙江各水域，具有肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富、无肌间刺等特点，受到广大消费者的青睐[1]。
遗传多样性是动物遗传育种研究的基础，通过评估各群体间的遗传多样性，可以了解物种的遗传结构，分析其进化历史和潜力，以寻找更好的育种方法[2]。
应用微卫星标记分析4个黄颡鱼群体的遗传多样性
中图分 类号：Ｑ ５ ９３ 文献标志码 ： Ａ 文章编号 ：０ ２—１０ （ ０２ ０ —０４ — ４ １０ ３２ ２ １ ） ４ ０ １ ０
黄颡 鱼 （ ｓｕｏａ ｒｓ ｕ ｉ ａｏ 属 鲇形 目鳞 科 黄颡 鱼 Ｐ ｅｄ ｂｇｕ ｆ ｌｄ ｃ ） ｖｒ 属， 俗称嘎牙、 黄姑子 ， 是我 国常见的一种 中小型经济鱼类 ， 广
ＴＫ Ｒ Ａ Ａ Ａ公 司的 Ｐ ＲＴ ｅｍ ｌ ｙｌｒ ｉ ， Ｃ ｈｒ ａ Ｃ ｃ ｃ 上海天能科技 ｅＤ ｅ
有限公 司 的 Ｔ ｎｎ２０ ａｏ ５ ０凝胶 成像 系统 ， 国 Ｈ ｒ ｕ 公 司 的 德 ｅａ ｓ ｅ
Ｐｍ ｉ ｒ ｏＲ高速 冷冻离心 机。ＴｑＤ Ａ酶 、Ｎ Ｐ Ｄ Ａ Ｍａ ｅ、 ａ Ｎ ｄＴ 、Ｎ ｒ ｒ ｋ
黄颡鱼新品种——黄优1号
新饥良和/2021.03黄桑页鱼新品种----黄优［号黄优1号是以长江流域湖泊中的黄颗鱼为母本、瓦氏黄颗鱼为父本杂交选育的生长速度快、生长性能稳定的黄颖鱼新品种。
1.外形特征。
该品种与普通黄颗鱼外形相似，头部扁平，嘴巴呈稍大的扁圆形，嘴稍尖；须更长，尾端稍长；背肉及尾肉较厚；体色为绿黄色、有斑带纹。
2.品种优点。
（1）生长快、产量高。
该品种摄食旺盛，生长优势明显，4个月左右大的鱼苗重可达50克以上，6 个月大的鱼苗重可达150克左右，亩产量1000-2000公斤。
（2）抗病力强、成活率高。
该品种免疫球蛋白含量高，红头、裂头发病率低，苗种存活率可达80%~90%。
（3）体形优美。
该品种的体形、色泽与普通黄颗鱼相似，与父本瓦氏黄颗鱼相比.品质更受市场欢迎。
（4）饲料利用率高，生长规格整齐。
该品种终生不育，避免了生殖腺生长的营养消耗，因而提高了生长速度。
（5）抗逆性强，耐运输、耐暂养、耐低氧。
该品种在运输过程中存活率高，放置几天后体色依旧鲜艳，销售时比较好暂养，只要不缺氧且水温适宜，比普通黄颖鱼可多存活1~2天。
（6）苗种可均衡供给市场。
在主要生长季节4T月，都可供应水花，全年可供大规格苗种。
（7）易捕捞。
清塘抓捕普通黄颖鱼需要耗费很多劳动力，而黄优1号只需拉网捕捞即可。
（8）养殖经济效益好。
该品种养殖成本较低，市场销售价格又比普通黄颗鱼约:更:豆新品种之51618 II之虹618于2019年通过了浙江省农作1物品种认定委员会认定。
;该品种中熟，植株蔓生，生长势中I等，不易早衰。
单株平均分枝数1.6个，；节间长22.8厘米。
叶片中等大小、深绿'色，花紫色。
主侧蔓均可结荚，平均单1株结荚14.4条，单荚种子数17.4粒。
嫩j荚油绿色，荚条顺直，粗细均匀，鼠尾I少，平均荚长63.7厘米，单荚重26.6克，'商品性佳。
嫩荚肉厚、粗纤维含量低，I口感糯、微甜，可溶性糖含量为24毫克/ 1克。
种子肾形，百粒重16.3克。
黄颡鱼论文：黄颡鱼 ISSR TRAP 遗传结构 性别特异性标记
黄颡鱼论文：黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）群体遗传结构分析及性别特异性分子标记的筛选【中文摘要】黄颡鱼是我国常见的中小型经济鱼类,其肉质细嫩,味道鲜美,营养价值高,备受广大消费者青睐。
黄颡鱼的生长呈现显著的性别差异性,雄性黄颡鱼比雌性黄颡鱼生长速度快,体型大。
鉴于此,我国的水产养殖业正大力开展黄颡鱼的单性育种养殖研究。
本文采用ISSR和TRAP标记技术对黄颡鱼群体遗传结构和遗传多样性进行研究,为黄颡鱼种质资源保护及管理提供相关的遗传背景资料和理论依据。
同时,应用ISSR和TRAP标记技术筛选与黄颡鱼性别决定相关的分子标记,为加强黄颡鱼单性育种的选择性定位,提高人工养殖的可预见性提供科学依据。
本研究的主要工作和结论如下所述：1.黄颡鱼群体遗传结构的ISSR分析。
应用ISSR标记技术对黄颡鱼2个野生群体(松花江群体,SH；黑龙江群体,HL)和2个养殖群体(肇东群体,ZD)辽阳群体,LY)的遗传多样性进行了分析,结果表明黄颡鱼4个群体遗传多样性水平较高,其中以SH最高,HL和ZD次之,LY最低,野生群体的遗传多样性水平高于养殖群体。
遗传变异分析结果揭示黄颡鱼4个群体存在一定的分化,其中野生群体和养殖群体分化明显。
2.黄颡鱼群体遗传结构的TRAP分析。
应用TRAP标记技术对黄颡鱼野生群体...【英文摘要】Yellow Catfish (Pelteobagrus fulvidraco) is a common medium commercial fish with fresh tender meat, delicious taste and high nutritional value, thereby being popular witha host of consumers.The growth of Yellow Catfish present significant gender specificity, of which the male grow faster and larger than the female.As a result,Aquaculture Industry of China is making great efforts to carry out single-sex breeding of Yellow Catfish.In this paper, ISSR and TRAP markers are applied to detect genetic structure a...【关键词】黄颡鱼 ISSR TRAP 遗传结构性别特异性标记【英文关键词】Yellow Catfish (Pelteobagrus fulvidraco) ISSR TRAP genetic structure gender-specific markers【目录】黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）群体遗传结构分析及性别特异性分子标记的筛选摘要4-5Abstract5-6 1 绪论10-22 1.1 分子标记技术在鱼类群体遗传多样性研究中的应用10-17 1.1.1 限制性片断长度多态性标记(RFLP)10-11 1.1.2 随机扩展片段长度多态性(RAPD)11-12 1.1.3 扩增片段长度多态标记(AFLP)12-13 1.1.4 单核苷酸多态性(SNP)13 1.1.5简单相关序列扩增多态性(SRAP)13-14 1.1.6 简单序列重复(SSR)14-15 1.1.7 重复序列区间扩增(ISSR)15-16 1.1.8 靶位区域扩增多态性(TRAP)16-17 1.2 鱼类性别相关基因及性别特异标记的研究进展17-21 1.2.1 鱼类性别决定基因及相关基因的研究概况17-19 1.2.2 鱼类性别相关分子标记的研究概况19-21 1.3 本研究目的及意义21-22 2 黄颡鱼ISSR-PCR体系的建立及优化22-28 2.1 材料与方法22-23 2.1.1 实验材料22 2.1.2 黄颡鱼基因组DNA的提取及定量22-23 2.2 黄颡鱼ISSR-PCR反应体系的正交优化23-24 2.2.1 ISSR-PCR反应因素水平的确定与正交表的设计23 2.2.2 ISSR-PCR的电泳检测23-24 2.3 结果与分析24-26 2.3.1 黄颡鱼ISSR-PCR正交实验结果24 2.3.2 各因素对ISSR-PCR反应影响24-25 2.3.3 ISSR-PCR退火温度的选择25 2.3.4 交优化体系的验证25-26 2.4 讨论26-28 3 黄颡鱼群体遗传结构的ISSR分析28-35 3.1 材料与方法28-29 3.1.1 实验材料28 3.1.2 黄颡鱼基因组DNA的ISSR-PCR扩增28 3.1.3 ISSR数据处理28-29 3.2 结果与分析29-32 3.2.1 ISSR-PCR扩增结果29-30 3.2.2 黄颡鱼群体的遗传多样性参数30-31 3.2.3 黄颡鱼群体的遗传分化指数和基因流指数31 3.2.4 黄颡鱼群体的遗传相似系数与遗传距离31-32 3.2.5 聚类分析32 3.3 讨论32-35 4 黄颡鱼TRAP-PCR反应体系的建立及优化35-39 4.1 材料与方法35 4.2 黄颡鱼TRAP-PCR反应体系的正交优化35-36 4.2.1 TRAP-PCR反应因素水平的确定与正交表的设计35 4.2.2 TRAP-PCR扩增及检测35-36 4.3 结果与分析36-37 4.3.1 黄颡鱼TRAP-PCR正交实验结果36 4.3.2 各因素对TRAP-PCR反应的影响36-37 4.4 讨论37-39 5 黄颡鱼群体遗传结构的TRAP分析39-45 5.1 材料与方法39-40 5.1.1 实验材料39 5.1.2 黄颡鱼基因组DNA的TRAP-PCR扩增39 5.1.3 TRAP数据分析39-40 5.2 结果与分析40-41 5.3 讨论41-45 5.3.1 黄颡鱼群体的遗传多样性41 5.3.2 黄颡鱼群体的遗传分化41 5.3.3 黄颡鱼群体遗传结构的ISSR和TRAP比较分析41-45 6 黄颡鱼性别特异TRAP和ISSR分子标记筛选45-51前言45 6.1 材料与方法45-46 6.1.1 实验材料45 6.1.2 实验方法45-46 6.2 结果与分析46-49 6.2.1 黄颡鱼雌雄个体遗传差异的TRAP分析46-47 6.2.2 黄颡鱼性别特异TRAP标记的筛选47-48 6.2.3 黄颡鱼雌雄个体遗传差异的ISSR分析48-49 6.2.4 黄颡鱼性别特异ISSR标记的筛选49 6.3 讨论49-51结论51-52参考文献52-60攻读学位期间发表的学术论文60-61致谢61-62。
黄颡鱼属两种鱼类的线粒体ND4基因序列变异性分析_丁言伟
收稿日期:2005-08-06;修订日期:2006-01-20基金项目:中国科学院创新方向性项目(编号:KSCX2-SW -101B);国家重点基础研究计划项目资助(编号:G2000046804)作者简介:丁言伟(1978 ),女,山东日照人;硕士研究生,从事鱼类分子系统生物地理学方面的研究。
刘焕章老师提供部分标本,唐琼英博士在论文写作过程中给予指导和帮助,谨致谢意通讯作者:何舜平,E-mail:clad@ 黄颡鱼属两种鱼类的线粒体ND4基因序列变异性分析丁言伟1,2彭作刚1 张训蒲2 何舜平1(1.中国科学院水生生物研究所,武汉 430072; 2.华中农业大学水产学院,武汉 430070)摘 要 以东亚特有种光泽黄颡鱼(Pe lteoba grus nitidus )和长须黄颡鱼(Pelteobagrus eupogon)为研究对象,采用PCR 技术获得了这两种鱼类的部分线粒体DNA DN4基因及其3 端的tRNA 基因碱基共约772个,用MEGA2.1软件分析了此片段序列,采用Kimura 双参数模型计算遗传距离,以科属的大鳍(Hemibagrus macropterus )为外类群,用邻接法构建不同水系的光泽黄颡鱼和长须黄颡鱼的分子系统树。
不同水系的光泽黄颡鱼的遗传距离在0.000 0.012之间,长须黄颡鱼的遗传距离在0.000 0.003之间,光泽黄颡鱼和长须黄颡鱼种间的遗传距离在0.099 0.108之间,从分子水平上证实了光泽黄颡鱼和长须黄颡鱼为两个有效物种。
不同水系的光泽黄颡鱼遗传变异很小,除黑龙江种群外,其他水系的光泽黄颡鱼在分子系统树没有能够按水系区分开来,可能的原因为:(1)不同水系的光泽黄颡鱼之间存在频繁的基因交流;(2)东亚科鱼类的线粒体DNA 的进化速率可能较小;(3)人类经济活动可能已影响到光泽黄颡鱼的种群遗传结构。
关键词:科;黄颡鱼属;线粒体DNA ND4基因;遗传分化中图分类号:Q959.4 文献标识码:A 文章编号:1000-3207(2006)04-0413-07黄颡鱼属(Pelteobagrus )隶属于鲇形目(Silur-i formes)科(Bagridae),是东亚特有科鱼类,主要栖息于江河、湖泊的中下层,白天极少活动,夜晚外出觅食,以水生昆虫、小鱼和小虾为食。
四大家鱼微卫星标记的筛选及其在物种鉴定中的应用
• 在 5、8月份所占的比例最大分别 11.81% 和22.8%，9月份次之,6、7月 份比较少；在总量上，草鱼最多，青 鱼最少，鉴定结果与形态鉴定基本一 致，说明采用微卫星标记进行种类鉴 定是可行的。
青鱼、草鱼、鲢鱼和鳙鱼原是我国 特有的鱼类，最早作为驯养种类故有 “四大家鱼”之称。四大家鱼在我国 具有分布广、生长快、食性广、抗病 力强、肉味鲜、易养殖等特点，是我 国淡水养殖和捕捞的主要对象。近年 来，由于水利工程建设、环境污染、 过度捕捞等诸多因素，使四大家鱼的 天然产量急剧下降，四大家鱼的资源 状况直接影响着我国淡水渔业的持续 发。为此，有必要对四大家鱼的早期 资源展开调查。
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结论与讨论 四大家鱼特异性微卫星位点的获取 微卫星标记的筛选和开发是利用微卫星标记鉴定 物种中最关键的一步 本 研 究 从 经 济 省 时高 效 的 目 的 出 发 从已发表的文献和数据库中查找微卫星标记其中 从 文 献 中 共 获 得 个 微 卫 星 位 点 其 中 个 位点和可用于四大家 鱼 的 种 类 鉴 定 说明从文献中获取微卫星标记是可行 的但 是 获 取 效 率 较 低 可能与这些标记用于四大家鱼 遗传多样性的研究有关多 态 性 较 高 不 利 于 单 态 性 标 记 的 筛 选 是近年来开发微卫星标记的首选数据 库 研 究 表 明 中含有较为丰富的微卫星序列 约 有个别物种甚至达到 以 上 本 文 从 和中获得个微卫星标记共筛选出四 大 家 鱼 的 个 微 卫 星 鉴 定 位 点 筛选效率较从文献中 获 取 较 高 认为重复次数多的微卫星既能在 种间又能在种内产生多态性但 重 复 次 数 少 的 微 卫 星 仅 能在种间产生多态性 可能与本文所筛选的标记中重复 次数较少有关
一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记、筛选方法及应用[发明专利]
![一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记、筛选方法及应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/b9dd3ee951e2524de518964bcf84b9d528ea2ca6.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010433162.X(22)申请日 2020.05.21(71)申请人 华中农业大学地址 430000 湖北省武汉市洪山区狮子山街1号(72)发明人 梅洁 熊阳 郑小珍 皇培培 郭稳杰 王帅 王宇宏 (74)专利代理机构 北京金智普华知识产权代理有限公司 11401代理人 杨采良(51)Int.Cl.C12Q 1/6888(2018.01)C12N 15/11(2006.01)(54)发明名称一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记、筛选方法及应用(57)摘要本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记、筛选方法及应用。
本发明基于黄颡鱼基因组信息和混池测序技术分析CypA基因，得到潜在SNP位点，并设计引物扩增验证。
将潜在的SNP位点与黄颡鱼红头病进行关联分析发现其中一个SNP具有显著性差异，该SNP位于CypA基因组序列的第528个核苷酸上存在一个等位基因突变(T/C)。
该SNP 528T/C在另一个养殖群体的黄颡鱼也存在显著性差异。
此外，构建表达黄颡鱼CypA的转基因斑马鱼品系，通过攻毒实验证明了转基因的斑马鱼对鮰爱德华氏菌更具有抗性，进一步说明了黄颡鱼CypA基因的SNP位点与抗黄颡鱼“红头病”的关联的真实有效性。
权利要求书1页 说明书10页序列表2页 附图3页CN 111662987 A 2020.09.15C N 111662987A1.一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记，所述SNP标记为黄颡鱼CypA基因组序列的第528个核苷酸T或C。
2.如权利要求1所述的一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记在黄颡鱼选育中的应用。
3.如权利要求1所述的一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记在制备用于检测或治疗黄颡鱼红头病的试剂或试剂盒中的应用。
4.CypA基因在黄颡鱼选育中的应用。
一种与杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状相关的SNP分子标记及其应
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010036854.0(22)申请日 2020.01.14(71)申请人 南京师范大学地址 210046 江苏省南京市栖霞区文苑路1号(72)发明人 尹绍武 王宏玉 王涛 张凯 暨杰 武兆文 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204代理人 郑立发(51)Int.Cl.C12Q 1/6888(2018.01)C12N 15/11(2006.01)(54)发明名称一种与杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状相关的SNP分子标记及其应用(57)摘要本发明公开了一种与杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状相关的SNP分子标记及其应用，所述SNP分子标记是以von Hippel -Lindau diseasetumor suppressor(Vhl基因)的cDNA序列为模板设计引物，扩增得出的基因组序列如SEQ ID NO:1所示，本发明还公开了检测该分子标记的引物对、试剂盒和检测方法。
该SNP位点与低氧胁迫下杂交黄颡鱼“黄优1号”的存活率显著相关，该位点基因型为TT的个体耐低氧能力显著强于基因型为AA的个体。
本发明公开的SNP位点可以不受杂交黄颡鱼“黄优1号”的年龄和性别等限制，适用于杂交黄颡鱼“黄优1号”的耐低氧苗种筛选和分类，可有效提高杂交黄颡鱼“黄优1号”养殖和运输中低氧条件下的存活率。
该方法准确可靠，操作简便。
权利要求书1页 说明书8页序列表2页 附图2页CN 111187843 A 2020.05.22C N 111187843A1.一种与杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP 分子标记的序列如SEQ ID NO:1所示，所述SNP分子标记位于所述SEQ ID NO：1所示序列的第495位，碱基为T或A。
2.根据权利要求1所述的与杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状相关的SNP分子标记，其特征在于，SNP位点的TT基因型个体耐低氧能力显著高于AA基因型个体。
黄颡鱼属SSR分子鉴定及其遗传多样性
黄颡鱼属SSR分子鉴定及其遗传多样性赵哲霞;蒋珊;王滨花;舒汉鼎;龚瑞玥;毛慧玲【摘要】In this paper,we used 1 3 pairs of SSR primers to detect the genetic diversity and classification of Pelteobagrus.Our results indicated that 1 0 over 1 3 SSR primers exhibited sufficient availability and yielded overall 93 polymorphic bands.In detail,range of numbers of bands per primer couple was 8 to 11,and DNA sizes varied between 90 to 400 bp.As a result,polymorphic bands from SSR could be successfully used in Pelteobagrus classification.The genetic similarity among 5 species strains was from 0.670 to 1.000.The results of cluster analysis further suggested that P.vachelli,P.eupogon and P.intermedius grouped to-gether,then clustered with P.Nitidus;whereas P.fulvidraco clustered in another clade separately.Our re-sults displayed that the genetic diversity was rich among 5 species of Pelteobagrus.This would help us fur-ther investigate the relationship among different species and systematic evolution of Pelteobagrus compre-hensively.%利用13对 SSR引物对黄颡鱼属进行遗传多样性和分类研究。
大黄鱼微卫星标记的富集与筛选
大黄鱼微卫星标记的富集与筛选郝君;孙效文;梁利群;鲁翠云【期刊名称】《中国水产科学》【年(卷),期】2006(13)5【摘要】根据生物素与链霉亲和素的亲和原理,采用生物素-磁珠富集微卫星,与传统放射性同位素杂交法相结合,构建筛选大黄鱼的微卫星文库.用生物素-微卫星捕捉单链限制性酶切片段(含有接头和大黄鱼微卫星序列),经PCR扩增单链目的片段形成双链,然后连接至T载体上,转化感受态细胞.将移至硝酸纤维素膜的重组菌用32P 标记的放射性同位素探针5'[γ-32p]ATP(CA)15筛选出阳性克隆菌.测序结果发现,阳性克隆率为71.9%,105个微卫星位点.其中选取设计合成30对并筛选出22对可用引物.说明所建大黄鱼微卫星文库是一个高质量的文库,可为大黄鱼基因组结构分析、大黄鱼精密微卫星连锁图谱构建、分子进化和系统发育研究、分子标记辅助育种以及经济性状的QTL定位提供大量的微卫星标记.【总页数】5页(P762-766)【作者】郝君;孙效文;梁利群;鲁翠云【作者单位】中国水产科学研究院,黑龙江水产研究所,农业部北方鱼类基因工程育种试验室,黑龙江,哈尔滨,150070;大连水产学院生命科学与技术学院,辽宁,大连,116023;中国水产科学研究院,黑龙江水产研究所,农业部北方鱼类基因工程育种试验室,黑龙江,哈尔滨,150070;大连水产学院生命科学与技术学院,辽宁,大连,116023;中国水产科学研究院,黑龙江水产研究所,农业部北方鱼类基因工程育种试验室,黑龙江,哈尔滨,150070;中国水产科学研究院,黑龙江水产研究所,农业部北方鱼类基因工程育种试验室,黑龙江,哈尔滨,150070【正文语种】中文【中图分类】Q959.483【相关文献】1.大黄鱼群体遗传多样性分析及耐低温性状相关微卫星标记的筛选 [J], 王惠儒;柳敏海;油九菊;罗海忠;许益铵;傅荣兵2.藏酋猴微卫星富集文库的构建及微卫星分子标记的筛选 [J], 贾小东;张修月;王红星;王中凯;尹湧华;岳碧松3.岩原鲤微卫星富集文库的构建及微卫星分子标记的筛选 [J], 袁慧;张修月;宋昭彬;岳碧松4.大黄鱼快长相关微卫星标记的筛选与验证 [J], 刘贤德;隋班良;王志勇;蔡明夷5.微卫星技术筛选大黄鱼耐低温标记 [J], 穆方申;苗亮;李明云;胡谋;陈炯;张浩因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大黄鱼EST微卫星标记初步筛选
大黄鱼EST微卫星标记初步筛选谢芳靖;张子平;邹志华;周鹏;王艺磊【期刊名称】《福建水产》【年(卷),期】2011(033)005【摘要】通过构建大黄鱼性腺线性化cDNA文库，并经测序后获得3535条EST，对其二碱基至六碱基重复序列进行筛选，共发现微卫星位点150个，占EST序列的4．24％；其中包括二碱基重复序列64条，三碱基重复序列80条，四碱基重复序列5条，五碱基重复序列1条；三碱基重复序列是最丰富的重复单元，占53．3％。
在这些微卫星序列中，（TG／GT／AC／CA）n形式在二碱基重复中最为常见，（GAG／AGG／GGA／CCT）n形式在三碱基重复序列中最为常见，分别占微卫星序列总数的26％和14％。
选取其中的62条微卫星序列进行引物设计、合成与多态性检测，经过PCR扩增，2．0％的琼脂糖凝胶电泳检测，获得呈多态性微卫星引物8对，多态率为12．9％。
本研究为开发大黄鱼EST微卫星分子标记和大黄鱼基因编码区微卫星的功能研究提供有价值的信息。
%A normalized gonad cDNA library of Larimichthys crocea was constructed, from which 3535 EST were obtained by sequencing clones. The frequency and density of 2 -6 bp SSR were analyzed from these ESTs. Amount of 150 SSR （4.24%） were obtained, among which there were 64 dinucleotide,80 trinucleotide, 5 tetranucleotide and 1 pentanucleotide sequences. The trinucleotide repeats motifs were the most abundant motif in these SSR （53.3%）. Among the dinucleotide and trinucleotide sequences（TG/GT/AC/CA） n and （GAG/AGG/GGA/CCT） n repeats were thedominant motifs, which accounted for 26% and 14%, respectively. 62 pairs of primers were designed from EST sequences containing SSR. And 8 of them showed polymor- phic PCR products by electrophoresis on 2. 0% agarose gel. Polymorphism rate was 12. 9%. The results will contribute to the development of EST - SSR marker and the research of genes which contain SSR in coding regions.【总页数】6页(P9-14)【作者】谢芳靖;张子平;邹志华;周鹏;王艺磊【作者单位】集美大学水产学院,福建省水产科学技术与食品安全重点实验室,厦门361021;美国西东大学生物系,新泽西州,美国07079;集美大学水产学院,福建省水产科学技术与食品安全重点实验室,厦门361021;集美大学水产学院,福建省水产科学技术与食品安全重点实验室,厦门361021;集美大学水产学院,福建省水产科学技术与食品安全重点实验室,厦门361021【正文语种】中文【中图分类】S511【相关文献】1.大黄鱼群体遗传多样性分析及耐低温性状相关微卫星标记的筛选 [J], 王惠儒;柳敏海;油九菊;罗海忠;许益铵;傅荣兵2.鮸鱼EST序列中微卫星标记的初步筛选及特征分析 [J], 孙典巧;孙悦娜;王日昕;徐田军3.微卫星技术筛选大黄鱼耐低温标记 [J], 穆方申;苗亮;李明云;胡谋;陈炯;张浩4.从棉花ESTs数据库中筛选微卫星标记的初步研究 [J], 李华盛;范术丽;沈法富5.凡纳滨对虾EST微卫星标记初步筛选 [J], 王艳红;胡超群;张吕平;夏建军;任春华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2008,16(4):604~609*基金项目:国家自然科学基金项目(No.30571414)、 湖南省自然科学基金项目(No.06JJ20056)和湖南省教育厅重点项目(No.08A0/2)资助。
**通讯作者。
Author for correspondence.博士， 教授， 主要从事生物技术与鱼类遗传育种和营养与生物技术研究。
Email :<lshqlzh@>. 收稿日期：20070925 接受日期： 20071016 ·研究论文· 黄颡鱼微卫星标记筛选及特征分析 *刘 臻 1 ,鲁双庆 1 **,张建社 1 ,刘红玉 2 ,张林达 2 ,谢帝芝 1（1.长沙大学生物工程与环境科学系， 长沙 410003； 2.湖南大学环境科学与工程系， 长沙 410082）摘要：通过磁珠富集法首次筛选黄颡鱼微卫星标记并对其特征进行分析。
用生物素标记的寡核苷酸探针 (AC)8 、(CT)8、 (AT) 7 、 (GATA) 8 和(GATT) 7 进行微卫星片段的富集，挑选部分阳性克隆测序获得 38个含有微卫星的 DNA 序列 （GenBank 登录 号： EF473162~EF473200）， 设计并合成了22对微卫星引物。
以普通黄颡鱼 （ ） 基因组DNA 为模板，进行 PCR 扩增， 结果筛选出 18 个多态性微卫星标记， 每对引物等位基因数 2~8 个 （平均 3.78）， 遗传杂合度 0.2225~0.8101 （平均0.5755）， 多态信息含量 0.3425~0.7900 （平均 0.5336）。
此外18对多态性微卫星引物中有 16对在黄颡鱼属其它4种鱼类具有通 用性， 13对在鲇形目 （Siluriformes ） 中的3种鱼类具有通用性。
因此， 可以推断筛选的多态性微卫星标记可用于黄颡鱼属和鲇形 目鱼类的遗传分析。
关键词： 黄颡鱼； 微卫星标记； 筛选及特征 中图分类号: S188 文献标识码:A文章编号: 10061304(2008)04060406Isolation and Characterization of Microsatellites inLIU Zhen 1 ,LU Shuangqing 1 **,ZHANG Jianshe 1 , LIU Hongyu 2 ,ZHANG Linda 2 ,XIE Dizhi1Isolation and characterization of microsatellites from were carried out using an enrichmentprotocol.The sizefractionated genomic library was screened with (AC) 8 ,(CT) 8 ,(AT) 7 ,(GATA) 8 and (GATT) 7 oligonucleotide probes, respectively.A total of 38clones （GenBank No.EF473162~EF473200）were identified and 22primer pairs with microsatellite repeats were designed.Of the 22primer pairs,18amplified polymorphic loci in.Among the polymorphic loci,the number ofalleles per locus varied from 2to 8 （average 3.78） ,the observed heterozygosities ranged from 0.2225to 0.8101 （average 0.5755）and the polymorphism information content were from 0.3425to 0.7900 （average 0.5336） .These 18primer pairs were also used to investigate forand Siluriformes species.Sixteen of the 18primer pairs amplified the loci in thespecies, and 13pairs amplified the loci in the Siluriformes species.These results indicated that the microsatellites isolated in werehighly informative and could be useful for genetic analysis in theand the Siluriformes species.;microsatellites;isolation and characterization黄颡鱼()属鲇形目(Silu riformes)鳞科(Bagridae)， 是新兴淡水养殖对象。
有关 其生物学和养殖技术的研究较多，而遗传学分析方 面的研究并不多， 且主要集中在分子标记方面。
戴凤田和苏锦祥 （1998） 用同工酶分析了长须黄颡鱼和光 泽黄颡鱼的系统演化，得出长须黄颡鱼比光泽黄颡 鱼更为特化的结论 。
丁言伟等 （2006） 利用 mtDNA 技术为长须黄颡鱼和光泽黄颡鱼的分类寻求了分子生物学依据。
Peng . （2002） 也用 mtDNA 细胞色素 b 基因探讨了光泽黄颡鱼在东亚鳝科鱼类系统发 育关系中的位置。
此外，还有一些采用 RAPD 技术 对黄颡鱼的遗传多样性、遗传图谱和分子分类的研究 (宋 平等，2001；赵文学等， 2006；肖调义等， 2004)。
而在黄颡鱼微卫星标记研究中仅马洪雨等 （2006） 利用鲤微卫星标记对东平湖黄颡鱼进行了遗 传多样性的研究，应用微卫星技术分析黄颡鱼的遗第 4期 刘 臻等:黄颡鱼微卫星标记筛选及特征分析传特征， 获得微卫星位点是第一步， 迄今为止黄颡鱼 微卫星克隆的研究尚未见报道。
本研究采用磁珠富 集法克隆微卫星序列， 计算机软件 PRIMER5.0设计 微卫星引物， 经黄颡鱼属和鲇形目鱼类基因组 DNA 的微卫星 PCR扩增， 检测微卫星引物的多态性和通 用性。
1材料和方法1.1 材料实验鱼均采集于洞庭湖流域，磁珠为链霉亲和 素包被的磁珠 （NEB公司）。
生物素标记探针：（AC) 8 biotin， (CT)8 biotin，（AT)7 biotin，（GATA)8 biotin和 （GATT)7biotin。
玉人工接头序列：Oligo玉A： HO5'TACTCAGGACTCAT3'OH；Oligo玉B： HO5'GACGATGAGTCCTGAG3'OH；玉N混合组： 5'GATGAGTCCTGAGTAA(N)3'。
所用生物素标记探针、接头及引物均由上海生 工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2 微卫星基因组文库的构建与克隆筛选1.2.1基因组 DNA的酶切与连接 采用苯酚 氯 仿法 （刘 臻等， 2004） 从其血液中提取 DNA,调整 DNA浓度至 100ng/滋 L，取基因组 DNA1滋 g， 玉酶切 3.5h。
建立 15滋 L的连接反应体系（10滋 L 样品，接头连接缓冲液 1.5滋 L， 玉 A和 玉B接头的等比例混合物 2.5滋 L， 1滋 L T4DNA连接 酶）。
16 ℃反应 12h， 4 ℃保存。
连接完毕 Centrifu gal Devices离心柱离心去除多余接头，电泳检测直 至去除干净， 并将终总体积浓缩到 15滋 L左右。
1.2.2 PCR预扩增 利用 玉N引物 （ 玉N 混合组 5'GATGAGTCCTGAGTAA(N)3'）对 1/10倍稀释的连接混合液进行 PCR预扩增。
建立 15滋 L 的反应体系 （100ng模板 DNA,2.5滋 mol/L引物,1伊 buffer, 2.0mmol/L MgCl2 ,200滋 mol/L each dNTP和 1U DNA聚合酶）。
反应程序：95 ℃变 性 5min;94 ℃,30s,56 ℃,1min,72 ℃,1min， 26个循环;最后 72 ℃延伸 10min， 4 ℃保存。
1.2.3生物素探针杂交 建立 100滋 L杂交体系： 上述 95 ℃水浴解链 10min的 PCR预扩增产物 25滋 L， 55 ℃预热的杂交缓冲液（6伊 SSC， 0.1%SDS） 70滋 L和生物素标记探针 5滋 L（生物素标记探针： (AC) 8biotin， (CT)8 biotin，（AT)7 biotin，（GATA)8 biotin， （GATT) 7 biotin）。
PCR仪中 55 ℃反应 30min， 取出 后， 缓慢冷却至室温， 加入 300滋 L TEN100溶液混 匀， 4 ℃保存备用。
1.2.4磁珠富集 取 1～2mg的链霉亲和素磁珠，加入 200滋 L TEN100buffer仔细洗涤 3次，每次洗 涤都用磁架固定磁珠。
洗涤完毕后，用 40滋 L TEN100buffer重悬磁珠， 接着加入到生物素探针杂 交液中， 室温反应 30min， 待磁珠吸附完毕， 用磁架 固定磁珠，移去杂交混合液。
沉淀用 300滋 L TEN1000溶液室温下洗涤 3次， 将与磁珠非特异性 结合的 DNA片段洗脱。
然后用 300滋 L0.2伊 SSC, 0.1%SDS室温下洗涤磁珠 3次，再于 50 ℃下洗涤 10min， 最后使用 300滋 L0.2伊 SSC室温下洗涤磁珠 10min。
1.2.5洗脱和精制 加入 100滋 L TE(pH9.0)， 然后 于 95 ℃下水浴 10min， 用磁架固定磁珠后， 迅速吸 取上清， 按 1颐 2的比例加入 200滋 L冰冻乙醇， 再加 入 10滋 L5mol/L的醋酸钠助沉， 4 ℃， 13000r/min 离心 20min， 弃上清后， 用 70%酒精再清洗 2遍， 4 ℃， 13000r/min离心 20min， 小心的移去乙醇， 真空 干燥机中干燥 10min，加入 50滋 L无菌水溶解沉 淀。